Name: 레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, Tribolium castaneum (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 Tribolium castaneum 애벌레 RNA 간섭 기법으로 유전자 기능을 연구하는 방법입니다. 이 실험은 주사를 통해 효율적인 유전자 녹다운을 가능하게 하며 발달 생물학 및 유전학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 기술 지원을 마이애미 대학에서 생물 정보학 및 기능 유전체학을위한 센터 (CBFG를) 감사합니다. 이 작품은 마이애미 대학 창업 보조금 (YT), 그리고 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (: IOS 0,950,964 YT)에 의해 지원되었다.

1 T. castaneum 주식 및 배양 <ol><li> T. 결정 castaneum 변형 실험을 위해 사용합니다. 참고 : 여러 실험실 설립 T. castaneum 균주를 사용할 수 있습니다. 조지아-1 (조지아-1) 게놈 염기 서열 3에 사용 된 가인이의 부모의 변형이다. 조지아-1 (예 : 단일 염기 다형성 등, SNP를) 공유 대부분의 DNA 다형성을 조지아-2와 인해 적은 근친 교배에 가인이보다 건강이기 때문에, RNAi의 실험에 적합하다. 푸 (11)가 사용하는 또 다른 편리한 변형입니다 미래 날개 primordia의 고유 한 강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP) 식을 다른 령충에서 마지막 애벌레 령을 구별 할 수있게 해준다으로, (클라크 Hachtel 등. 2,013 12의 그림 S4 참조). 유전 적 배경이 크게 AFF에 나타나는 그것은 실험에 사용 된 딱정벌레 변형 문서화하는 것이 중요하다요법의 RNAi는 13 표현형. </li><li> T. 준비 (혼합 후, -20 ° C에서 문화 밀가루를 저장) 유기농 통밀 가루에 미리 체질 맥주의 효모의 (중량) 5 %를 추가하여 castaneum 문화 밀가루. 6온스 플라스틱 초파리 스톡 병 (약 40g / 병)에 (실온에서) 문화 밀가루를 나누어지는. </li><li> 문화 T. 70 %의 습도가 30 ° C에서 castaneum. 습도 제어 인큐베이터 가능한 경우 사용합니다. 문화 병 당 30 ~ 40 성인 추가 (남성 : 여성 비율 1 : 1) 문화를 시작합니다. 참고 : 곰팡이가 거의 문화 밀가루에 곰팡이가 발생할 수 있습니다 30 ° C 70 % 습도, 낮은 온도 (예 : 25 ° C에서)에서 문제가되지 않지만. 이 경우 습도를 낮 춥니 다. </li><li> 계대 배양 (문화 가루 성인을 분리하는 방법에 대한 단계 5.2-5.5 참조) 모든 이주 새로운 문화 병으로 성인을 전송합니다. 참고 : 마지막 령 유충을 얻기 위해 약 3 주 정도 소요됩니다. Alternatively, T. castaneum 문화가 더 이상 배양 기간 임에도 불구하고, 낮은 온도 (20 ~ 25 ° C에서)에서 유지 될 수있다 (25 ° C에서 개발 시간은 약 두 배에 30 ° C에서)입니다. </li></ol> 애벌레 dsRNA를 주입하기위한 솔루션 및 인스트루먼트의 2 준비 <ol><li> 시험 관내 전사에 의해 표적 유전자 상동의 dsRNA 분자를 합성한다. -80 ° C에서 보관하십시오. 자세한 분자 생물학 절차 필립과 Tomoyasu 2011 11를 참조하십시오. 또한의 dsRNA 분자를 설계 할 때 고려해야 할 파라미터 번호 논의 참조. </li><li> 1.5 ml의 1 M의 NaH 2 PO 4 8.5 ml의 1 M 나 2 HPO 4를 혼합하여 (25 ° C에서의 pH 7.6) 0.1 M 인산 나트륨 완충액을 확인합니다. pH 미터로 pH를 확인하고 그에 따라 조정합니다. </li><li> 100 _, (25 ° C에서의 pH 7.6), 0.1 M 인산 나트륨 완충액 10 ㎕를 혼합하여 10 배 주사 완충액 1 ㎖를 확인6; 리터 0.5 M의 KCl, 녹색 식품 염료 100 ㎕ 두 번 증류수 790 μL (DDH 2 O). 