Name: 운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 고해상도 현미경 이미징을 위한 운모 지지 지질 이중층 준비 방법을. 광학 접착제를 사용하여 평평한 운모 표면을 노출시키고 30마이크로리터의 지질 소포만으로 고품질 이중층을 형성할 수 있습니다.

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1. 운모 및 슬라이드 준비 <ol><li> 장소 번호 1 ½ (0.17 mm)는 염색 랙에 커버 슬립. </li><li> 60 ° C에서 2 % 세제에 30 분 동안 초음파 처리 </li><li> 탈 이온수로 20 회 반복한다. </li><li> 집게를 사용하여 슬라이드를 제거하고 압축 공기 또는 질소를 사용하여 건조한다. </li><li> 운모 시트를 가위 또는 면도날을 사용하여 10 × 10mm 사각형 조각으로 잘라. </li><li> 면도날을 사용하여 2 ~ 3 얇은 전단지에 각 운모 조각을 잘라. 참고 :이 단계는 날카로운 칼날의 사용을 필요로합니다. </li></ol> 2. 운모 조립 및 장착 상공 회의소 <ol><li> 에탄올로 청소 현미경 유리 슬라이드. </li><li> 광학 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 단계 1.6 절단 운모의 접착제 전단지. 낮은 점도의 접착제가 더 강하를 확산하고 운모를 접착하는 것이 좋습니다. </li><li> , UV 램프에서 10 분을 치료. NOTE : 접착제는 350 ~ 380 ㎚의 범위에서 최대 흡수 및 requ의 추천 에너지로 UV 광에 의해 경화된다전체 치료를위한 IRED 4.5 J / ㎠이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. </li><li> 스카치 테이프로 처음 몇 층을 제거하여 깨끗한 운모 표면을 노출. </li><li> 운모 표면에 광학 접착제의 작은 방울 (~ 20 μm의)를 배치합니다. 참고 :이 단계에서, 낮은 형광도 수준 높은 점성 접착제를 권장합니다. 우리의 경험은 낮은 (2.2 단계) 고점도 접착제의 조합을 사용하는 운모 분할 상당히 효과 (단계 2.7)을 증가 시킨다는 것을 보여 주었다. </li><li> 조심스럽게 기포를 방지, 접착제의 하락에 갓 청소 커버 슬립을 배치, 1 분에 정착 할 수 있습니다. </li><li> , UV 램프에서 10 분을 치료. NOTE :이 단계 후에, 유리 슬라이드, 운모 및 커버 슬립의 샌드위치 (몇 주까지) 시간의 비교적 긴 기간 동안 저장 될 수있다. 운모 표면이 신선한 확인하기 위해, 단지 실제 SLB 준비하기 전에 다음 단계로 진행합니다. 참고: 접착제가 380 ㎚ ~ 350의 범위에서 최대 흡수와 완전 경화에 필요한 에너지를 추천 UV 광에 의해 경화된다 4.5J/cm는 2이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. </li><li> 비디오 같이 exacto 칼을 사용하여 부드럽게 측 유리 슬라이드에서 커버 슬립을 분리. 대부분의 경우에, 운모의 얇고 편평한 층은 커버 슬립에 연결된 상태로 유지된다. (단계 2.4에서 반복) 재사용 할 수 운모 유리 슬라이드에 부착. </li><li> 운모 층이 여전히 커버 슬립에 접착되는 단계 2.8 분할시 완전히 제거되지 않았 음을 확인하기 위해, 육안으로 또는 해부 현미경으로 표면 품질을 확인합니다. 집게에 작은 상처를 만들거나 바늘을 해부하는 것은 운모에서 검출 가능하게 다른 일관성이있는 접착제를 구별하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑의 고무 패킹을 제거하고 광을 사용하여 표면에 거꾸로 뚜껑을 접착제접착제 또는 매니큐어 및 UV 램프를 치료, 또는 공기는 각각 10 분을 건조 할 수 있습니다. 참고 : 샘플 AFM 이미징과 동시에 광 (TIRFM 또는 공 초점)을 준비하는 경우, 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑을 현미경 무대에 AFM 헤드 마운트 너무 작은 수 있습니다. 그 경우, 캡 AFM 헤드 장착에 적합한 큰 직경을 갖는 임의의 플라스틱 O-링에 의해 치환 될 수있다. 실험 운모 표면을 손상시키지 않고, 캡을 제거 요구의 경우, 실리콘 그리스 대신 접착제 또는 매니큐어 사용될 수있다. </li></ol> 3. 지원되는 지질 이중층 (SLB) 형성 <ol><li> 면에 실에 새로 제조 된 리포좀 솔루션을 놓습니다. SLB 형성에 필요한 최소 볼륨 ~ 30 μL입니다. 참고 : 리포좀 및 SLB 형성에 대한 자세한 내용은, 예컨대 가방 등 한 출판 프로토콜을 참조 2014 년 15.. </li><li> 원하는 프로토콜을 사용하여 SLB 형성을 진행합니다. 부화 중이미징, 챔버는 열 블록 또는 용융 온도 이상으로 사용되는 지질을 유지하는 데 필요한 온도를 유지하기 위해 가열 현미경 단에 배치 될 수있다. </li></ol>

