Name: 배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포를 유도하는 방법을. 형광 리포터와 유세포 분석을 활용한 세포 농축 기법으로 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 레오니드 그나토프스키(Leonid Gnatovskiy) 박사가 논문을 신중하고 비판적으로 읽어준 것에 대해 감사한다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, HL109054)과 미시간 대학교(University of Michigan)의 새뮤얼 앤 진 프랭클 심혈관 센터(Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center)의 보조금(창립 기금)과 뉴욕대학교 의과대학(New York University School of Medicine)의 Leon H Charney 심장학 부서에서 BL에 보조금을 지원했습니다.

마우스는 ESC에서 마우스 배아 클릭당 비용 (CPC) 1. 유도 <ol><li> 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) 세포층을 준비합니다. <ol><li> 따뜻한 MEF 매체 37 ° C에 (DMEM에 10 % FBS). </li><li> 젤라틴 코팅 된 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 10cm 접시에 6 웰 플레이트의 우물 또는 5 ㎖에 물에 0.1 % 젤라틴의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 판 또는 요리 37 ° C에서 또는 실내 온도를 남겨주세요. 사용하기 전에 젤라틴을 열망. </li></ol></li><li> 해동은 부드러운 흔들림으로, 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 MEFs에를 조사. </li><li> 15 ml의 50 ML 원뿔 튜브에 부드럽게 세포를 전송합니다. 예열 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 천천히 세포를 소용돌이 및 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기. </li><li> MEF 매체에서 세포를 재현 탁하고 가능한 세포를 계산합니다. 10cm 접시에서 세포를 2 ml를 6 웰 플레이트에서 웰 당 세포 및 10 ml의 다음 MEF 매체의 볼륨을 사용합니다. </li><li> 6 웰 플레이트에 플레이트 세포 또는 1-2에서 10cm 요리플레이트 / 접시 당 × 10 (6). </li><li> 37 ° C에서 MEF 플레이트 / 접시를 품어, 5 % CO 2 최소 24 시간 이전에 사용할 수 있습니다. 주 : 주보다 오래된 MEF 판 / 요리를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 마우스는 ESC를 준비 <ol><li> 문화 Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; 90 %의 합류까지 MEFs에에 Rosa26YFP 마우스는 ESC. 사용 ES 세포 배지 410 ml의 DMEM, 75 ㎖의 FBS, 0.1 mM의 MEM NEAA, 2 mM L- 글루타민, 0.1 mM의 피루브산 펜 100 U / 스트렙토 마이신, 및 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올로 구성. </li><li> 1.1.2에 설명 된대로 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> 접시에서 대기음 매체와는 DPBS로 세포를 씻어. <ol><li> 기음 DPBS 6 웰 플레이트 잘 하나에 0.4 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 트립신 반응을 중단 1 ml의 예열 ES 매체를 추가합니다. </li></ol></li><li> 수확 세포와 원심 분리기 세포 200 XG와 대기음 매체에서. 재현 탁 된 1 ml의 ES 세포 배지에서 세포와 세포를 카운트. &lt;/ 리&gt; <li> 3 × 104 / ㎠의 밀도에 젤라틴 코팅 플레이트 플레이트는 ESC. 는 ESC는 약 90 % 합류에 도달했을 때 약 2 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. 매체 일상을 변경합니다. </li><li> 는 ESC가 90 % 합류 경우, 반복 완전히 MEF 피더를 제거하는 1.2.2-1.2.5 단계. </li></ol></li><li> EB 형성에 의해 CPC 분화를 유도 <ol><li> 다음으로 분화 배지 준비 : 36 ml의 IMDM, 12 ml의 햄 F12, 2 mM L- 글루타민, 0.34 ml의 BSA (7.5 %), 0.25 ml의 N2, 0.5 ㎖의 B27, 50 ㎍ / ㎖의 AA, 및 0.45 mM의 1- 티오 글리세롤. </li><li> 기음 세포로부터 중간 DPBS 씻어. 