배 주입 버퍼 (200 ㎕의 10 배 주입 버퍼 + 800 ㎕의 DDH 2 O)를 만들기 위해 10 배 주입 버퍼를 희석. 필요할 때까지 4 ° C에서 모두 10 배 및 2 배 주입 버퍼를 저장합니다. </li><li> 스티커 유리 슬라이드를 준비합니다. <ol><li> 애벌레 주사제 다 repositionable 접착제의 형태와 전체 유리 슬라이드를 커버. 성인 또는 번데기 주사제, 슬라이드의 긴 모서리를 따라 접착제이 얇은 스트립을 확보. </li><li> 또한 주사 후 자신의 제거를 용이하게하기에 충분 휘기 쉬운 유지하면서 접착제, 접착제 슬라이드에 딱정벌레를 준수 할만큼 볼품 유지되도록 몇 일 동안 건조시킵니다. 참고 : 접착제가 너​​무 끈적 유지하는 경우, 손가락을 사용하여 점착성을 줄일 수있는 접착제를 누릅니다. 각 슬라이드는 40 또는 50 딱정벌레까지 수용 할 수 있으며 안전하게 동물을 잡아 실패 할 때까지 재사용 할 수 있습니다. Altern테이프가 때때로 유충을 저장하기에 충분히 접착되지 않는다 atively, 양면 테이프도 사용할 수있다. </li></ol></li><li> 에테르 마취 바구니를 확인합니다. <ol><li> 10 ㎖의 일회용 주사기에서 플런저를 제거하고 6 ml의 라​​인 주위에 반으로 주사기를 잘라. </li><li> 주사기의 하단을 폐기하십시오. 간단히 가스 버너와 주사기의 상단 부분의 절단면을 가열하고 신속 주사기 위에 메쉬를 붙 나일론 메쉬 편 상에 용융 수지를 밀어. 플라스틱은 견고하게되면 초과 메쉬를 멀리 낸다. </li></ol></li><li> 에테르 병을 준비합니다. 좁은 입 100 또는 250 ㎖의 유리 병에 에테르 30 ML을 추가합니다. 에테르의 증발을 향상시키기 위해 휴지 여러 조각을 추가한다. 참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 항상 흄 후드 에테르을 처리합니다. 사용 긴밀하지 동안 뚜껑을 닫습니다. 참고 : 얼음은 sedatio 있지만 (예 : 교실 환경에서와 같이) 안전한 대안으로 사용할 수 있습니다여기서 n은 덜 효과​​적이다. </li></ol> 유생의 사출 장치의 제조 3 <ol><li> 해부 현미경에 XY 기계 무대를 놓습니다. 참고 : XY 기계 단계 주요 현미경 회사에서 사용할 수 있습니다. 대안 적으로, 저렴 현미경 스테이지는 또한 일부 수정 대부분 해부 현미경에 사용될 수있다 (예를 들면 재료 표 참조). </li><li> XY 메카니컬 스테이지 근처에있는 기계 바늘 매니퓰레이터를 놓습니다. </li><li> 주입 주사기를 조립합니다. 주사 바늘의 압력에 영향을주지 않고 주입 주사기의 조작을 허용하는, 유리 바늘 홀더에 30 ml의 일회용 주사기를 연결하는 (루어 형 연결부)와 사 방향 스톱 콕을 사용하여 (자세한 주입 주사기 필립 Tomoyasu 2011 11 참조 조립). </li></ol> (4) 당기 주입 바늘 <ol><li> 에 의해 붕규산 유리 바늘 (0.5 mm, 15cm 길이 : 1mm, ID B100-50-15, OD)를 당겨바늘을 끌어 당기는. 참고 : 셔터 P-87이나 P-97은, 설정 사용을 위해 &quot;열 = 70 = 45, VEL = 75 시간 = 90을 당겨&quot;또는 피펫 요리 책의 제 2 장을 따르 자기편 셀, C를 엘레 간스, 초파리, 제브라 피쉬 &amp;가 - 프로그램을 추천합니다. 최적의 설정은 바늘 풀러의 모델에 따라 다릅니다. 