Name: 형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 Branchiostoma lanceolatum 수정 전 난자에 형광 단백질 mRNA를 미세주입하여 발현시키는 방법입니다. 이 기술은 생체 내 영상화와 유전자 조작 연구에 활용됩니다.

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저자는 축산은 &quot;Animalerie 센트 드 지프 쉬르 이베트&quot;에 의해 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) FP6 부여 &quot;Embryomics&quot;에 의해 ANR 부여 &quot;에 의해, 마이클 슈베르트에 ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 및 ANR-11-JSV2-002-01)에서 기금에 의해 지원되었다 ANR- 장 - 프랑수아 니콜라스와 나딘 Peyriéras에 10 BLAN-121801 데브 - 프로세스 &quot;. 주앙 엠마누엘 카르발류는 FCT 박사 교제에 의해 자금을 조달 (SFRH / BD / 2,012분의 86,878). 여기에 설명 된 벡터에 대한 요청은 저자에게 직접 해결할 수 있습니다.

악기 및 시약 1. 준비 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 파스퇴르 피펫을 전송 <ol><li> 다른 속도로 불꽃보다 230mm 긴 파스퇴르 피펫을 잡아 당겨 다른 팁 직경 전송 파스퇴르 피펫의 시리즈를 생성합니다. 테이퍼이기도의 부드럽고 미세한 제어를위한 가능한 한 긴 있는지 확인하십시오. </li><li> 다이아몬드 스크라이브으로 수직 피펫의 길이에 따라 라인 피펫 긁힐. 두 손으로 무딘 컷을 생성하기 위해 길이로 피펫 평행을 당깁니다. 신속 불꽃 폴란드어 끝을 밀봉하지 않고 피펫. </li><li> , 200 ~ 400 μm의 (직경 500 μm의 주위에) 수정란를 들어, 600 μm의 미 수정 난자에 대한 300 ~ 400 μm의 (직경 150 μm의 주위에) : 난자 / 배아의 무대와 팁의 직경은 피펫 수에 따라 달라질 부화 neurulae합니다. 입 모니터링 흡인 튜브를 사용 피펫은 한 접시에서 난자 / 배아를 전송합니다다른. </li></ol></li><li> 주사 바늘 <ol><li> 의 RNase없는 조건을 보장하기 위해 장갑과 모세 혈관을 조작합니다. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다. </li><li> 모세 혈관이 자료 목록에 설명 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우, 다음 설정을 사용 : 열 (600), 속도 (80), 시간 (60), 압력 (200) 또는 그렇지 않으면 300 (50)를 당겨, 모양, 어떤 보장 성공적인 주사에 매우 중요, 다음 속성 그림 2에 도시 한 바와 같이 : 4-8 μm의 외부 팁 직경 2cm 테이퍼 길이. 참고 : 바늘은 산란기 전에 뽑아 시즌 내내 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 5 % 페놀 레드 원액 (4 배) <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> 0.22 μm의 여과 튜브에서 페놀 적색 분말을 25㎎ 달아. </li><li> 에 DNase-과의 RNA 분해 효소가없는 물을 0.5 ML을 추가분체를 함유하는 튜브. </li><li> 용액을 필터링 소독과 주사 바늘을 방해 할 수있는 결정을 제거하여 실온에서 18,000 XG에 3-5 분 동안 스핀. </li><li> 4 ° C에서 보관 또는 -20 ° C에서 250 μL 씩 저장합니다. </li></ol></li><li> / ㎖ 폴리 라이신 솔루션 0.25 mg의 <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> 증류수 20ml에 폴리 -L- 라이신 5㎎을 녹인다. -20 ℃에서 5 ㎖ 씩. </li><li> 폴리 라이신 코팅 요리에 난자의 재현과 강력한 접착력을 보장하기 위해 한 번만 즉시 해동 나누어지는을 사용합니다. </li></ol></li><li> mRNA의 합성 <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> (37 ° C에서 보통 2 시간 동안) 적절한 효소를 사용하여 원하는 DNA의 5 μg의 선형화. 