빠른 형광 현장에서 하이브리드 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 면역 형광과 결합된 빠른 형광 현장 교잡화를 사용하여 X 염색체 불활성화 동안 긴 비코딩 존재, RNA 및 관련 후성유전학적 변형의 역학을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 분화된 배아 신체 세포가 있는 슬라이드의 시토신 준비를 필요로 하며, 이 세포는 투과된 다음 염색을 위해 고정됩니다. 다음으로 히스톤 H 3 트리메틸 라이신 27에 대한 항체에 의해 국소화된 형광 마커가 비활성 X 염색체에 축적됩니다.

마지막 단계는 5개의 프라임 아미노 변형을 포함하고 AM 평균 반응성 형광단이 존재한다는 것을 나타내는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용합니다. RNA 물고기. 궁극적으로 형광 현미경은 E Es 세포 분화 중 존재하는 RNA 구름 및 히스톤 변형의 국소화를 보여주는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 플루오로 4로 표지된 여러 개의 고유한 올리고뉴클레오티드를 사용한다는 것입니다. 이를 통해 트랜스 특이적 검출을 통해 배경을 줄일 수 있으며, 핵에 대한 침투를 증가시키고 신호의 강도를 높이거나 향상시킵니다. 또한 프로브의 농도를 높이면 이 면역 어류 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

이 방법은 비활성 ex 염색체에 존재하는 RA의 국소화와 관련 염색체 변형에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 RA 검출을 위한 다른 생물학적 시스템에 적용할 수 있으며 관련 후성유전학적 변형, 핵 국소화 및 세대 간 조절과 관련이 있습니다. 프로브를 먼저 준비하기 위해, 용융 온도가 섭씨 63-65도이고 존재하는 RNA 및 A 5 프라임 아미노 변형에 대한 고유한 안티센스 서열을 포함하는 여러 개의 20-30 뉴클레오티드 길이 올리고를 얻습니다.

이러한 올리고를 총 4.5마이크로그램의 DNA에 대해 다양한 올리고의 등몰 양의 순수한 물에 현탁시킵니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 올리고에 올리고 라벨링 다음에 am mean 반응성 형광 염료로 라벨을 붙입니다. G 25 열을 통과시킵니다.

그런 다음 에탄올과 아세트산 나트륨을 사용하여 올리고를 침전시킵니다. 이를 위해서는 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 한 후 섭씨 4도에서 21,000G를 회전해야 합니다. 다음으로, 세척 후 펠릿을 70% 에탄올로 한 번 세척합니다.

Resus는 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물 또는 트리스 EDTA에 올리고를 10마이크로몰 DNA의 최종 농도로 현탁시킵니다. 이로 인해 프로브 원액이 프로브를 사용하여 혼성화 완충액에서 250 나노 몰로 재농축됩니다. 먼저 6개의 웰 접시에서 자라는 ES 또는 EB 분화 세포를 웰에서 배양 배지를 흡인하고 실온에서 세포를 세척합니다.

PBS는 PBS를 철저하게 흡인합니다. 다음으로, 각 웰에 0.5ml의 트립신 용액을 추가하고 플레이트를 5-10분 동안 배양합니다. 각 웰에 5ml의 배지를 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 트립신 반응을 멈춥니다.

그런 다음 세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 이제 실온에서 200Gs로 5분 동안 셀을 스핀다운하고 모든 상층액을 제거한 다음 2밀리리터의 PBS에 세포 팔레트를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세고 현탁액을 400, PBS의 밀리리터 당 000 세포로 희석하십시오.

이제 각 슬라이드를 필터 카드, 챔버 및 클립으로 조립합니다. 필요한만큼 만들고 cyto spin의 로터에 배치하십시오. 각 슬라이드에 250마이크로리터의 셀 현탁액을 추가하고 실온에서 10분 동안 1500RPM으로 슬라이드를 회전시킵니다.

그런 다음 perme하고 수정하십시오. 먼저, 헹굼 단계로 5분 동안 슬라이드를 얼음처럼 차가운 PBS로 빠르게 옮깁니다. 둘째, 슬라이드를 1분 동안 얼음처럼 차가운 CSK 버퍼로 옮겨 팽창시키고 세 번째로 슬라이드를 CSKT 버퍼로 5분 동안 이동하여 세포를 침투시킵니다.

넷째, 얼음처럼 차가운 CSK 버퍼로 세포를 1분 동안 세척합니다. 마지막으로 PBS의 실온 4% 파라폼 알데히드에서 10분 동안 고정합니다. 먼저 PFA 용액에서 슬라이드를 제거합니다.