일반 초파리 주사 바늘에 대한 설정은 좋은 출발점이다. </li><li> 스토어는 플라스틱 케이스 (예를 들면, 플라스틱 CD 케이스)에 바늘을 뽑아 이동식 장착 퍼티 고정합니다. </li></ol> (5) 분리 및 유충의 선택 <ol><li> 체 수신기에 # 25 체를 놓습니다. </li><li> 체의 문화 병 (딱정벌레와 문화 밀가루)의 내용을 놓고 즉시 내용을 선별. 유충 신속하게 체를 파고와 박히하려고합니다으로 선별하지 않고 자체에 대한 내용을 보관하지 마십시오. 적극적 밀가루 가을 수 있도록 내용을 선별를 통해 세 애벌레를 떠나 (일반적으로 여섯 번째와 일곱 번째 령 유충), 체의 상단에 뒤 (자신의 캐스트 오프 손톱, exuviae과 함께) 번데기 및 성인. </li><li> 시드 팬에 체 (딱정벌레와 exuviae)에 남아있는 자료를 전송합니다. 탈출 딱정벌레를 방지하기 위해 팬을 눌러 보관하십시오. </li><li> exuviae 부드럽게 시드 팬을 통해 불어 딱정벌레의 표면에 남아있는 밀가루 입자를 제거합니다. </li><li> 팬의 바닥에 내용을 이동 시드 팬을 누릅니다. 그런 다음 몇 초 동안 미개발 팬을 둡니다. 더미에서 나올 다른 단계보다 더 많은 모바일 아르 성인 기다립니다. 미술 붓 (예를 들어, 1cm 폭)을 사용하여 성인을 제거합니다. </li><li> 번데기로, 약간 아래쪽 팬의 입 유지하면서 부드럽게 시드 팬 노크하여 별도 번데기 빠르게 입 향해 굴러 경향이있다. 시드 팬에서만 애벌레를 떠나, 번데기를 제거하기 위해 붓을 사용합니다. </li><li> 경기 수깨끗한 페트리 접시에 고립 된 유충 에이스. 주사 유충의 적절한 단계를 선택하고 별도의 페트리 접시에 배치합니다. 참고 : 성인 형태학에뿐만 아니라 변태에 RNAi의 효과를 분석 할 때 초기 마지막 령 유충 (최종 애벌레 탈피 후 1~2일)는 종종 적합하다. 그것은, 그러나, 때때로 필요 (예를 들면, 3E-3H 피규어. 또한 클라크 Hachtel 등. 2,013 12 참조) 초기 유전자 기능을 평가하기 위해 끝에서 두 번째에 (또는 이전) 단계의 RNAi을 수행 할 수있다. 유충의 령을 식별 할 크기 기준으로 번데기를 사용합니다. 마지막 령 유충은 약간 더 번데기보다. 다르게는, PU-11은 최종 령 유충을 식별 할뿐만 아니라 최근 령 유충의 개발 (클라크 Hachtel 그림 S4 외. 2,013 12)의 시간 코스를 결정하는데 사용될 수있다. </li><li> 에테르 마취까지 페트리 접시에 선택한 유충을 유지합니다. 나머지를 배치다시 밀가루와 문화를 병에 넣고 인큐베이터에 반환 유충 (예 : 번데기 및 성인과) 딱정벌레의 다른 단계. </li></ol> 주사 바늘의 6 준비 <ol><li> 스티커 압정 또는 양면 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드 상에 미리 뽑아 유리 바늘을 놓는다. 여기서 팁 굽힘을 볼 수있는 해부 현미경을 통해 보는 동안 집게를 사용하여 바늘의 당겨 끝을 테스트합니다. 집게와 트위스트와 함께 바늘 굴곡이 분할하는 위치의 끝쪽으로 약간 영역을 잡아. </li><li> 좋은 바늘을 유지하고 다른 사람을 버린다. 그가 너무 크지도 너무 작지 여는 것으로 좋은 바늘을 고려 (약 0.05 mm 직경. 1A 및도 1B), 및 유생 표피 쉽다 (도 1b 및도 2A-2B)의 침투를 만드는 각도된다. diffi 바늘로 dsRNA를 용액의 흡수를 만드는 등의 나쁜 바늘 (I)가 너무 작은 고려컬트 (7 단계) (그림 1D 및 2D), (II) 너무 큰, 사출에 애벌레 부상하고 가능한 치사율의 원인 (그림 1C 및 2 층), 표피 어렵고 증가 부상 (III) 무딘, 제작 침투. </li><li> 니들 홀더에 바늘을 삽입합니다. <ol><li> 먼저, 바늘 홀더의 선단부의 나사 팁 홀더에 바늘의 후방 단부를 배치. 그리고, 홀더 선단에서 (유리 바늘의 후방 단부로부터 적어도 1cm)를 고무 패킹을 배치. </li><li> 완전히 바늘 홀더의 개구부에 삽입 된 고무 개스킷 홀더에 바늘의이면을 삽입한다. 