소화의 완전성을 확인하려면 20 분 150 W에서 TBE 버퍼에 1 % 아가로 오스-TBE 겔에 소화 믹스의 볼륨에 2 %를 실행합니다. </li><li> 원격 교육의 압축을 풉니 다24 : 1 페놀 (PH 8.0) : 클로로포름 : 25 음 공인 DNA 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기 18,000 XG에 10 분 수성 (위) 단계를 수집하기위한 소용돌이. </li><li> (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이. </li><li> 10 : 300 선형화 된 DNA : 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) : -20 ℃에서 밤새 100 % 에탄올 100 선형화 된 DNA를 침전. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 70 % 에탄올로 씻어. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 건조 및 재현 탁 0.5 ㎍ / μL의 최종 농도 보자. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 적절한 폴리머 라제 mRNA의 합성 키트를 사용하여 선형화 된 DNA 1 μg의 속기. </li><li> 1 페놀 (PH 4.7) : 5의 mRNA를 추출 키트와 함께 제공된 클로로포름, 초산 암모늄 스톱 솔루션을. </li><li> 20 초 동안 소용돌이, CEntrifuge XG 18,000에서 10 분 및 수성 상을 수집한다. </li><li> (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이. </li><li> 밤새도록 -20 ℃에서 100 % 이소프로판올 mRNA의 침전. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 80 % 에탄올에 씻어. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 그 다음, 재현 탁 어려울 수있는 바와 같이 더 이상보다 50-10 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛을 보자. 적어도 2 ㎍ / μL 최종 농도 DNase-과의 RNase가없는 물에 재현 탁 사출 믹스 흉 mRNA의 최종 농도를 보장한다. </li><li> 상기 전사 제품의 품질과 크기를 확인을 20 분 동안 150 W에서 TBE 버퍼의 RNase가없는 1 % 아가 로즈 겔상에서 TBE mRNA를 0.5 μL를 실행한다. 스토어 -80 ° C에서 2 μL 씩. </li></ol></li><li> 폴리 리신 - 코팅 요리 참고 : 폴리 라이신 COA테드 요리를 주입하는 동안 난자를 고정하는 데 사용됩니다. <ol><li> 각 35mm 배양 세포 배양 접시 (총 5)의 경우, 해동 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 리신 용액 1 ㎖와 함께 배양 접시의 저면을 커버. 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 각 35mm 세포 배양 페트리 접시 (총 5)의 경우, 다른 35mm 세포 배양 페트리 접시에 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 전송합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 배양 접시 건조, 거꾸로 보자. </li><li> 일주일 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 플라스틱 포장에 싸여 폴리 라이신 코팅 요리를 저장합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 코팅 요리 참고 : 그들은 문화를 주입 배아하는 데 사용됩니다. 