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이 프로토콜은 지질 이중층 증착 및 고해상 이미징 부드럽고 얇은 운모 표면의 제조 방법을 설명한다. 기술은 주로 고품질 운모 표면을 얻기위한 중요한 유리 운모 - 유리 샌드위치 (단계 2.8)의 세세한 제외에 한정되는 최소한의 수동 기술을 필요로한다. 운모는 클 리빙없이 광학 접착제에서 분리하는 것이 가능하기 때문에 갓 절단 운모의 검사는 항상 광학 접착제의 노출 된 영역을 남기고,이 시점에서 필요하다. 즉, 접착제 대신에 운모의 이중층의 원치 않는 증착 될 수 있습니다. 운모 표면은 몇 가지 예외가 우리가 얻어진 균일하게 높은 광학 이미징 품질로 볼때, 커버 슬립의 표면에 평행하여 기재 한 방법은 사용하여 제조; 따라서 우리는 추가 검증을위한 필요성을하지 않았다. 챔버 설치의 마지막 단계는 사용자 정의 할 수 있습니다. 비디오 튜토리얼을 보여줍니다챔버로 사용되는 1.5 ㎖의 유리 병 플라스틱 캡은, 그러나이 유사한 모양의 개체를 원하는 크기로 대체 할 수있다 홀더와 샘플 A...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 원자 힘과 결합 될 수있는 광학 전반사 형광 현미경 (TIRFM) 또는 공 초점 현미경을 이용한 운모지지 지질 이중층 (SLB 수)의 고해상도 영상화 운모 표면의 제조 방법을 도시하는 것이다 현미경 (AFM). 유동화 증권 지질 클러스터링, 상 분리, 펩티드, 단백질 또는 다른 화합물 1-5 이중층 구성 요소 또는 상호 작용의 역학의 수많은 연구를위한 널리 사용되는 모델입니다. 다른 기판은 SLB 형성 연구 4,6-8의 특성에 따라 (즉, 유리, 운모, 이산화 규소, 중합체)에 사용될 수있다. 분리막 연구는 TIRFM 및 AFM 같은 현미경을 기반 영상 기술에 의존하고 있습니다. 유리는 투명하기 때문에 이에 TIRFM 이미징, 유리 표면은 일반적인 선택이다. 유리의 제조가 비교적 용이하고, 결과의 품질은 주로이전에 지질 소포의 증착 청소 철저한 표면에 의해 결정된다. 높은 축 방향의 해상도에 의한 AFM은 운모 표면을 필요로한다. 운모는 완벽한 기초 분열 부근으로, 규산염 광물이다. 따라서, 갓 절단 운모 심지어 서브 - 나노 미터 스케일 (9)에 막 고저차의 관찰을 허용, 원자 적으로 평면이다. 이러한 형광 상관 분광법 (FCS), 추적 단일 분자 (SMT) 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 방법을 사용하여 확산 연구는 지질 막 역학들이 퇴적되는에 표면의 유형, 이에 유리에 크게 의존하지만 보여 주었다 운모는 매우 다양한 결과 10, 11를 줄 수 있습니다. 이러한 차이는 멤브레인 프로브의 확산 계수뿐만 아니라, 서로 다른 속도로 확산 입자의 분리 된 집단의 검출 및 가능한 다른 상태 사이의 전환뿐만 있습니다. 따라서,동일한 표면 (이 경우 운모에) 사용되지 않는 TIRFM 및 AFM 기술을 사용하여 얻어진 결과의 직접적인 비교가 종종 문제가된다. TIRFM 및 AFM 이중층 이미징이 같은 운모 표면 (12, 13)에 실시 된 일부 연구가 있지만, 운모는 거의 대부분 때문에 처리 문제, 광학 현미경에 사용되지 않습니다. 운모 준비는 광학 접착제 (12)를 사용하여 커버 슬립에 붙어있다 얇은 전단지,에 손으로 절단을 필요로한다. 그러나이 방법은 만족스러운 결과를 달성하기 위해 연습이 필요합니다. 더욱이, 얻어진 표면은 그들 어려운 낮은 작동 거리, 높은 개구 수 렌즈를 사용할 수 있도록, 흔히 물결 두껍다. 이 프로토콜에 기술 된 바와 같이 제조 된 운모의 표면은 매우 얇은 (170 μM의 coverslip에 두께를 포함하여 ~ 220 μm의) 매우 평면, 성공 고해상도 이미징을위한 중요하다 &quot;파상&quot;를 피하는. 그들은 사용될 수있다TIRFM 또는 공 촛점 설정하십시오. 또한, 동일한 시료를 AFM에 전달 될 수 있고, 심지어 TIRFM / 촛점과 AFM과 동시에 이미지화. 이러한 두 가지 기술을 결합하면 이중층 막 구조물 (14)과 확산 거동의 직접적인 상관 관계를 허용한다. 운모 표면이 갓 절단되어 있기 때문에, 그들은 깨끗하고 (유리 청소 프로토콜은 일반적으로 같은 피라니아 솔루션, 황산, 나트륨 / 수산화 칼륨 등 화학 물질을 포함한다) 시간이 많이, 제대로 재현하고, 잠재적으로 위험한 청소 절차가 필요하지 않습니다. 또한이 프로토콜에 설명 작은 챔버의 설치​​, 50 미만 μL에 효과적인 이중층의 형성에 필요한 소포의 양을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 표면 어셈블리의 전체 프로세스는 시간 소모적 종래의 운모 벽개 및 부착을 마찬가지로, (제조 미만 30 분 소요), 및 서, 고도의 기술을 필요로하지 않는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 24 x 50mm - No H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (세제)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-1 Grade</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>광학 접착제 (높음) 점도)</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (저점도)</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>램프가 100% 전력으로 설정되었습니다.</td></tr></tbody></table>

