Name: 인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 학습하세요 인간 근육 생검에서 CD56 면역자기 분류를 이용한 근원세포와 섬유아세포 분리법. 이 기술은 높은 수율과 생존율로 세포 운명 결정 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술적 도움을 준 Carl Hobbs와 Lindsey Majoram, 현미경 시설을 사용한 Pat Doherty 교수에게 감사를 표합니다. Agley 박사는 King's College London의 학생 후원을 받았습니다. Spurrell Trust의 자금 지원도 인정됩니다.

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<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
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<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
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<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 근육 생검 재료의 작은 샘플에서 인간의 근육 유래 전구 물질의 선택적 농축에 대한 immunomagentic 정렬 절차를 설명했다. 이 기술은 섬유 아세포에 인간의 근육에서 파생 된 문화의 손실을 극복하기 위해 우리 실험실에서 매우 귀중뿐만 아니라 근육 유래 전구 세포의 고유 한 인구의 독특한 행동을 이해했다. 일단 정제 된 근육 조직 세포는 단백질 및 / 또는 유전자 발현의 변화를 조사 또는 하류 실험에 사용될 수있다. 형광 현미경에서 현미경에 대한 관심의 특정 지역을 분석하는 신속하고 간단한 방법 우리 또한 세부 세포 정화뿐만 아니라. 형광 현미경에서 디지털 이미지는 세포 생물 학자들이 추출하기위한 풍부한 정보를 포함하고; 실제로 픽셀은 반드시 인간의 눈에 철로되지 않은 데이터를 보유. 이 기술은 정량적 데이터에 대해 다수 얻을 수있다<html> 인구 각 셀의. 유동 세포 계측법에 비해 화상 해석의 독특한 특징은 셀 형상 orcell - 세포 상호 작용의 변화에​​...

골격근의 수선과 재생은 위성 셀 1, 근육 조직 줄기 세포 2,3-.의 작업이 필요한 생체 이들 세포는 모든 myofibre의 sarcolemma 및 기저판 사이에 가역적으로 정지 상태로 존재하지만, 증식 활성화 될, 퓨즈 및 근육 조직으로 분화가 손상 수리 (3)를 다시 생성됩니다. 위성 세포는 소화 효소 (4)를 사용하는 젊은 노인 인간의 근육 생검 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 될 수는 이후 차 문화 (5)에서 공부하실 수 있습니다. 세포 집단 모두 수율 및 순도에 따른 본 분리 공정의 효율은 사용 된 방법에 따라 샘플들과 다를 수있다. 소화 효소에 의한 두 가지 종류의 세포 부착은 CD56 + / 최근 desmin 세포, 및 MU 당초 식별 위성 세포 (이제 지칭 근원 성 근육 세포 또는 전구 세포), 아르scle 유래 CD56으로 식별 섬유 아세포, - 그리고 TE7 + 셀 (5). 섬유 아 세포는 빠른 증식 속도를 가지고 있으며, 근원 세포와 같은 세포 - 세포 접촉시 돌이킬 수없는 성장 정지 및 터미널 차별화를받지 않는다 따라서 혼합 된 인구에, 섬유 아세포 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 섬유 아세포는 종종 있지만, 자신의 권리 연구의 가치 세포와 같은 섬유 아세포에 대한 관심은 그들이 근육 수리 (6) 동안 근육 조직 세포와 협력 역할을하는 것으로 나타났다 특히로서, 지금이, 근육 생물학에 대한 자극으로 간주되어왔다 . 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 배양 따라서 두 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 세포를 추후 연구 정렬 할 수있는 방법 및 / 또는 계산 및분석 하였다. FACS 확실 인간 근원 성 세포를 풍부하게 도시되었지만, 후속 배양을위한 세포의 수율이 높은 7 지금까지 없었다. 이러한 노화 4와 관련된 위성 세포 유래 근육 조직 세포와 매우 가난한 증식과 분화와 같은 체세포의 제한된 복제 가능성을 감안할 때, 더 부드러운 접근이 필요하다. 단일 근육 섬유의 문화는 또 다른, 덜 공격적, 자신의 sublaminal 틈새와 문화 8,9에서의 활성화 후 여전히 상주 쥐의 위성 세포를 얻는 수단 제공합니다. 