다시 홀더 위에 팁을 나사. </li></ol></li><li> 바늘 조작기에 조립 된 바늘 홀더를 놓습니다. 수평에 가까운 바늘 홀더를 유지합니다. MICR 통해 볼 때 매니퓰레이터의 위치를​​ 조정하므로 니들의 팁은 뷰의 중심에 위치하고oscope. </li></ol> 바늘에 7 Frontloading의 dsRNA 솔루션 <ol><li> DDH 2 O와 농도를 조정하고 배 주입 버퍼 (단계 2.3) 같은 부피를 가진 dsRNA에 솔루션을 혼합하여 주입 직전에 dsRNA를 주입 솔루션을 준비합니다. 얼음에 혼합 용액을 보관하십시오. dsRNA에 농도에 대한 설명을 참조하십시오. </li><li> 20 μL 일회용 피펫 팁의 끝을 잘라. 피펫 트리밍 피펫 팁에 용액 10 μL. 배압을 제공하여 팁의 유체를 유지하면서 조심스럽게 피펫 피펫 팁을 제거합니다. 선택적으로, 팁을주의 깊게 제거하고 손가락을 이용하여 압력을 제공하여 선단 단부에 용액을 이동. </li><li> 바늘의 선단을 향하도록 개구 스티커 압정을 이용하여 현미경 스테이지 dsRNA를 용액으로 피펫 팁을 놓는다. </li><li> 현미경을 통해 찾고, 천천히의 끝 때까지 바늘 방향으로로드 팁을 이동니들은로드 된 피펫 팁 내부 및 솔루션에 있습니다. </li><li> 현미경을 통해 보면서 부드럽게 천천히 바늘에 dsRNA에 솔루션을 끌어 주입 주사기의 플런저를 다시 잡아 당깁니다. 참고 : 바늘을 너무 많이 넣지 마십시오. dsRNA를 용액의 단부는 바늘의 팁에 접근하면, 인상 속도를 느리게하고 공기 도달 할 바늘의 선단부 전 용액로드를 중지. 공기가 팁에 도달하는 경우, 용액을 급속하게 오염이 심각한 문제를 초래 바늘 홀더로 흡입된다. 바늘 홀더의 자세한 청소 절차는 필립과 Tomoyasu 2011 11에 설명되어 있습니다. </li><li> 꼭지를 열어 주입 주사기와 바늘 홀더에서 압력을 제거합니다. 그런 다음, 바늘의 끝에서 멀리 피펫 팁을 이동합니다. 무대에 유충을 배치하는 동안 실수로 바늘의 손상을 방지하기 위해 무대에서 바늘을 올립니다. 무대에서 비워 피펫 팁을 제거합니다. </li></ol&gt; 8 dsRNA를 주입 <ol><li> 에테르 마취 바구니에 애벌레를 놓습니다. 기술을 학습보다 작은 경우 10 유충을 사용합니다. 기술로 한 번 편안한 한 라운드에서 30 ~ 40 유충을 사용합니다. </li><li> 에테르 병에 애벌레와 바구니를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. </li><li> 약 3 분 Etherize 애벌레. 3 분 후 이동을위한 유충을 확인합니다. 그들은 여전히​​ 이동하는 경우 다른 30 ​​초 동안 에테르 병을 다시 배치합니다. 이 치사 성을 높일 수 있으므로 이상 5 분 etherize하지 마십시오. 참고 : 최적의 에테르 마취 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 유리 스티커 슬라이드의 붙지 않는 가장자리로 바구니에서 에테르 화 유충을 전송합니다. 집게를 사용하여 현미경을 통해 보는 동안 한 각 유충 하나를 선택하고 슬라이드에 배치합니다. F 자신의 몸을 아래로 눌러 부드럽게 측면을 올려 놓고당신이가는대​​로 집게로 꼬리 롬 머리, 약간 그들은 슬라이드에 고정되어 있는지 확인하기 위해 그들을 스트레칭. </li><li> 현미경 무대에서 유충으로 끈적 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 중추 신경계 손상을 방지하기 위해 유생의 등쪽으로 부드럽게 dsRNA를로드 바늘을 삽입합니다. 애벌레 마음이 여기에 위치해 있기 때문입니다 또한, 지느러미 중간 선을 피하십시오. 이 이후 단계에서는 항상 (대신 바늘을 이동하는 바늘 조작기를 사용하는) 바늘에 애벌레를 이동하는 단계를 사용합니다. 주 : 특정 주사 부위가 T.