아가로 오스는 주입 된 배아의 쿠션을 제공하고 접시의 바닥에 달라 붙는을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 인공 해수 (ASW) 37~38g / L의 통신을 사용합니다역삼 투 물에 ercial 염 + 0.25 mM의의 NaHCO3. </li><li> 전자 레인지에서 가열하여 용액을 0.22 μm의 필터 ASW에서 1 % 아가로 오스의 농도로 녹여. </li><li> 신속히 요리의 매우 얇은 코팅을 아가 보장하기 위해 또 다른 하나에 하나 35mm 페트리 접시에서 용액을 따뜻한 아가 붓는다. </li><li> 사란에 싸여 아가로 오스 코팅 요리 1 주일에 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 포장에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 주사 바늘 사출 믹스 로딩 <ol><li> 약 2 시간 주사를 시작하기 전에, 1-1.8의 mRNA ㎍ / μL, 15 % 글리세롤, 1.25 % 페놀 레드의 최종 농도 2 μL를 주입 RNA 분해 효소의 믹스와의 DNase없는 물을합니다. 주 : 페놀 레드 색 주입의 주입 효율 및 배아 식별 모니터링을 허용 용액. 글리세롤 난자 내의 mRNA의 확산을 선호. </li><li> 원심 분리기 4 분에 18,000 XG에펠릿 결정. 얼음에 사용할 때까지 유지합니다. </li><li> 10 μL 피펫, 결정을 펠렛 화 된 튜브의 바닥을 피 주사 믹스 0.5 μl를 수집한다. </li><li> 바늘의 큰 개구부에 주입 믹스 0.5 μL 드롭 피펫 팅하여 (여기서 주입 중에 하나를 바꿈) 적어도 두 개의 주사 바늘 백필. </li><li> 사출 믹스의 증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 바닥에 액체와 함께 저장 항아리에 바늘을 설치합니다. 사출 믹스 천천히 기포의 생성을 최소화하기 위해, 적어도 1 시간 동안 주사 바늘의 선단을 여행하자. </li><li> mRNA의 품질이 저하 한 후, 세 개의 추가 용도의 최대 -80 ° C에서 보관 추가적인 주입 믹스 (데이타 미기재). </li></ol></li></ol> 생물 재료, 미세 주입 및 배아 문화 2. 컬렉션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 난자와 정자 수집 참고 : Theodosiou를 참조하십시오등의 알. 산란을 유도하고 배우자 수집을위한 상세한 프로토콜에 대한 (12). <ol><li> 24 시간 동안 23 ° C에서 ASW에 충격 남성과 여성. </li><li> 대부분의 성인은 일몰 후 1-2 시간을 산란하기 때문에 일몰 전에 한 두 시간은 19 ° C에서 ASW에서 개별 컵에 성인을 전송합니다. </li><li> 필터링 ASW에서 35mm 배양 접시를 씻어 그들에게 접시의 바닥에 달라 붙는 난자를 방지하기 위해 건조 거꾸로 보자. </li><li> 산란시, 즉시 1,000 μL 피펫으로 정자와 난자를 수집합니다. <ol><li> 정자를 유지하고 접촉 생식 세포가 건강에 해로운 때문에 난자가 성인 amphioxus 분리 (데이터가 표시되지 않음). </li><li> 또한, 정자와 난자를 모두 방출 움직임에 이르게, 성인 깜짝 놀랄 방지, 따라서 희석. 가능한 한 긴 활성 정자를 유지하고, 수정 속도를 최적화 가능한 집중으로 정자를 수집 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유지1.5 ML 튜브에 얼음에 정자. </li><li> 사전 세척 35mm 페트리 접시에 여과 ASW에서 난자를 전송합니다. </li><li> 전송 100 ~ 500는 주사를 수행하기 위해 다른 35mm 페트리 접시에 이전 뽑아 300 ~ 400 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 난자. </li><li> 정자와 난자의 품질이나 다른 실험 대조군으로 클러치의 나머지 기름지게. </li></ol></li><li> 난자 주입 <ol><li> 수평면에 50 ° 각도로 미세 조작기에 주사 바늘을 설치한다. 참고 : 50 °의 각도가 난자에 바늘의 상대 위치의 적절한 모니터링을 허용하지 않습니다 동안보다 50 °의 각도가 접시에 주위의 난자를 밀어 것입니다. </li><li> 25X 접안 형광 해부에서 여과 ASW를 함유하는 폴리 리신 - 코팅 접시 300-400 μm의 전송 파스퇴르 피펫 30 난자 옮긴다. </li><li> 수행 할 선을 따라 난자를 입금주문 방법 및 아웃 주사는 비 주입 난 모세포에서 분사 구별하기. 