기음 DPBS 6 웰 플레이트 잘 하나에 0.4 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 하나의 세포로 세포 클러스터를 분산 아래로 반응 및 피펫 업을 중단하고 1 ml의에게 차별화 매체를 추가합니다. </li><li> 원심 분리기는 ESC 5 분 200 XG에와 매체를 폐기합니다. <ol><li> 재현 탁 1 × 6 &lt;/ SUP&gt; 1 ml의 차별화 매체는 ESC. 제 EB 응집 37 ° C에서 분화 배지에서 1 × 105 세포 / ml의 낮은 농도에서 분리 배양 접시에서 세포를 세포 수 및 배양. </li></ol></li><li> 이틀 EB 형성 한 후, 50 ㎖ 튜브에 요리에서 사채를 전송할 수 있습니다. 1 분 동안 200 XG에 스핀. 매체를 제거하고 칼슘과 마그네슘 2+없이 10 ML의 DPBS로 사채를 씻어. </li><li> 기음 DPBS 1 ml의를 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 반응을 정지 4.5 ml의 차별화 매체를 추가합니다. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 세포를 원심 분리기. 1 ml의 분화 배지에서 대기음 매체에 resuspend 세포. </li><li> 세포 수 및 분화 배지에서 1 × 105 세포 / ㎖로 2 × 106 세포를 희석. 5 NG / ㎖, 0.8 ng를 / ㎖의 최종 농도 매체에 VEGF, BMP4과를 Activin이 추가, 5 NG / ㎖, 각각. Cultu37 ° C에서 두 번째 EB 형성을위한 배양 접시에 세포 재. </li><li> 두 번째 EB 형성 후 40 시간은 50 ㎖ 튜브에 사채를 전송할 수 있습니다. 5 분 동안 37 ° C에서 1 ml의 0.25 % 트립신과 EBS을 (를) 해리, DPBS로 한번 씻어. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. </li><li> 5 NG / ㎖ VEGF, 10 NG / ㎖의 bFGF 12.5 NG / ㎖로 FGF10 Stempro-34 배지에서 세포를 재현 탁. 젤라틴 - 코팅 된 플레이트에서 2 × 105 / cm 2에서 셀을 접시. CPC 분리하기 전에 약 32 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 문화. </li></ol></li><li> mCPCs를 분리 <ol><li> 대기음 매체와 DPBS 씻어. 5 분 동안 37 ℃에서 배양 플레이트에 0.5 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 반응을 정지 4.5 ml의 차별화 매체를 추가합니다. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. FACS 정화 2 % FBS / PBS에서 원심 분리기에 resuspend 세포에 의한 세포를 수집합니다. </li><li> 음성 대조군으로 정렬에 미분화는 ESC를 실행합니다. 변경 전압은 앞으로 배설물을 조정합니다터 (FSC)와 측면 산란 (SSC)를 원하는 인구를 선택합니다. 파편과 이중를 제외 측면 분산과 폭 대 앞으로 분산 높이 대 흩어 앞으로 사용합니다. 선택한 하위 집단에서, ESC 컨트롤의 분포에 따라, 세포의자가 형광을 제거하기 히스토그램에 긍정적 인 YFP의 게이트를 그립니다. YFP + 게이팅에서 YFP + CPC를 수집합니다. </li><li> 차별화 매체 (1.3.1) 6 웰 플레이트에서 정제 된 클릭당 비용 (CPC) (YFP + 셀) 플레이트. 심근 및 SMCs에 클릭당 비용 (CPC)의 차별화를위한 37 ° C에서 문화 추가 3~5일. </li></ol></li></ol> 인간는 ESC에서 인간 배아 클릭당 비용 (CPC) 2. 유도 <ol><li> 공급기를 준비 <ol><li> 2 × 104 / ㎠의 밀도로 상기 한 바와 같이 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에) 세포층을 준비한다. </li></ol></li><li> 인간는 ESC를 유지 <ol><li> CRE; M에 정기적으로 pCAG - 플록스-STOP-플록스-GFP 또는 RFP는 ESC : 인간 ISL1 유지정규 hESC의 매체 (녹아웃 DMEM / F-12 385 ㎖, 넉 아웃 SR 100 ㎖, 2 mM L- 글루타민, 0.1 mM의 NEAA, 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖ 염기성 FGF)을 사용 EF. 