그러나,이 기술은 인간의 근육 유래 세포 연구에 관심이 많은 연구소에 액세스 할 수 없습니다 것을 의미한다 (섬유가 거의 건에 건에서 얻을 수 없으므로) 인간의 근육 생검 재료에서 가능하지 않은 경우가 종종있다. 또한, 단일 섬유 기술은 매우 제한된 세포 수를 제공합니다. 여기에서 우리는 세대에 따라 정렬 시스템을 설명TLE 효소 콜라게나 제를 사용하여 세포의 소화는 자기 활성화 된 셀의 두 개의 연속 라운드 분류 고순도 (&gt; 95 %, 근원 세포) 및 수율 (~를 모두 제공 (MACS) 다음 디스 파제 2.8 × 10 6 ± 8.87 × 10 5 세포 / 문화 실험 g 조직). CD56은 동일계 10 및 11에서 인간 체외 위성 세포의 식별을위한 표준 금 표면 마커 간주 비드 부착 이상적인 표면 마커 후보를 제공한다. 이 방법에서는 CD56 항체는 산화철 및 폴리 사카 라이드 - 함유 상자성 비드 강한 자계 (12, 13)에 배치 된 고 구배 자기 세포 분리 컬럼을 통해 세포에 결합 및 통과에 접합된다. 분리 컬럼은 강한 자계 구배 (~ 4tesla)을 생성하는 그 표면을 향해 자력선을 집중시키는 역할을 강자성 스틸 울 또는 철 분야의 행렬로 채워진다 14. 이 컬럼에서 조금이라도 자기 세포는 매력과 표면 (14)에 흡착. 언 바운드 (CD56 -) 자기 마이크로 비드으로 표시 CD56 + 세포가 자기장 12,15에서 제거 될 때까지 유지되는 반면 세포는 칼럼을 통해 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액은 상기 실험을 위해서, 원하는 밀도로 도금 될 수있다. 세포 성분은 면역 세포 화학을 사용하여 식별 될 수 주어진 개입 이어 넓은 필드 또는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 묘화하고 주어진 이미지의 모든 표지화 된 세포의 신속한 대물 측정이 가능 화상 해석 방법을 이용하여 정량적으로 분석 하였다. 근육 조직 세포 반면, 인간의 섬유 아세포가 쉽게 지방 세포에 transdifferentiate - 우리의 실험실에서 우리는 CD56을 설명하기 위해 영상 분석 (16) 다음이 이중 면역 자기 정렬 방식을 사용했다위성 기원의이 지방 세포 변환 5 뛰어납니다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐분해효소&nbsp; D</td><td>로슈&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>사용 전에 필터 멸균해야 합니다</td></tr>. <tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>(Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; m 세포 여과기</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 용액 (0.1% 아세트산에 3 mg/ml)</td><td>Sigma, Dorset, UK</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 주사기 필터(0.2 &#956; m)</td> <td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 멤브레인</td></tr><tr><td>CD56 인간 마이크로 비즈</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>마이크로 비드의 제한된 유통 기한에 유의하십시오</td></tr><tr><td>Anti- fibroblast Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>대형 세포 Collumns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>이 컬럼은 흐름 저항기와 함께 제공됩니다. 여기에 설명된 높은 근육 생성 순도를 얻기 위해 흐름 저항기를 사용할 필요는 없습니다.</td></tr><tr><td>LS 열&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Seperator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>이 분리기는 대형 세포 컬럼에는 맞지만 LS 컬럼에는 맞지 않습니다.