에서의 RNAi으로 문제가되지 않습니다 castaneum 전신이 나타납니다. 그러나, 흉부 또는 복부 세그먼트의 등쪽에 주입하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. </li><li> 유충에 바늘을 삽입 한 후, dsRNA에이 애벌레 체강를 입력 할 수있는 공간을 확보하는 데 약간 뒤로 바늘을 빼냅니다. </li><li> 유충 턴 녹색 (또는 사출 버퍼의 색)까지 주입 주사기에 부드럽게 밀어의 모습tretched 및 전체. NOTE : 기술을 학습하면, 상당한 치사율없이 애벌레에 주입 될 수있는 용액의 양을 결정하기 위해 가능한 한 많이 주입하려고. 그것은 일반적으로 약 0.5 ~ 0.7 μL이다. </li><li> 애벌레에서 바늘을 제거합니다. 바늘을 제거하는 동안 약간 뒤로 dsRNA에 손실을 방지 할 수있는 주입 주사기에 당겨 (도 공중에 끌어하지 않도록주의). </li><li> 슬라이드의 모든 애벌레를 주입. 성공적으로 주입되지 않은 유충을 제거해야합니다. 유충이 완료되기 전에 주사 (약 10 분)에서 일어나. </li><li> 주사 현미경에서 주입 애벌레와 슬라이드를 제거하고 모든 애벌레 에테르 마취에서 회복 될 때까지 더 5 분 동안 슬라이드를 둡니다. </li><li> 집게와 해부 현미경, 부드럽게 끈적 슬라이드으로부터 그들을 석방을 위해 머리부터 꼬리까지 애벌레를 들어 올립니다. 깨끗한 페트리 접시에서 새로 출시 된 애벌레를 놓습니다. w 주입을 허용하도록 10-15 분 동안 페트리 접시에 유충 남기기응고 ound. </li><li> 적절히 변형 이름을 포함한 클린 밀가루와 새로운 레이블 병으로 유충을 배치하는 dsRNA의 유형은, dsRNA를 농도, 주입 된 유충의 수, 및 날짜를​​ 주입. </li><li> 문화 70 %의 습도가 30 ° C에서 주입 된 유충. 정기적으로 RNAi의 표현형의 유충을 관찰한다. 참고 : 7 일 이내 마지막 령 유충 번데기. (RNAi에 의한 타이밍에서 더 이상 존재하지 않는 경우) 다음에, 번데기 7 일후에 eclose 성인 것이다. </li></ol> 넉다운 및 표현형 분석의 9 확인 <ol><li> 이러한 정량적 역전사-PCR (QRT-PCR)과 서양의 모래 바닥과 같은 여러 가지 분자 생물학 기술에 의해 아래로 노크의 RNAi의 평가의 효율성을 고려한다. 각각 밀러 등. 2,012 7 필립 상세한 qPCR에 대한 Tomoyasu 2011 (11)과 서쪽 오점 프로토콜을 참조하십시오. </li><li> RNAi에 관련 표현형을 분석합니다. 참고 : 관련 RNAi에표현형은 표적 된 유전자에 따라 여러 다른 단계에서 및 다른 배양 조건 하에서 관찰 될 수있다. 의 RNAi는 딱정벌레의 형태, 변태, 생리학, 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 얼마나 자주 표현형의 존재가 확인되고 딱정벌레 양육 조건이 특정 질문에 맞게 조정되어야 하는지를 아래는 RNAi를 통해 조사되고. </li></ol>

<ol><li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li>
<li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li>
<li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li>
<li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10(2008).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431(2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li>