심장 분화 이전에, 적어도 2 개의 통로의 피더 자유로운 상태는 ESC 인간 옮긴다. </li></ol></li><li> 피더 무료 조건에서 인간는 ESC를 준비 <ol><li> 인간는 ESC 문화 코팅 된 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 4 ° C에서 하룻밤 리겔을 녹여. 얼음에 50 ML 튜브를 넣고 튜브에 30 ml의 차가운 DMEM / F12 배지를 추가합니다. </li><li> 차가운 매체에 1 ml의 마트 리겔을 넣고 잘 섞는다. 10cm 접시에 6 웰 플레이트의 우물 또는 5 ㎖에 1 ml의 차가운 리겔 - DMEM / 12 매체를 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 판 / 4 ° C에서 하룻밤 요리 또는 실내 온도를 남겨주세요. 대기음 매체를 사용하기 전에. </li></ol></li><li> MEF 플레이트에서 대기음 미디어와 DPBS 인간의는 ESC를 씻어 : 인간 플레이트 상에는 ESC를 분할합니다. 이어서 6- 웰 플레이트의 웰에 1 ㎖의 디스 파제 (1 mg / ㎖)을 추가한다. 37 ° C에서 세포를 품어인큐베이터는 식민지의 가장자리가 분리 시작할 때까지. </li><li> 디스 파제 솔루션을 제거합니다. 다음 2.5 ml에 추가 / 잘 mTeSR 매체 또는 MEF-조정 배지 당 판에 두 번 DPBS 씻어. </li><li> 작은 덩어​​리로 인간의 ESC 식민지 아래 휴식을 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁고 조심스럽게 피펫합니다. </li><li> ESC 덩어리를 전송하고 1을 희석 : 3 코팅 된 판에. </li><li> 2 ㎖ / 잘 mTeSR 매체 또는 MEF 에어컨 매체를 추가하고 매일 매체를 변경합니다. </li><li> mTeSR 매체 또는 적어도 두 구절 코팅 접시에 MEF 에어컨 매체 문화 인류는 ESC. </li></ol></li><li> 인간는 ESC에서 CPC의 분화를 유도 <ol><li> 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때, 배지를 흡인하고 DPBS로 헹군다. 그런 다음 20 분 동안 37 ℃에서 0.5 ㎎ / ㎖의 인간 배아 줄기 스파 아제 (Dispase)를 배양한다. </li><li> 셀 리프터와 접시에서 세포를 제거, 두 번 DPBS와 인간 배아 줄기 린스, 다음 DMEM / F12는 18 % FBS, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의를 포함하는 (분화 배지에서 세포 클램프를 재현 탁L- 글루타민, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 50 ㎍ / ml의 아스 코르 빈산 산). </li><li> EB 형성을위한 6 자 초저 부착 판에 세포를 전송합니다. </li><li> 다음날 차별화 매체를 변경합니다. </li><li> 3 일마다 중간 교체 및 현탁 배양에 사채을 유지한다. </li></ol></li><li> HCPCS를 분리 <ol><li> 더 이상 인간의 CPC 격리를위한 차별화의 날 (9)보다 사채를 수집하지 않습니다. </li><li> 대기음은 중간 두 번 DPBS로 사채를 씻어. 5 분 동안 37 ° C에서 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 0.25 % 트립신을 추가한다. </li><li> 반응을 정지 분화 배지의 동일한 볼륨. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. 2 % FBS / DPBS에 5 분에 resuspend 세포 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 40 μm의 셀 스트레이너 및 FACS 정제 RFP + CPC 세포와 필터 세포로 1.4.3에 설명. </li><li> 플레이트 geltin 코팅 된 플레이트 상에 HCPCS 정렬. 7 분화 배지에서 배양 HCPCS-9 일 심근 세포 및 평활근 세포로 분화한다. 칠일 도금 후, 문화 DMEM / F12 배지에서 5 % 녹아웃 SR과 세포를 분화. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 성장 인자를 사용하여 mESC 분화 및 인간 ESC의 CPC로의 자발적 분화를 안내하는 방법을 결합합니다. 형광 리포터로 표시된 CPC 계통은 FACS에 의해 CPC를 효율적으로 식별하고 분리하는 데 사용됩니다. FACS로 정제된 CPC는 심근 세포, 평활근 및 내피 세포로 분화하는 능력을 유지하며 생체 내 세포와 유사한 발현 프로파일을 갖습니다. 따라서 이러한 CPC는 심장 근육과 혈관 구조를 모두 형성하는 능력 때문에 세포 기반 심장 치료를 위한 훌륭한 자원이 될 수 있습니다. 