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

지원되는 지질 이중층 (SLB 수)가 널리 막 특성 (상 분리, 클러스터링, 역학)과 같은 약물이나 펩티드 등의 다른 화합물과의 상호 작용을 연구하기위한 모델로 사용된다. 그러나 SLB 특성 사용 지원에 따라 다르다. SLB 이미징 및 측정에 일반적으로 사용되는 기술들은 단일 분자 형광 현미경, FCS 및 원자 힘 현미경 (AFM)이다. AFM은 매우 평탄한 표면 (일반적으로 운모)를 필요로하는 동안 대부분의 광학 이미징 연구가 유리 지지체 상에 실시되기 때문에 이들 재료의 충전 및 평활성 속성 강하게 확산 영향 때문에, 이러한 기술의 결과는, 직접 비교 될 수 없다. 불행하게도, 유리 슬라이드에 절단 및 운모의 얇은 조각을 접착제로 붙이기에 필요한 손재주의 높은 수준의 SLB 준비를위한 운모의 일상적인 사용에 장애물을 선물한다. 이 선택의 방법, 이러한 준비 운모 것입니다 있지만표면은 종종 특히 작은 작동 거리, 높은 수치 조리개 렌즈로, 요철 (물결 모양) 및 이미지에 어려운 끝나게. 여기에서 우리는 지질 소포 증착 및 SLB의 제조에 대해 얇고 편평한 운모 표면을 제조하기위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제시한다. 또한, 우리의 사용자 정의 만든 챔버는 SLB 형성 소포 만 아주 작은 볼륨을 필요로합니다. AFM 연구에서 사용 된 것과 직접 필적 고품질 지질 이중층 표면의 효율적인 간단하고 저렴한 생산 전체적인 절차 결과.