</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi 생명공학&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS 멀티스탠드</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td></td><td>사용 전에 필터 멸균해야 합니다</td></tr>. <tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸 포스페이</td>트 <td>시그마</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>왓맨 페이퍼</td><td>시그마</td><td>Z241121-1PAK</td><td>42번, Ashless. 필터를 준비하려면 원형 여과지를 접어 반원을 만든 다음 반원을 다시 반으로 접어 원뿔 모양을 만듭니다. 필터링을 위해 원뿔을 깔때기에 맞춥니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade 시약</td><td>분자 프로브, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>이 제품은 DAPI와 함께 또는 DAPI와 함께 구입할 수 있으며 초기 형광을 소멸시키지 않습니다.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Contact Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe(Pugh Computers에서 구입)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

수리 및 골격 근육의 재생은 상주 근육 줄기 세포 인 위성 세포의 작용을 필요로한다. 이러한 문화에서 공부 인간의 근육 생검 소화 효소를 사용하여 샘​​플과 근육 조직 특성에서 분리 할 수​​ 있습니다. 정량적으로, 소화 효소에 의한 두 가지 점착성 세포 유형이있다 : (ⅰ) 위성 CD56 +로서 처음 확인 된 세포 (이라, 근원 세포 또는 근육 전구체 세포), 및 나중에 CD56 + / 최근 desmin + 세포와 같은 (II) muscle- 과 TE-7 + - CD56으로 식별 파생 섬유 아세포. 섬유 아세포 문화에 매우 효율적으로 증식 및 혼합 세포 집단에서 이러한 세포는 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 따라서 배양 중 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 여기에서 우리는 DESCR모두 고순도 (&gt; 95 %, 근원 세포)과 좋은 수율 (~을주는 콜라겐을 사용하여 세포의 부드러운 소화 효소에 따라 정렬 및 자기 활성화 된 셀 정렬 (MACS) 다음 디스 파제의 시스템을 IBE 2.8 × 10 6 ± 8.87 문화 실험에 대한 시험 관내 7 일) 후 × 10 5 세포 / g 조직. 이 방법은 CD56에 대한 항체에 접합 된 마이크로 비드, 자기 비드와 혼합 된 근육 유래 세포 집단을 배양하고 자기장 비록 세포 전달에 기초한다. 마이크로 비드에 결합 된 CD56 + 세포는 CD56 반면 ​​필드에 의해 유지됩니다 - 세포는 칼럼을 통해 방해받지 않고 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액을 도금하여 배양 할 수있다. 주어진 개입, 세포 형태 및 식 핵 전사 인자를 포함한 단백질의 위치 파악을 수행하면 특정 항체 및 화상 (p)과 면역 형광 표지를 사용하여 정량화 할 수있다세 싱 및 분석 패키지.

정제 된 근육 조직 세포와 섬유 아세포는 지방 조직에 대한 자신의 잠재력을 평가하기 위해 어디 7-30 사이의 일에서 지방 세포 영양 매체 다음 사흘 동안 지방 세포 분화 배지에서 배양 할 수있다. 정제 된 세포 집단을 사용하여, 지방 세포와 근육 조직 계보 마커에 대한 면역 염색과 함께 오일 레드 O 염색은 섬유 아세포 비율이 지방 세포 분화 (그림 2) 할 수있는 것으로 나타났다. 섬유 아세포에 의한 지방의 대규모 축적은 육안 (패널 A)에 표시하고, 자신의 완전한 분화는 핵의 PPAR γ (그림 2 패널 B &amp; C와 그림 3)의 매우 강한 표현으로 표시됩니다. 십오일 처리에 의해, 이들 세포는 그들의 기판 상으로 TE -7- (결합 조직 항원) 나머지 (패널 D)를 발표했다. 대조적으로, 근육 조직 세포는 최근 desmin과 무거운 미오신의 표현을 포함하여 정상 표현형을 유지체인 (그림 2 패널...