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 시험관 내 분화 동안 CPC의 고순도 및 양과 관련된 정확한 타이밍을 식별하는 것입니다. 만능줄기 세포의 CPC로의 분화에 영향을 미칠 수 있는 많은 조건(예: 혈청 로트 번호, 세포주 등)이 있습니다. 분화 최적화를 위한 파일럿 실험과 CPC 분리를 위한 적절한 시간 창 결정을 강력히 권장합니다.
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Lei Bu

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Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

심장 질환은 세계에서 가장 주요 원인 오늘날 남아 사망률은 지난 20 년 (미국 심장 협회)에서 이뤄지지 않고있다. 효과적으로 방지 또는 심부전를 취소하는 신규 한 치료 전략의 개발에 대한 중요한 필요가있다. 한가지 유망한 전략은 줄기 세포 생물학 (1)의 급속한 발전 다음 세포 기반 치료이다. 이와 관련, 다 능성 클릭당 비용 (CPC)으로 인해 증식하지만 심장 혈통 차별화하기 위해 최선을 다하고 자신의 능력으로 치료를위한 우수한 셀 소스 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 강력한 방법은 생성과 심장 세포 치료제 연구를위한 매우 중요하다 클릭당 비용 (CPC)을 분리합니다. 이 프로토콜은 초기 배 발생 및 방법는 ESC에서 자신의 세대에서 확인 된 배아 클릭당 비용 (CPC)에 초점을 맞추고있다. 다양한 클릭당 비용 (CPC)에도 뼈 된 marrows 2에서, 배아와 성인 마음에서 고립되었다. 배아 개발하는 동안, 뼈 morphoge마그네틱 단백질 (BMP 형식)은, 날개 형 MMTV 통합 사이트 가족 (Wnts)와 마디 신호는 Mesp1 + 능성 중배엽 3의 헌신을 유도한다. Mesp1 + 세포는 배아의 CPC 사로 분화. 이 클릭당 비용 (CPC)은 일반적으로 NK2의 호 메오 박스 (5) (Nkx2-5가), ISL LIM의 호 메오 박스 (1) (Isl1가), T-상자 5 (Tbx5) 및 심근 증강 인자 2C (Mef2c가), 차 및 제 마음 필드를 형성, HCN4으로 표시하고 있습니다 cardiogenesis ~ 10시 심장의 주요 부분에 기여하고 있습니다. Nkx2-5 + 및 Isl1 + / Mef2c + 두 클릭당 비용 (CPC)가 심근 세포로 분화 할 수있는, 평활근 세포 (SMCs) 및 내피 세포 5-8. 따라서 이들의 CPC 심장 혈관계뿐만 아니라 심장 조직을 야기하고 심장 세포 기반 치료를위한 이상적인 셀 소스있는 것이다. 결과적으로, 시험 관내에서 CPC를 생성하는 심혈관 연구에서 주요 연구 초점이되어왔다. 는 ESC 무제한 확장 용량을 가지고 있기 때문에ND 포배기에서 ICM 세포를 나타내고, 천연 배아 배아 다음의 CPC는 ESC로의 분화는 CPC를 획득하기 위해 논리적이고 효과적인 방법으로 간주된다. 는 ESC에서 클릭당 비용 (CPC)을 얻을 수있는 한 넓게 적용 방법은 사채 11로는 ESC를 집계하는 것입니다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 심장 개발 기술에 기초하여 정의 화학적 및 성장 인자 12-14 사용되고있다. 그러나, 현장에서 널리 허용되는 명확한 CPC 마커, 특히 아니 세포 표면 마커는 없다. 이 문제를 해결하기는 ESC는 Isl1 + 또는 Mef2c + 클릭당 비용 (CPC) 및 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 사용하여 형광 기자들과 이들의 유도체를 표시하도록 설계되었습니다. CRE 재조합 효소는 Isl1 / Mef2c 프로모터 / 인핸서의 제어에 노크한다. 구성 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질의 변성 또는 RFP YFP 유전자 CRE 재조합 효소와 플록스 정지 코돈의 절단에 의해 활성화 될 수있다(ISL1 : CRE;-pCAG - 플록스-STOP-플록스 GFP 또는 RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. 는 ESC가 두 번째 심장 필드 클릭당 비용 (CPC)로 분화되면, Isl1 / Mef2c 프로모터 / 증강 구동 CRE는 형광 기자를 활성화하고 클릭당 비용 (CPC)은 FACS 정화에 의해 강화 될 수있다. 간략하게, EB 집계 방법은 ESC의 분화를 시작하는 데 사용된다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 분화 세포는 아스코르브 산 (AA) 및 BMP4, 티빈 13,15 VEGF와 같은 성장 인자로 처리된다. 