<li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutio.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Tribolium+castaneum%2C+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li>
<li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5(2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+WM+%22Systemic+RNAi+in+C+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%22">Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1</a>. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest%2C+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%2C+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 거기 (노크 복수를 시도 할 때) 상이한 dsRNA를 분자에 길이 및 농도의 dsRNA 분자의 경쟁을 포함한의 RNAi의 성공을 보장하기 위해 고려해야 할 중요한 사항 중 다수가 있고, 표적 이탈 효과의 가능성 (OTE). dsRNA에 길이 dsRNA를 분자의 길이가 더 긴 dsRNA에 (dsRNA에의 한계 이상이 현재 알려져 있지 않지만) 7,14,15의 RNAi를 유발하는 것이 더 효율적으로되고, 전신의 RNAi 반응의 효율에 영향을 미친다. dsRNA에 길이는 T. 효과적인의 RNAi를 유도하기 위해 50 bp의 이상 할 필요가 castaneum 7. 150 bp의 500 bp의 사이의 dsRNA는 RNAi를 이상적으로 나타납니다. 긴 dsRNA에 분자가 또한 사용될 수 있지만, 그들은 점차 어려워 질 것이다 OTE의 증가 가능성 및 유전자 클로닝 단계를 가질 것이다. dsRNA에 집중 ve_content &quot;&gt; 유전자 녹다운의 다른 정도는 dsRNA에의 농도에 따라 달성 될 수는. 1 μg은 / μL (관심 유전자 (들)에 따라 달라질 수 종종 가까운 널 표현형을 생산하는 적당한 출발 농도를,로 나타나는 ). RNAi에 가끔 hypomorphic 표현형 (Tomoyasu의 기업 데이터 계열을 생성하는 데 도움이 될 수의 dsRNA의 일련 희석액과 강한의 RNAi 표현형.의 RNAi를 얻기 위해 더 높은 농도 (예를 들면, 7-8 μg / μL)과 함께 수행 될 수있다 등. 2009 8 및 Borràs - 카스텔되지 않은 데이터). RNAi의 경쟁 다중 유전자 녹다운이 T. 달성 될 수있다 동시에 여러 가지의 dsRNA 분자를 주입함으로써 castaneum. 그러나, 또한 생체 내에 존재하는 여러 가지의 dsRNA 분자를 갖는 것이 종종 RNAi의 컴포넌트에 액세스하는 dsRNA에 간의 경쟁을 초래하는 것으로 알려져있다 <s&gt; 7,14입니다. 그것은 하나의 dsRNA (다른 밖으로 - 경쟁을 피하기 위해 여러 유전자 녹다운을 시도 할 때 모두 dsRNA에 대해 동일한 길이와 동일한 농도를 사용하는 것이 중요하지만, 발현 수준이 크게간에 다를 때 dsRNA를 길이와 농도의 추가적인 조정이 필요할 수있다 표적 유전자). 우리뿐만 아니라 다른 사람들이 성공적으로 (예를 들면, Tomoyasu 등. 2,005 16 Tomoyasu 등. 2,009 17 및 양 등. 2,009 18) 더블, 트리플 최저을 수행했습니다. 이 네 개의 표적 유전자의 RNAi 효율의 현저한 감소를 초래할 가능성 것처럼, 사중의 RNAi를 실현 (또는 그 이상)하면되지만, 문제가 될 수있다. 오프 대상 OTE는 RNAi의 기반 접근 방식에 대한 고유의 관심사입니다. OTE을 최소화하는 한 방법은 설계시의 dsRNA 이들 영역을 다른 유전자와 비슷한 염기 서열을 공유하는 표적 유전자의 영역들을 식별 및 방지하는 것이다. T.