형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

이 절차의 전반적인 목표는 형광 단백질을 기관지 장루 lancia latam 난모세포에 인코딩하는 mRNA를 도입하여 발달 중인 배아의 생체 내 형광 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 24시간의 온도 충격으로 잘 익은 암컷, 수컷과 암컷의 산란을 유도함으로써 달성됩니다. 온도 충격에 따라 암컷과 수컷은 각각의 산란 컵에 배치되어 각각 난모세포와 정자를 수집할 수 있습니다.

일단 cyte가 polylysine coated dish에 정렬되면, 특히 준비된 microinjection 바늘을 사용하여 cyte의 핵 내부에 용액을 주입합니다. 마지막 단계는 1-5방울의 정자로 세포를 수정하는 것입니다. 궁극적으로 두 개의 광자 레이저 스캐닝.

현미경 검사법은 마이크로 주입된 mRNA에서 생성된 형광 단백질의 유비쿼터스 발현을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 미세주입 단계가 자세히 설명하고 인쇄에서 다룰 수 없는 필수 기술력으로 인해 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 주사 중 세포를 고정시키는 데 사용되는 폴리리신 코팅 접시를 준비합니다.

각 35mm 세포 배양 페트리 접시에 대해 바닥을 폴리리신 용액으로 덮고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 폴리리신 용액을 다른 접시에 옮기고 다시 실온에서 5분 동안 배양합니다. 용액을 버리고 페트리 접시를 실온에서 2시간 동안 거꾸로 건조시킵니다.

건조되면 코팅된 접시를 플라스틱 랩에 싸서 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 주입된 배아를 배양하는 데 사용되는 아로스 코팅 접시를 준비하기 위해 인공 해수와 역삼투수를 만듭니다. 다음으로, 여과 된 1 % 농도로 aros를 용해시키고 한 페트리 접시의 따뜻한 aros 용액을 다른 페트리 접시에 신속하게 부어 접시의 매우 얇은 aros 코팅을 보장했습니다.

코팅된 접시를 사란 랩으로 싸서 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 보관합니다. 먼저 RNA와 DNA가 없는 물 페놀에 주입 혼합물을 준비합니다. 빨간색은 용액을 착색하고 성공적으로 주입된 배아를 식별할 수 있도록 합니다.

다음으로 혼합물을 원심 분리하여 결정을 펠릿으로 만들고 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 준비가 되면 10마이크로리터 피펫에 0.5마이크로리터의 주입 혼합물을 로드하고 결정이 펠릿화된 튜브의 바닥을 피합니다. 0.5마이크로리터의 주사액 방울을 피펫팅하여 주사 바늘을 다시 채웁니다.

바늘의 큰 구멍에 섞습니다. 주사 중 하나가 부러질 경우를 대비하여 두 개의 바늘을 준비하십시오. 주사제의 증발을 방지하기 위해 바닥에 물이 있는 항아리에 바늘을 보관하십시오.

섞어서 섭씨 4도에서 놓습니다. 거품 생성을 최소화하기 위해 주입 혼합물이 최소 1시간 동안 주입 바늘 끝으로 천천히 이동하도록 합니다. 난모세포와 정자 채취를 시작하기 위해, 수컷과 암컷은 24시간 동안 SW에서 충격을 받은 다음 산란 1-2시간 전에 개별 컵으로 옮겨집니다.

산란이 되면 즉시 정자와 세포를 수집하십시오. 수거 중 성인을 놀라게 하지 않도록 주의하세요. 추가적인 움직임은 소멸될 수 있으며, 따라서 채취 후 정자와 세포를 모두 희석시킬 수 있습니다.

1.5 밀리리터 튜브에 정자를 얼음 위에 보관하고 여과 된 SW의 세포를 미리 헹궈진 페트리 접시로 옮깁니다. 100-500개의 cyte를 다른 35mm 페트리 접시로 옮겨 주사를 수행합니다. 마지막으로, 세포 클러치의 나머지 부분을 정자 및 세포 품질 또는 다른 실험을 위한 대조군으로 수정시킵니다.

주입 절차를 시작하려면 25개의 안구가 있는 형광 해부 내시경 아래 수평면에 대해 50도 각도로 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 설치하고 30개의 cyte를 polylysine 코팅 접시로 옮기고 주입된 cyte를 추적하는 데 도움이 되도록 SW를 필터링합니다. 질서 정연한 방법으로 줄을 따라 놓으십시오. 노출을 최소화하기 위해 항상 작은 수를 주입하십시오.