이 프로토콜은 마우스와 인간는 ESC를 모두 사용하여 강력하고 효율적인 CPC 차별화 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo scentific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Knockout SR</td><td>Life 기술</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life 기술</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life 기술</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life 기술</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life 기술</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life technology</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life technology</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>햄' s F12</td><td>생명 기술</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>생명 기술</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상구균</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>생명 기술</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>생명 기술</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34</td><td>생명 기술</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F12</td><td>Life 기술</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td>Ascobic Acid <td>25200056</td><td></td> <td>생명 기술</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-티오글리세롤</td><td>시그마</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>액티브A</td><td>R & 디</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>R& 디</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>스템셀 기술</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

심장전구세포(CPC)는 심근세포, 평활근세포(SMC), 내피세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며 심장 질환에 대한 세포 치료에 큰 가능성을 가지고 있습니다. CPC를 분리하기 위한 다양한 방법 중 배아줄기세포(ESC)를 CPC로 분화하는 것은 배아줄기세포가 무제한의 세포 공급원을 제공할 수 있기 때문에 이 분야에서 큰 주목을 받고 있습니다. 그 결과, ESC에서 CPC를 도출하기 위한 수많은 전략이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 ESC 모두에서 배아 CPC의 분화 및 정제에 대해 설명합니다. 배아 CPC를 분리하기 위해 세포 표면 마커를 사용하는 것이 어렵기 때문에 ESC는 CPC 특이적 cre 재조합효소 발현에 의해 활성화되는 형광 리포터로 설계되었습니다. 따라서 CPC는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 강화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPC 사양 지정 및 농축을 위해 ESC에서 배아체(EB)를 형성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 CPC는 이후에 심장 계통 분화 및 기타 생물학적 분석을 위해 배양할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 인간 ESC 모두에서 CPC를 강력하고 효율적으로 유도하는 데 최적화되어 있습니다.