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 근육 생검 샘플에서 얻은 두 개의 주요 세포 집단을 높은 효율과 수율로 분리하여 특정 표현형 및 전사 인자 마커를 평가할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 두 번째 단계에서 인간 근육 생검 샘플을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 달성됩니다. 7일간의 배양 후, 세포는 근육 세포인 CD 56 양성 분획과 섬유아세포인 CD 56 음성 분획으로 분류되는 면역 자기 비드에 의해 분리됩니다.그런 다음 세포를 염색하고 원하는 표현형 및 관심 단백질 마커에 대해 이미지화합니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사와 정량적 이미지 분석을 사용하여 분류된 세포 집단 내에서 선택된 핵 국소 전사 인자의 강도를 측정할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류와 같은 기존 방법에 비해 면역 자기 세포 분류를 사용하는 이 기술의 주요 장점은 부드럽고, 높은 수율과 생존력으로 인간 1차 근육 세포를 탁월하게 분류할 수 있으며, 빠르게 수행할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 노화에서 관찰되는 섬유 지방 근육 퇴행의 세포 기초에 대한 우리의 이해를 높이는 방향으로 확장되며, 생검을 얻은 후 가능한 한 빨리 근육 유래 전구 세포를 분리하기 위해 여러 근육 병리학에서 확장됩니다. 먼저 조직 샘플의 무게를 결정한 다음 기저 매체에서 근육을 여러 번 부풀어 올려 샘플에서 과도한 혈액을 씻어냅니다. 근육이 실온에서 30-60초 동안 침전되도록 한 다음 튜브에서 마지막 2-3밀리리터의 배지를 제외한 모든 것을 흡인합니다.다음으로, 튜브를 멸균된 페트리 접시에 뒤집어 남은 액체가 근육을 접시로 운반할 수 있도록 합니다. 이제 명백한 지방 또는 결합 조직의 눈에 보이는 조각이 있는지 샘플을 청소하십시오. 그런 다음 접시를 회전시켜 남은 매체를 동원한 다음 모든 매체를 흡인하고 조직 100-400mg당 1개의 콜라겐 분해 효소 및 디스 효소 용액 3밀리리터를 추가하고 근육 샘플을 매우 작은 1-2mm 입방체 조각으로 자릅니다.샘플이 충분히 다진 경우. 넓은 멧돼지 25ml 피펫을 사용하여 조직 조각과 효소 용액을 멸균된 10-20ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 추가로 3ml의 효소 용액으로 플레이트를 세척한 다음 10ml 피펫을 사용하여 남아 있는 근육 조각을 튜브로 옮깁니다.튜브를 섭씨 37도에서 60분 동안 놓습니다. 10ml 피펫으로 15분마다 조직 현탁액을 재충전합니다. 그런 다음 적어도 동등한 양의 신선한 재가열된 성장 배지로 효소 해리를 종료합니다.다음으로, 100마이크로미터 필터에 셀 현탁액을 통과시켜 큰 파편을 제거한 다음 세포 재생을 원심분리합니다. 펠릿을 7-8 밀리리터의 성장 배지에 현탁시킨 다음 코팅되지 않은 T 25 조직 배양 플라스크에서 세포를 배양합니다. 섭씨 37도, 7일 동안 5%의 이산화탄소.주말에 트립신은 3분 동안 세포 단층을 주시합니다. 세포가 분리되면 5-10ml의 골격근 성장을 추가하고, 과잉 소화를 방지하기 위해 중간을 추가하고 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 계수 후 세포 계통 마커 특성화를 위해 일부 세포를 예약하고 나머지 세포를 15ml의 PBS 원심분리기 게인으로 세척합니다.이번에는 펠릿을 170마이크로리터의 실온, 최대 분류 버퍼, 피펫에 다시 부유시켜 부드럽게 소생시킵니다. 35 마이크로리터의 잘 혼합된 anti CD 56 항체 접합 자성 마이크로 비드에서 세포를 현탁시킵니다. 세포 용액을 피펫으로 몇 번 혼합하고 부드러운 식물과 함께 섭씨 4도에서 15 분 동안 혼합물을 배양합니다.배양 후 중간 지점에서 세포와 비드 용액을 10ml의 분류 완충액 원심분리기와 reus로 세척합니다. 펠릿을 1ml의 새로운 분류 버퍼에 현탁시킵니다. 다음으로, pres 분리 필터와 컬럼을 500마이크로리터의 소싱 버퍼로 윤활합니다.그리고 그 때 즉각 pres 별거 여과기를 통해서 그리고 란으로 세포 현탁액의 전체 1 밀리리터를 섞고 옮기고, 소량의 성장 매체를 포함하는 메마른 50 밀리리터 원뿔 관으로 란을 통과해, 비 보유 섬유아세포 조각을 모으는 sourcing 완충기 힘 세척의 1 밀리리터로 란을 3 번 헹굽니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 플런저를 컬럼 상단으로 눌러 CD 56 양성 세포 분획을 수집합니다. 따뜻한 성장을 포함하는 별도의 50ml 원추형 튜브에서 이 단계에서 중간 성장 배지가 방출됩니다.이중 분류를 수행해야 하는 경우 수집된 양수 및 음수 세포 분획을 고려하십시오. 