배아 현상을 변형시키는 경향이 폴리 리신, 난 모세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 작은 수 (30 난자) 주사 (데이타 미기재). </li><li> 가능한 반투명으로 난자를 렌더링하는 암 필드 조명을 사용합니다. </li><li> 미세 조작기의 조동 노브, 난자 가까이에 주사 바늘을 가지고. </li><li> 미세 핀셋으로 선단이 만곡되기 시작 레벨에서 바늘을 오픈. 인젝터 펄스으로, 그 붉은 주입 혼합 실제로 바늘의 유출되어 있는지 확인합니다. </li><li> 200X 배율과 미세 조작기의 미세한 움직임 노브로, 부드럽게 난자의 핵심 내부의 주사 바늘을 이동합니다. 참고 : 너무 피상적으로 삽입 한 경우, 주입 된 용액이 난자 내부에 남아되지 않습니다. 너무 멀리 삽입 한 경우, 난자가 파괴됩니다. </li><li> 120 밀리 초 durat의 1-3 펄스 주입이온과 1 ~ 10 psi의 압력. 바늘이 충분히 좋은 경우, 일정한 압력에서 연속적인 흐름으로 주입. 사출 볼륨이 하나의 난자의 부피의 1/3에 1/5에 해당하는지 확인합니다. </li><li> 주입 후, 난자의 누출을 방지하기 위해 신속하게 바늘을 빼냅니다. </li><li> 주입 된 용액이 난자 내에서 유지하고 몇 초 후, 주입 된 용액이 난자에 걸쳐 퍼져 있는지 확인합니다. </li><li> 라인의 다음 난자에 이동합니다. </li><li> 주입 된 배아 스캔 할 때 배경 형광을 추정하기 위해 음성 대조군 각 시리즈의 일부 uninjected 배아를 유지합니다. </li></ol></li><li> 주입 배아 및 배아 문화의 시비는, 선택 <ol><li> 즉시 시리즈가 주입 된 바와 같이 난자를 기름지게. 난자의 질이 시간에 감소로, 주입, 12 산란 후 1 시간 내에 난자를 비옥. </li><li> 정자 농도에 따라 난자에 정자의 1-5 방울을 추가하고접시를 소용돌이 친다. 참고 : 수정 봉투는 약 1 분 후 배아에 명확하게해야한다. </li><li> 난자의 또 다른 시리즈를 주입하는 동안, 배아는 폴리 라이신 코팅 접시에서 분리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 아가로 오스 코팅 페트리 접시에 600 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다. 모든 가능한 2 셀 단계 전에 경우, 가능한 한 빨리 폴리 라이신 코팅 접시에서 배아를 제거합니다. 참고 : 폴리 라이신에 장시간 노출 될 경우, 배아는 접시의 바닥에 닿는면에 평평하게 밀집 blastulae, 될 경향이있다. </li><li> 2 셀 4 셀 단계에서, DSR 필터와 형광 해부 범위로 선택 성공적으로 주입 배아, 즉, 페놀 레드 파생 적색 형광 신호를 전시하는 일반적인 형태와 그. </li><li> 원하는 스테이지까지 19 ° C에서 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에서 필터링 ASW에서 문화 배아를 유지생체 내 이미징. </li></ol></li></ol>

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이 글에서, B.의 주입을 위해, 처음으로, 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시 lanceolatum 난자, 이는 후 B. floridae 13, 14 및 B belcheri 15는, 이와 같은 기술이 기재되어있는 제 amphioxus 종이다. 중요한 프로토콜은 B. 형광 단백질의 생산에 적합한 벡터 시스템의 설명을 포함 여기에 설명 시험 관내 생산 된 mRNA의 주입으로부터 lanceolatum (후술). 함께, 이러한 새로운 도구 amphioxus의 초기 개발 및 분열과 낭 배기와 배아의 초기 형태 형성 이벤트를 기초 동적 세포 행동의 분석의 생체 내 이미징 할 수 있습니다. 일반적으로, 마이크로 인젝션 기술은 특정 화합물의 사전 정의 된 양의, 표적 세포 내로 전달을 허용하는 이점을 갖는다. 이 인들과 ...