에 대한 간단한 BLAST 분석 castaneum 예측 유전자 세트는 영역을 식별 할 수 있습니다. 여러 온라인 도구는 잠재적 인 OTE (예를 들어, E-RNAi의 19)의 평가를 할 수 있습니다. 표적 유전자의 두 개의 비 중첩 영역의 RNAi를 위해 수행하면 OTE 표현형이 관찰에 의해 발생 가능성을 제거하는 쉽고 효과적인 방법이다. RNAi에 두 개의 비 중첩 영역이 동일한 표현형을 생성하는 경우에 대해 (이 비 중첩 영역이 유사한 서열을 공유하지 않는 한) OTE의 가능성이 최소화된다. 표현형 분석 이외의 방법으로 유전자 녹다운을 효과적으로 평가 본 RNAi에 관련 데이터 종종 중요하다. 유전자 최저를 평가하는 두 가지 주요 방법이 QRT-PCR과 웨스턴 블롯 분석이다. QRT-PCR은 표적 mRNA의 수준을 측정하는 편리한 방법이며, T.에서 RNAi를 포함한 많은 관련 연구에서 사용되어왔다 castaneum (밀러 외를 참조하십시오. 예를 들어 2012 7). Howev우리가 최근에 (단백질 제품은 아래로 조절 비록) 대상 mRNA의 수준 (Borràs - 카스텔되지 않은 데이터)까지 조절 RNAi에 의해 인 경우를 본 것처럼 어,주의,주의해야합니다. 최대 조절이 RNAi를 유도 mRNA의이 광범위하거나 특정 유전자에 고유 될 수 있다면 그것은 현재 알 수 없습니다. 웨스턴 블롯 분석은 유전자 최저을 확인하는 또 다른 방법입니다. 그것은 최종 단백질 생성물의 양을 측정하는이 방법은 상당히 안정적이다. 표적 유전자의 단백질 생성물에 대하여 특이 적 항체의 요건은이 방법의 단점이다. 표현형 분석 이외에 여러 독립적 인 측정을 이용하여 RNAi에 기반 분석에 의해 얻어진 표현형 데이터의 신뢰도를 증가시킬 것이다. T.에서 그 개념부터 castaneum, RNAi에 주로 개발 및 패턴 형성에서의 유전자 기능을 연구하는데 사용되었다. 이러한 T. castaneum 발달 연구는 charac 매우 성공적이었다유전자의 진화 적으로 보존 및 발산 기능을 terizing (Denell 2008 1 Klingler 2004이 검토). T.에서 그러나, RNAi의 기반 연구 castaneum는 발생 생물학에 한정되지 않는다. 예를 들어, RNAi의 스트레스 내성, 포식, 공격성 ​​메이트 선택 활동 패턴 및 방어 메커니즘을 포함하여 생리적 행동 반응의 넓은 범위에서 유전자 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이러한 문맥에 RNAi를 도포 한 어려움다면 발현 효과의 가능성이다. 종종 관심의 유전자는 T.에 걸쳐 다양한 역할을해야합니다 castaneum 수명주기, 따라서 의도 어려운 표현형 효과없이 유전자의 제거를 만들기. 그러나, 용이하게 스테이지에서 RNAi의 다양한 수행 능력은 종종 이러한다면 발현 성 효과를 피하기위한 효과적인 전략이 될 수있다. 예를 들어, 대신 유충이나 번데기의 성인에서의 RNAi를 실행하면 우리가 unin 우회 할 수 있습니다초기 개발 단계에서 유전자 최저로 인한 치사율을 경향이 있었다. T.에서의 RNAi 반응의 유연성 castaneum 따라서 생리 학적 및 행동 반응의 유전자 기능의 실험에 RNAi에 적응이 모델에게 매력적인 선택을합니다. T. castaneum 시스템은 교육 기관에서 사용하기에 이상적이다. T. castaneum은 T.에서의 RNAi 기술을 자주 계대 배양없이 실내 온도 (25 ° C)에서 밀가루 / 효모 혼합물에 쉽게 배양 될 수 있습니다 castaneum은 아주 간단 젊은, 학습 과학자 실험실에 적용 할 수 있습니다. RNAi의 생물학적 다양한 분야에서 필수적인 기술이되고, 그것은 학생들이 기술에 노출하는 것이 중요하다. T.에서 애벌레의 RNAi 기술의 솔직 자연 castaneum 또한 T.을, 연구에 참여하는 더 많은 학생들을 장려 유전 시스템 중심의 교실을위한 주요 후보를 castaneum. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