발달 중인 배아를 변형시키는 경향이 있는 폴리리신에 대한 시간. 암시야 조명을 사용하여 세포를 가능한 한 반투명하게 렌더링합니다. 그런 다음 거친 이동 손잡이를 사용하여 미세한 집게로 주사 바늘을 세포에 가깝게 가져옵니다. 삭감.

인젝터로 펄스를 가하여 팁이 구부러지기 시작하는 높이에서 바늘을 엽니다. 200배 배율에서 바늘에서 빨간색 주입 혼합물이 흘러나오는지 확인합니다. 그리고 미세한 움직임 손잡이로 주사 바늘을 cyte의 중심부 안쪽으로 부드럽게 움직입니다.

표면적으로 두 개를 삽입하면 주입된 용액이 UO 부위 내부에 남아 있지 않습니다. 너무 많이 삽입하면 UO 사이트가 파괴됩니다. 1-3개의 펄스로 주입합니다.

바늘이 충분히 미세하면 일정한 압력으로 연속 흐름으로 주입합니다. 주입 부피가 주입 후 단일 난모세포 부피의 1/5에서 1/3에 해당하는지 확인합니다. 누출을 방지하기 위해 바늘을 신속하게 당겨 빼내십시오.

주입된 용액이 cyte 내에 남아 있고 몇 초 후에 주입된 용액이 cyte 전체에 퍼지는지 확인합니다. 다음 줄에 있는 cyte로 이동합니다. 주입된 배아를 스캔할 때 배경 형광을 추정하기 위해 각 시리즈의 일부 unin 주입된 배아를 음성 대조군으로 유지하고, 시리즈가 주입되자마자 난모세포를 수정시킵니다.

난모세포의 질은 시간이 지남에 따라 감소하기 때문에 1시간 이내에 낭자를 주입하고 수정시킵니다. 산란 후. 정자 농도에 따라 UY에 정자 1-5방울을 넣고 접시를 휘젓습니다.

수정 외피는 배아에서 분명하게 드러나야 합니다. 약 1분 후, 폴리리신이 코팅된 접시에서 배아를 분리하는 동시에 다른 일련의 난모세포를 주입합니다. 일단 분리되면 배아를 aros로 코팅된 페트리 접시에 옮깁니다.

가능하면 폴리리신이 코팅된 접시에서 배아를 제거하십시오. 두 세포 단계 전에. 2개 세포에서 4개 세포 단계에서, 형광 해부 스코프의 도움으로 성공적으로 주입된 배아를 선택합니다.

DSR 필터를 사용하면 페놀 적색에서 파생된 적색 형광 신호를 나타내는 정상적인 형태에 의해 성공적인 주입을 알 수 있습니다. 배아를 유지하고 SW를 섭씨 19도의 아그로스(agros) 코팅된 페트리 접시에 넣어 생체 내 이미징을 위한 원하는 단계가 될 때까지 유지하고, mRNA의 미세주입 및 코팅 형광 단백질의 후, 기관지(기관지)루, lancia lato 배아의 대표적인 이미지를 촬영했습니다. 이 첫 번째 이미지는 H 2 B-E-G-F-P 구조체의 미세 주입에 의해 얻어진 핵 EGFP의 발현이 16 세포 단계부터 배아에서 검출될 수 있음을 보여줍니다.

이 위장 단계 배아는 핵 m 체리와 막 표적 EGFP의 유비쿼터스 동시 발현의 예입니다. 핵 신호는 H two BM cherry 구조체의 미세 주입으로 인한 결과이며, 세포막의 형광은 EEG FP CAAX 박스 구조체를 마이크로 주입하여 얻어집니다. 이 위장 단계 배아의 광학 단면은 핵 표적 mCherry 및 막 관련 EGFP에 의해 핵과 세포 윤곽이 각각 어떻게 강조되는지 보여줍니다.

이 미세주입 기술의 시각적 시연은 생물학 커뮤니티의 진화 발달에 있는 연구자들이 동물 진화를 이해하는 데 중요한 모델인 개별 이미징, 유전자 특이적 조작 및 안정을 위한 기존 접근 방식을 개선하고 개발하는 데 도움이 될 것입니다.