SLB 수있는 지질 형광 프로브의 확산 동작은 기판에 따라 다르다. SMT 기술과 결합 된 TIRFM는 입자의 움직임을 시각화하고 그들의 확산 계수를 추출하기위한 중요한 방법이다. DOPC 유리와 운모 지원 (1,2 - dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린) 이중층에 확산 핑고 마이 엘린 - ATTO647N 프로브의 단일 분자 신호는 첨부 된 애니메이션 그림에 표시됩니다. 운모 표면은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 제조 하였다. 광학 수차를 추정하기 위해, 반 최대 (FWHM)의 전체 폭을 측정하고 16, 17 플러그인 모자이크 2D PSF 크기 ImageJ에를 사용하여 20 점 확산 함수 (PSF)에 대해 평균 하였다. 유리와 운모의 측정 FWHM은 각각 441nm와 464nm (그림 1)이었다. 유리와 운모에 영상과 해상도의 22 나노의 차이는 중요하지 않습니다. 두 경우 모두, 각각의 단일 형광 분자의 PSF의 중심은 로카 수연속적인 프레임...

우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다.

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

여기에 제시된 절차는 tur 단일 분자 추적 연구와 같은 고해상도 이미징에 적합한 층으로 MICA 지지 지질을 준비하는 쉬운 방법을 보여줍니다. MICA 표면은 유리 현미경 슬라이드와 커버 슬립 사이에 접착된 단일 MICA 시트의 샌드위치를 평평하고 매우 얇은 신선한 운모 표면을 노출시키는 광학 접착제를 사용하여 분해하여 준비합니다. 1.5 밀리리터 바이알 컵으로 만든 작은 플라스틱 챔버를 장착하면 이중층 형성에 필요한 지질 소포의 부피를 30 마이크로 리터까지 낮출 수 있습니다.첫 번째 단계로, 공급업체에서 제공하는 MICA의 다층 시트를 가져와서 가위로 더 작은 조각으로 자릅니다. Al 전단지를 신선한 칼날을 사용하여 2개 또는 3개의 더 얇은 전단지로 나눕니다. 이제 덮개를 청소하고 완전히 잠을 자십시오.여기에는 0.17mm 덮개를 배치하는 작업이 포함됩니다. 각 덮개를 덮는 유리 훈련 항아리에 잠을 잔다. 별도의 슬롯에서 자고 섭씨 30도에서 세제에 60분 동안 초음파 처리합니다.덮개를 씻으십시오. 미니 키 워터로 10-20번 자고 공기나 질소 흐름으로 말리십시오. 현미경 유리 슬라이드를 가져 와서 장소로 청소하십시오.약 15마이크로리터의 저점도 광학 ahe가 이전에 현미경 폭발과 지구본에 떨어졌습니다. UV 라이트 박스에 있는 전단지를 몇 분 동안 자릅니다. 스카치 테이프를 사용하여 운모의 몇 겹을 벗겨냅니다.처음 몇 개의 레이어는 조각화될 것이므로 해당 레이어가 스카치에 부착될 때까지 이 작업을 수행합니다. 테이프는 균일하고 완전합니다. 테이프를 덮습니다.Micah 표면에 고점도 광학 접착제 한 방울을 떨어뜨립니다. 저기에 공기 방울이 없는지 확인하십시오. 공격적인 비말에 깨끗한 덮개 수면을 부드럽게 놓습니다.핀셋을 사용하여 유리잔을 부드럽게 두드려 아헤를 펴 바릅니다. 다시 말하지만, 몇 분 동안 자외선으로 접착제를 경화시킵니다. 칼을 사용하여 유리로 구성된 샌드위치를 나눕니다.MICA를 밀어 수면을 덮습니다. 대부분의 경우 매우 얇은 MICA 층만 커버 슬립에 접착된 상태로 유지됩니다. 해부 현미경을 사용하여 바늘이나 핀셋 끝으로 작은 흠집을 만들어 MICA 표면을 검사합니다.표면이 실제로 운모인지, 여기와 같이 표면이 균일하게 긁힌 운모인지, 아니면 여기와 같이 표면이 빛나는 광학 접착제인지를 쉽게 말할 수 있습니다. 1.5밀리리터 유리병에서 컵을 꺼내 가스통을 제거하고 매니큐어를 사용하여 캡을

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 고해상도 현미경 이미징을 위한 운모 지지 지질 이중층 준비 방법을. 광학 접착제를 사용하여 평평한 운모 표면을 노출시키고 30마이크로리터의 지질 소포만으로 고품질 이중층을 형성할 수 있습니다.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

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