이 프로토콜은 여러 ES 세포주에서 클릭당 비용 (CPC)의 유도를 보여줍니다. 는 ESC는 클릭당 비용 (CPC)로 분화하는 교환 사채를 형성하기 위해 집계됩니다. 는 ESC 정기적으로 MEF 피더 (그림 1A, F)가 유지 관리 및 공급 장치는 차별화 전에 제거됩니다. 분화 배지에서 EB를 (도 1b, G)는 ESC에 응집하면, EB를 형성 제는 마우스 세포주 (도 1C)에서 중배엽 분화를 향상 BMP4 티빈과 함께 처리된다. 형광 단백질 YFP / RFP (그림 1D)에 의해 식별는 ESC는 심장 계보로 분화된다. 클릭당 비용 (CPC) (그림 1H) FACS 정제 및 심근 세포 및 평활근 세포로 분화하는 것이 더 배양 하였다. cTnT의 MHC-SM과의 염색 심근 및 평활근 세포 (그림 1 E, I, J)의 CPC로의 분화 능력을 보여 주었...

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

이 절차의 전반적인 목표는 배아 줄기 세포에서 인간 또는 마우스 심장 전구 세포를 생성하는 것입니다. 이는 고품질 배아 줄기 세포 또는 e ESC 또는 마우스 배아 영양 세포 또는 신화에서 첫 번째 배양에 의해 이루어집니다. 두 번째 단계에서, 세포는 첫 번째 배아체의 형성을 촉진하기 위해 젤라틴으로 코팅된 페트리 접시로 옮겨집니다.다음으로, 세포가 결합되고 성장 인자를 배양물에 첨가하여 두 번째 형태의 배아체를 유도합니다. 마지막 단계에서는 배아체를 다시 해리하고 생성된 세포를 추가 성장 인자로 처리합니다. 궁극적으로, 심장 자손 세포는 심근 세포와 평활근 세포 분화를 위해 추가로 배양될 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 가장 좋은 심인성 잠재력을 가진 세포를 선택할 수 있도록 각 세포주의 분화 효율을 테스트하는 것이 중요합니다. 이제 실험실의 박사후 연구원인 Inland Lamb 박사는 마우스 배아체에서 심장 전구 세포 분화를 유도하는 절차를 시연할 것입니다.세포가 90% 유창해질 때까지 ESC 배지에서 마우스 e ESC 또는 MES를 배양하는 것으로 시작합니다. 다음으로, DPBS에서 세포를 세척한 다음 섭씨 37도에서 0.25% 트립신 0.4밀리리터와 5% 이산화탄소로 분리합니다.5분 후, 1ml의 예열 배지를 첨가하여 효소 반응을 중단시킵니다. 200배 G 및 실온에서 5분 동안 세포를 스핀다운한 다음 1ml의 ESC 배지에 세포를 재현탁합니다. 세어 난 후, 젤라틴으로 코팅 된 플레이트에 세포를 3 배 10의 밀도로 섭씨 37 °C와 5 % 이산화탄소에서 센티미터 당 4 개의 세포로 매일 매체를 바꿉니다.세포가 공동 유창성에 도달하면, 방금 설명한 것처럼 트립신으로 세포를 분리하십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 분화에서 6 개의 ESC에 10을 곱한 배양하십시오. 첫 번째 배아 몸체 응집을 위해 섭씨 37도에서 낮은 박리 페트리 접시의 배지.배아체 형성 2일 후 배아체를 50ml 튜브와 원심분리기로 옮깁니다. 세포는 칼슘과 마그네슘이 없는 10ml의 DPBS로 펠릿을 헹구고, 섭씨 37도에서 1ml의 트립신으로 배아체를 분리한다. 5분 후 4.5ml의 분화로 반응을 중지합니다.배아체를 단일 세포 현탁액으로 해리하기 위해 위아래로 중간 피펫팅. 그런 다음 또 다른 원심분리 후 1밀리리터의 배지에 세포를 재현탁시키고 2배 10으로 희석하여 계수하고, 6개의 세포를 1점으로 10 밀리리터당 5개의 세포

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

배우세요 배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포를 유도하는 방법을. 형광 리포터와 유세포 분석을 활용한 세포 농축 기법으로 재생 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

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