개발하는 동안, 하나의 세포가 세포 분열과 이동을 모두 포함하는 매우 복잡한 공정에서 전체 유기체를 일으킨다. 나은 셀 동작의 역학의 기초 생물학적 원리를 이해하기 위해서, 발달 생물학 형광 기반 생체 이미징 기법을 사용하기 시작했다. 이러한 세포막 등 세포의 구체적인 구획, 어느 형광 염료로 처리하여 특이성 부족 및 조직 침투 (1)의 저해 방법을 표시 할 수, 또는 형광 단백질 둘을 코딩 외인성의 mRNA 배아 내로 특정 도입. 다른 기술들은 예컨대 mRNA가 같은 외인성 화합물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 미세 주입, 전기 천공, 미세 입자, 리포 펙션과 함께 충격 전달 3,4, 이에 한정되지 않는다. 이러한 모든 접근에 외인성 화합물을 도입하는 데 사용될 수 있지만배아를 현상 만 마이크로 인젝션은 각 셀 (3)에 소정 수량의 정확한 적용을 허용한다. 마이크로 인젝션 기술은 모든 주요 발달 모델 시스템을 위해 설명되었다 4 (예, 초파리, 선충 웜, 제브라 피쉬, 개구리, 마우스)뿐만 아니라 발전기구의 발전을 이해 목표 비교 연구에 사용되는 등 일부 다른 모형 (4)에 관해서 (예를 들어, 말미잘, 환형 동물 벌레, 성게, 멍게의 tunicates, 두삭 동물의 amphioxus). 함께 tunicates과 척색 문을 설정 척추 동물로, 특히 적합 모델입니다 Cephalochordates는 척색 동물의 진화와 무척추 동물의 조상 5-8에서 척추 동물의 다양 화를 연구한다. 두삭 동물의 혈통은 초기 척색 진화하는 동안 분기; 세 장군으로 세분화되어 현존하는 cephalochordates (밀기울chiostoma, Asymmetron 및 Epigonichthys가), 척추 동물과 유사 모두 전체 해부학과 게놈 구조 5-8의 관점에서. 지금까지 설명 된 cephalochordates의 약 30 종, 다섯 배아 발달 연구 6,9 사용할 수 있습니다 Asymmetron의 lucayanum (바하마 창고 기), Branchiostoma floridae (플로리다 amphioxus), 창고 기 (유럽 amphioxus) Branchiostoma belcheri (중국 amphioxus)과 Branchiostoma japonicum (일본 amphioxus). 이 종의 세 가지의 잘 익은 성인 (B.의 lanceolatum, B.의 belcheri 및 B. japonicum)는 주문형 짝짓기의 계절 (10, 11) 중 산란을 유도 할 수있다. 또한, 적어도 용 B. lanceolatum, 효율적인 산란은 이에 연구소 용에 대한이 특정 두삭 동물 종에 액세스 할 수 있도록, 인공 해수 (12)에 유도 할 수있다천연 해수에 액세스 할 수 없습니다 이거 야. B의 조합, lanceolatum, 이러한 미세 주입 등의 효율적인 전달 방법과 배아에 편리하고 안정적으로 액세스의, 지금까지 13 ~ 15, (B. floridae와 B belcheri 모두) amphioxus에서 개발 된 유일한 전달 기술의 개발을 가능하게합니다 계보 tracing- 및 동적 셀 동작 기반 접근 방식을 포함 속임수 기술의 새로운 제품군. 의 mRNA를 효율적으로 미세 주입을위한 프로토콜은 B의 형광 단백질을 표현 lanceolatum 배아, 따라서 개발되었다. 또한, B의 라이브 영상을위한 기본 툴킷을 제공하는 lanceolatum 배아, 벡터 시스템은 막 - 관련 단백질의 형광 핵 발현 허용하는 것이 개발되었다. 막 타겟팅의 경우, 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는)는 mCherry 및 eGFP는 인간 HRAS의 CAAX 상자와 핵 현지화했다 융합했다제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (그림 1, 보충 파일 1)을 융합하여 얻을 수 있습니다. 또한, 단백질 번역을 최적화 할 목적으로, 구조체의 서열과 코작 코돈 변형 된 사용 및 B.에 적응 lanceolatum. 종합적으로, 여기에 제시된 주입 방법 및 발현 벡터는 특히 최근의 생체 영상 기술에 기반하여 형광 분석 cephalochordates 새로운 실험 접근법의 생성을위한 기초로서 역할을한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>배양 처리</td></tr><tr><td>여과 장치 (Stericup 1 L)</td><td>Fisher</td><td>W21719</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>Spin-X 튜브</td><td>Costar</td><td>8160</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>직경 1.2mm 모세관용 바늘 보관 용기</td><td>WPI</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td>230mm 길이</td></tr><tr><td>흡인 