그런 다음 PBST가 있는 코플랜 용기에 몇 초 동안 옮긴 다음 비스듬히 놓아 배수합니다. 다음으로, 팁 홀더 인서트 아래에 물이 담긴 빈 피펫 팁 상자를 넣습니다. 그런 다음 슬라이드의 뒷면을 닦아내고 이 상자로 옮깁니다.

이제 각 슬라이드에 40마이크로리터의 차단 용액을 오버레이하고 커버 슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮습니다. 벤치에서 10분 동안 상자 안에서 배양하게 합니다. 그런 다음 커버 슬립을 제거하고 슬라이드를 비스듬히 설정합니다.

이제 40마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가합니다. 커버 슬립을 교체하고 슬라이드를 30분 후 30분 동안 벤치에서 배양합니다. 코플랜 용기의 PBST에서 슬라이드를 두 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

부드럽게 흔들어 5분 동안 씻으십시오. 그런 다음 슬라이드를 비스듬히 되돌리고 PBST를 배수합니다. 그런 다음 슬라이드 뒷면에서 여분의 용액을 닦아낸 다음 슬라이드를 상자에 다시 넣습니다.

이제 각 슬라이드에 40마이크로리터의 1-500 2차 항체 용액을 적용합니다. 슬라이드 커버를 커버 슬립으로 덮고 앞으로 나오는 빛으로부터 보호된 벤치에서 15분 동안 배양하도록 합니다. 슬라이드는 항상 빛으로부터 보호되어야 합니다.

이전과 같이 PBST를 사용하여 항체를 제거한 다음 슬라이드를 비스듬히 설정하여 배수합니다. 면역형광을 수행할 때는 물이 담긴 상자를 섭씨 37도로 예열합니다. 슬라이드 뒷면의 세척 버퍼를 닦아낸 후 온도의 물이 담긴 피펫 팁 상자에 넣고 각 슬라이드에 500마이크로리터의 생선 세척 버퍼를 바릅니다.

5분 동안 부화시킵니다. 5분 후, 실온에서 작업 프로브의 8마이크로리터에서 각 슬라이드 옆의 슬라이드에서 용액을 흡입하고 커버 슬립을 적용합니다. 이제 슬라이드를 예열 슬라이드 상자로 옮기고 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 섭씨 37도의 코플랜 항아리에 담긴 생선 세척 버퍼에서 슬라이드를 목욕시킵니다. 일반적으로 몇 분이 걸리는 커버 슬립이 떨어지면 커버 슬립을 제거하고 슬라이드가 5분 동안 배양되도록 합니다. 그런 다음 슬라이드를 섭씨 37도에서 밀리리터당 0.5나노그램의 댕부진 얼룩이 있는 생선 세척 버퍼가 들어 있는 병으로 옮깁니다.

슬라이드를 이 용액에서 5분 동안 배양합니다. 이제 슬라이드를 섭씨 37도에서 5분 동안 두 개의 XSSC로 세척합니다. 마무리하려면 2 XSSC를 초과하는 경사 배수구에 슬라이드를 설정하십시오.

그것들을 닦아내고 dpi가 들어있는 4 마이크로 리터의 안티파 솔루션으로 장착하십시오. 빠른 면역 피쉬는 존재하는 RNA와 히스톤 변형의 국소화를 관찰하기 위해 사용되었습니다. 암컷 EB 세포가 존재할 때, RNA는 비활성화된 X 염색체의 전체 길이를 덮는 녹색 구름처럼 보입니다 이 세포에서 히스톤 H 3 트리메틸 라이신 27 변형은 빨간색으로 시각화되고 핵은 파란색으로 DPI에 의해 대조염색됩니다.

분화된 암컷 마우스 EB 세포는 분화 12일째에 처리하였다. 이때, 세포의 90 % 이상이 세포에 존재하는 구름을 보여주었습니다 핵 짧은 올리고 뉴클레오티드 프로브는 효율적으로 침투 할 수 있었고 거의 모든 히스톤 H 3 트리메틸 라이신 27 신호의 염색을 초래할 수 있었고 150 개의 핵에 존재하는 RNA 구름으로 존재하는 RNA 신호의 97 %는 이러한 메틸화 히스톤과 공동 국소화하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 기술을 마스터하면 5시간 이내에 완료할 수 있으며 약간의 준비 준비를 완료할 수 있습니다.

그를 위한 면역 면역 형광은 27년에 3 삼 분기이고 RA가 존재합니다. 우리가 적절하게 수행한다면, 이 면역 어류 프로토콜은 다른 RNA 후성유전학적 변형 및 관심 단백질에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 다른 생물학적 시스템에 적용하려면 몇 가지 최적화가 필요할 수 있습니다. 실험에 행운을 빕니다.