추가 순도를 위해 이중 소싱이 필요한 경우, 1차 분류에서 CD 56 포지티브 콜렉션 튜브에 배지를 배치하지 말고 적절한 실험 종말점에서 필터 및 컬럼 윤활부터 시작하는 단계를 반복합니다. CD 56 양성 세포 배양액을 배양 배지에 고정하고 동일한 양의 얼음처럼 차가운 8% 파라 포름알데히드를 사용합니다.10분은 온화한 초목과 함께합니다. 그런 다음 고정제를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 세포 표면 항원을 면역 염색합니다. PBS의 1%BSA에서 최소 1시간 동안 세포를 차단한 다음 해당 세포에 관련 1차 항체 및 2차 항체를 표시합니다.검출기를 최적화하고, 현미경 및 염색과 관련된 레이저 출력 및 노출 설정을 얻습니다. 이미징하기 전에 세포는 원하는 수의 검출 채널과 6개 이상의 서로 다른 시야에서 세포의 이미지를 촬영합니다. 분석을 위해 적절한 TIFF 이미지 파일을 열고 이미지를 서로 드래그하여 적절한 해당 채널을 오버레이합니다.각 채널은 레이어 패널에 별도의 레이어로 나타납니다. 그런 다음 분석 창에서 데이터 포인트 선택을 선택한 다음 사용자 지정을 선택하고 원하는 측정값을 선택합니다. 핵 형광 강도를 분석하려면 색상 범위 대화 상자를 열고 드롭다운 메뉴에서 샘플링된 색상을 선택합니다.그런 다음 Shift 키를 누른 상태에서 레이블이 지정된 핵에 특정한 톤을 선택합니다. 저장을 클릭하여 동일한 세션에서 선택한 다른 이미지와 함께 사용할 수 있도록 이 색상 범위 선택 마스크를 저장합니다. 핵이 선택되면 click을 쓰고 fill을 선택합니다.그런 다음 드롭다운 메뉴에서 검은색을 선택하고 불투명도가 100%로 설정되어 있는지 확인합니다.그런 다음 선택 및 반전을 클릭합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 채우기를 다시 선택하고 드롭다운 메뉴에서 흰색 채우기를 선택합니다. 유역 알고리즘을 수행하여 현재 이진 핵층에서 부분적으로 겹치는 핵을 분리합니다.선택한 다음 색상 범위를 선택한 다음 그림자를 선택하여 분리된 개별 핵을 선택합니다. 그런 다음 원하는 마커의 16비트 그레이 스케일 이미지가 포함된 레이어로 선택 영역을 전송하고 측정값 기록을 클릭합니다. 마지막으로, 선택한 측정값을 추가 오일 처리를 위해 적절한 분석 소프트웨어에 텍스트 파일로 내보냅니다.지방생성 및 근육생성 계통 마커에 대한 면역 염색과 함께 정제된 세포 집단을 적색 염색하면 섬유아세포 분획만이 육안으로 볼 수 있는 섬유아세포에 의한 다량의 지방 축적과 함께 후성적 분화가 가능함을 보여주며, 치료 15일째까지 이러한 세포에 의한 핵 PPAR 감마의 강력한 발현에 의한 완전한 변형을 추가로 입증합니다. 이 세포는 기질에 남아 있는 TE 7 A 결합 조직 항원을 방출합니다. 대조적으로, 근육 세포는 핵 PPAR 감마 발현의 상향 조절 없이 desmin 및 myosin heavy chain의 발현을 포함하여 정상적인 표현형을 유지합니다. 이 그림에서는 Desmond 양성 근육 세포 필드의 정량적 분석과 이러한 데이터를 얻은 필드가 이 특정 시딩 밀도 및 시점에서 개별 핵의 근육 발현 변화를 보여주는 것으로 표시됩니다.이 그래프에서는 세포 수준별로 세포의 서로 다른 세포 유형에서 전사 인자 수준을 직접 비교하는 방법의 유용성이 입증되었습니다. 예를 들어, 이러한 CD 56 음성 근육 섬유아세포는 높은 수준의 핵 지방생성 전사 인자인 PPAR 감마를 발현하는 반면, 분류된 CD 56 양성 근육 세포는 지방 세포 유도 배지에 노출된 후 매우 낮은 수준의 핵 수용체 전사 인자만 유지합니다. 이 기술을 통해 근육 생물학 분야의 연구자들은 건강하거나 병리학적인 인간 근육 샘플에서 세포 운명 결정 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 첫째, 정제되고 잘 특성화된 인간 근육 유래 세포를 높은 수율로 얻는 방법과 둘째, 면역형광 염색으로 식별된 세포 성분에 대한 객관적인 정량 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다.  이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다.  전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다.  이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

학습하세요 인간 근육 생검에서 CD56 면역자기 분류를 이용한 근원세포와 섬유아세포 분리법. 이 기술은 높은 수율과 생존율로 세포 운명 결정 연구에 활용됩니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

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