튜브</td><td>Dutscher</td><td>75056</td><td></td></tr><tr><td>주사 바늘용 모세혈</td>관 <td>Sutter</td><td>BF 120-94-10</td><td>필라멘트가 있는 붕규산 유리, OD 1.20mm, ID 0.94mm, 길이 10mm</td></tr><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마</td><td>114537</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로브로마이드</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>H2O, DNase/RNase-free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>mRNA 합성 키트</td></tr><tr><td>페놀 pH 8</td><td>시그마</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>24:1 클로로포름:이소아밀릭 알코올</td><td>시그마</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>5:1 페놀 pH 4.7:클로로포름</td><td>시그마</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>암초 결정 소금 (200 kg)</td><td>유럽&nbsp;</td><td></td><td>상업용 염</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Fluorescent dispirting scope with 200X magnification</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>25X oculars, DSR and GFP2 filters</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marzhauzer</td><td>M-33</td><td></td></tr><tr><td>Injector</td><td>Picospritzer</td><td>model II or III</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>가열 필라멘트 니들 풀러</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11252-30</td><td>Dumont #5</td></tr></tbody></table>

형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mrna의 주입에 의한

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

우리는 여기에서 cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum의 수정되지 않은 난모세포에 mRNA를 주입한 후 형광 단백질의 발현을 위한 강력하고 효율적인 프로토콜을 보고합니다. 우리는 양서류 코돈 사용 및 Kozak 합의 염기서열을 수용하기 위해 수정된 멤브레인 및 핵 표적 mCherry 및 eGFP에 대한 구조를 사용합니다. 사용할 주사 바늘의 종류, 수정되지 않은 난모세포에 대한 고정 프로토콜 및 전반적인 주사 설정에 대해 설명합니다. 이 기술은 형광 표지된 배아를 생성하며, 이 배아에서는 최신 생체 내 이미징 전략을 사용하여 초기 발달 중 세포 행동의 역학을 분석할 수 있습니다. 이 양서류 종에서 미세주입 기술의 개발은 유전자 과발현 및 녹다운을 포함한 유전자 특이적 조작뿐만 아니라 배아의 세포 행동에 대한 실시간 이미징 분석을 가능하게 할 것입니다. 전체적으로 이 프로토콜은 배아 발달 메커니즘, 더 중요하게는 배아 발달과 관련된 질문을 해결하기 위한 동물 모델로서 기저 척삭 양서류를 더욱 공고히 할 것입니다.

위에서 설명한 프로토콜 B. 마이크로 인젝션 용의 기초를 제공한다 lanceolatum 난자 따라서 B. 개발에 도입 mRNA를 lanceolatum 배아는 생체 내 이미징 형광 단백질을 코딩. 기술은 확실히 견고하고 신뢰할 수 있지만,이 프로토콜을 이용하여 성공적으로 주사 속도 변수 (표 1) 남아있다. 이 흥미로운 사실​​을 매우 그럴듯한 설명은 난자 클러치의 극단적 인 변화입니다 : 사출 압력을받을 때 다른 달걀 배치가 참으로 매우 다르게 작동 않습니다. 다른 사람들은 매우 단단하고 주입시 라운드 유지하면서 일부 난자, 오히​​려 탄성이며 접시의 바닥에 평평하게하는 경향이있다. 다른 단순히를 Lyse (데이터 미기재)하면서 또한 일부 난자 배치는 주입시 그들의 융모막 막을 팽창하는 경향이있다. 명백한 상관 관계가 주입 및 배아에 난자 행동 사이을 구축 할 수 없습니다수정 후 개발. 그것은 미세 주입에 가장 적합 난자의 범주를 예...

우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.

형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 단백질을 기관지 장루 lancia latam 난모세포에 인코딩하는 mRNA를 도입하여 발달 중인 배아의 생체 내 형광 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 24시간의 온도 충격으로 잘 익은 암컷, 수컷과 암컷의 산란을 유도함으로써 달성됩니다. 온도 충격에 따라 암컷과 수컷은 각각의 산란 컵에 배치되어 각각 난모세포와 정자를 수집할 수 있습니다.일단 cyte가 polylysine coated dish에 정렬되면, 특히 준비된 microinjection 바늘을 사용하여 cyte의 핵 내부에 용액을 주입합니다. 마지막 단계는 1-5방울의 정자로 세포를 수정하는 것입니다. 궁극적으로 두 개의 광자 레이저 스캐닝.현미경 검사법은 마이크로 주입된 mRNA에서 생성된 형광 단백질의 유비쿼터스 발현을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 미세주입 단계가 자세히 설명하고 인쇄에서 다룰 수 없는 필수 기술력으로 인해 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 주사 중 세포를 고정시키는 데 사용되는 폴리리신 코팅 접시를 준비합니다.각 35mm 세포 배양 페트리 접시에 대해 바닥을 폴리리신 용액으로 덮고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 폴리리신 용액을 다른 접시에 옮기고 다시 실온에서 5분 동안 배양합니다. 용액을 버리고 페트리 접시를 실온에서 2시간 동안 거꾸로 건조시킵니다.건조되면 코팅된 접시를 플라스틱 랩에 싸서 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 주입된 배아를 배양하는 데 사용되는 아로스 코팅 접시를 준비하기 위해 인공 해수와 역삼투수를 만듭니다. 다음으로, 여과 된 1 % 농도로 aros를 용해시키고 한 페트리 접시의 따뜻한 aros 용액을 다른 페트리 접시에 신속하게 부어 접시의 매우 얇은 aros 코팅을 보장했습니다.코팅된 접시를 사란 랩으로 싸서 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 보관합니다. 먼저 RNA와 DNA가 없는 물 페놀에 주입 혼합물을 준비합니다. 빨간색은 용액을 착색하고 성공적으로 주입된 배아를 식별할 수 있도록 합니다.다음으로 혼합물을 원심 분리하여 결정을 펠릿으로 만들고 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 준비가 되면 10마이크로리터 피펫에 0.5마이크로리터의 주입 혼합물을 로드하고 결정이 펠릿화된 튜브의 바닥을 피합니다. 0.5마이크로리터의 주사액 방울을 피펫팅하여 주사 바늘을 다시 채웁니다.바늘의 큰 구멍에 섞습니다. 주사 중 하나가 부러질 경우를 대비하여 두 개의 바늘을 준비하십시오. 주사제의 증발을 방지하기 위해 바닥에 물이 있는 항아리에 바늘을 보관하십시오.섞어서 섭씨 4도에서 놓습니다. 거품 생성을 최소화하기 위해 주입 혼합물이 최소 1시간 동안 주입 바늘 끝으로 천천히 이동하도록 합니다. 난모세포와 정자 채취를 시작하기 위해, 수컷과 암컷은 24시간 동안 SW에서 충격을 받은 다음 산란 1-2시간 전에 개별 컵으로 옮겨집니다.산란이 되면 즉시 정자와 세포를 수집하십시오. 수거 중 성인을 놀라게 하지 않도록 주의하세요. 추가적인 움직임은 소멸될 수 있으며, 따라서 채취 후 정자와 세포를 모두 희석시킬 수 있습니다.1.5 밀리리터 튜브에 정자를 얼음 위에 보관하고 여과 된 SW의 세포를 미리 헹궈진 페트리 접시로 옮깁니다. 100-500개의 cyte를 다른 35mm 페트리 접시로 옮겨 주사를 수행합니다. 마지막으로, 세포 클러치의 나머지 부분을 정자 및 세포 품질 또는 다른 실험을 위한 대조군으로 수정시킵니다.주입 절차를 시작하려면 25개의 안구가 있는 형광 해부 내시경 아래 수평면에 대해 50도 각도로 마이크로 매니퓰레이터에 바늘을 설치하고 30개의 cyte를 polylysine 코팅 접시로 옮기고 주입된 cyte를 추적하는 데 도움이 되도록 SW를 필터링합니다. 질서 정연한 방법으로 줄을 따라 놓으십시오. 노출을 최소화하기 위해 항상 작은 수를 주입하십시오.발달 중인 배아를 변형시키는 경향이 있는 폴리리신에 대한 시간. 암시야 조명을 사용하여 세포를 가능한 한 반투명하게 렌더링합니다. 그런 다음 거친 이동 손잡이를 사용하여 미세한 집게로 주사 바늘을 세포에 가깝게 가져옵니다. 삭감.인젝터로 펄스를 가하여 팁이 구부러지기 시작하는 높이에서 바늘을 엽니다. 200배 배율에서 바늘에서 빨간색 주입 혼합물이 흘러나오는지 확인합니다. 그리고 미세한 움직임 손잡이로 주사 바늘을 cyte의 중심부 안쪽으로 부드럽게 움직입니다.표면적으로 두 개를 삽입하면 주입된 용액이 UO 부위 내부에 남아 있지 않습니다. 너무 많이 삽입하면 UO 사이트가 파괴됩니다. 1-3개의 펄스로 주입합니다.바늘이 충분히 미세하면 일정한 압력으로 연속 흐름으로 주입합니다. 주입 부피가 주입 후 단일 난모세포 부피의 1/5에서 1/3에 해당하는지 확인합니다. 누출을 방지하기 위해 바늘을 신속하게 당겨 빼내십시오.주입된 용액이 cyte 내에 남아 있고 몇 초 후에 주입된 용액이 cyte 전체에 퍼지는지 확인합니다. 다음 줄에 있는 cyte로 이동합니다. 주입된 배아를 스캔할 때 배경 형광을 추정하기 위해 각 시리즈의 일부 unin 주입된 배아를 음성 대조군으로 유지하고, 시리즈가 주입되자마자 난모세포를 수정시킵니다.난모세포의 질은 시간이 지남에 따라 감소하기 때문에 1시간 이내에 낭자를 주입하고 수정시킵니다. 산란 후. 정자 농도에 따라 UY에 정자 1-5방울을 넣고 접시를 휘젓습니다.수정 외피는 배아에서 분명하게 드러나야 합니다. 약 1분 후, 폴리리신이 코팅된 접시에서 배아를 분리하는 동시에 다른 일련의 난모세포를 주입합니다. 일단 분리되면 배아를 aros로 코팅된 페트리 접시에 옮깁니다.가능하면 폴리리신이 코팅된 접시에서 배아를 제거하십시오. 두 세포 단계 전에. 2개 세포에서 4개 세포 단계에서, 형광 해부 스코프의 도움으로 성공적으로 주입된 배아를 선택합니다.DSR 필터를 사용하면 페놀 적색에서 파생된 적색 형광 신호를 나타내는 정상적인 형태에 의해 성공적인 주입을 알 수 있습니다. 배아를 유지하고 SW를 섭씨 19도의 아그로스(agros) 코팅된 페트리 접시에 넣어 생체 내 이미징을 위한 원하는 단계가 될 때까지 유지하고, mRNA의 미세주입 및 코팅 형광 단백질의 후, 기관지(기관지)루, lancia lato 배아의 대표적인 이미지를 촬영했습니다. 이 첫 번째 이미지는 H 2 B-E-G-F-P 구조체의 미세 주입에 의해 얻어진 핵 EGFP의 발현이 16 세포 단계부터 배아에서 검출될 수 있음을 보여줍니다.이 위장 단계 배아는 핵 m 체리와 막 표적 EGFP의 유비쿼터스 동시 발현의 예입니다. 핵 신호는 H two BM cherry 구조체의 미세 주입으로 인한 결과이며, 세포막의 형광은 EEG FP CAAX 박스 구조체를 마이크로 주입하여 얻어집니다. 이 위장 단계 배아의 광학 단면은 핵 표적 mCherry 및 막 관련 EGFP에 의해 핵과 세포 윤곽이 각각 어떻게 강조되는지 보여줍니다.이 미세주입 기술의 시각적 시연은 생물학 커뮤니티의 진화 발달에 있는 연구자들이 동물 진화를 이해하는 데 중요한 모델인 개별 이미징, 유전자 특이적 조작 및 안정을 위한 기존 접근 방식을 개선하고 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

이 작업은 제브라피쉬 배아에 형질전환 구조를 만들어 주입하기 위한 게이트웨이 기반 복제 방법인 모듈식 Tol2 형질전환 시스템에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

학습하세요 Branchiostoma lanceolatum 수정 전 난자에 형광 단백질 mRNA를 미세주입하여 발현시키는 방법입니다. 이 기술은 생체 내 영상화와 유전자 조작 연구에 활용됩니다.

형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

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