적색 밀가루 딱정벌레의 Tribolium castaneum 인해 RNA 간섭 (RNAi에) 1-3 수행 용이성 일부 생물학의 다양한 분야에서 인기를 얻고있다. RNAi에 기반 유전자 녹다운 기술은 과학자들이 기능 상실 복잡한 유전 적 방법을 이용하지 않고 분석을 수행 할 수 있습니다. T.를 castaneum 가능 딱정벌레의 체강 4-6에 이중 가닥 RNA (dsRNA에)의 주입을 통해 단순한 어떤 단계에서의 RNAi를 수행 할 수있어 견고한 전신의 RNAi 반응을 나타낸다. 여러 유전자의 동시 최저 또한 T.에서 가능하다 동시에 7,8 둘 이상의 dsRNA를 다른 분자를 주입함으로써 castaneum. 또한 hypomorphic 표현형의 일련의 dsRNA 8 주입의 농도를 감소시킴으로써 생성 될 수있다. 이러한 기능은 T. 전통 앞으로 유전학에의 RNAi 기반의 역 유전 기술 매력적인 대안을 castaneum. 이후 거의모든 T. castaneum 조직이 기술은 연구자들이 다양한 상황에서 조직의 다양한 연구 할 수 있으며, 세포의 dsRNA 분자 9에 민감하다. 또한,이보고는 T.에서 RNAi의 수행에 초점을 맞추고 있지만 castaneum, 여기에 설명 된 다양한 절차는 다른 곤충에 적용 가능하다. 하고자하는 사람들은 기능 상실은 T.에 대한 관심이 그 맥락에서 분석을 수행하는 데에 따라서,이 프로토콜은 유용 castaneum뿐만 아니라 다른 곤충의 RNAi 기반의 기술을 적용하고자하는 연구자. 애벌레로 dsRNA를 주입하는 애벌레, 번데기를 포함 딱정벌레 삶의 단계, 다양한에서 기능 분석을 허용하고, 성인 4,5,10 스테이지. 우리는 이전에 분자 생물학 절차 (11)를 포함하여 우리의 전반적인 애벌레의 RNAi 프로토콜을보고했다. 현재 보고서에서, 우리는 최고의 시각 보좌관으로 설명 dsRNA를 주입 절차를 기술에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 제공자세한 단계별 주입 절차뿐만 아니라 선과 악을 주입 예. 이 프로토콜은 시각 이전 프로토콜을 보완하고, 결합 될 때, 그들은 T.에서 유생의 RNAi 과정의보다 포괄적 인 뷰를 제공 castaneum. 또, RNAi의 생리적 연구의 RNAi 기반 분석법의 적용 성공뿐만 아니라, 교육 기관에서의 RNAi 유생 프로토콜의 적용 가능성에 영향을 줄 수있는 분자의 dsRNA에 대한 매개 변수를 논의한다.

<table><tbody><tr><td>유기농 통밀가루&nbsp;</td><td>Heartland Mill Inc. 캔자스</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>브루어' s 효모</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>사용하기 전에 #35 스테인리스 체로 효모를 체로 치십시오. 보호 마스크를 착용하고 체로 쳐진 효모는 미세 입자이자 호흡기 위험이므로 체를 플라스틱 랩으로 덮으십시오.</td></tr><tr><td>6 oz 플라스틱 Drosophila 재고 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-881N</td><td>8 in. dia. x 2 in.D. #25 사용 (공칭 개구부 710 &마이크로; m) 애벌레, 번데기 및 성충용.&nbsp;</td></tr><tr><td>시브</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>04 881 10P</td><td>8 in. 직경 #35 (공칭 시브 오프닝: 600 &마이크로; m)&nbsp; 스테인레스 스틸 체, 8 in. 직경 x 2인치 이 체는 효모 분말에서 덩어리를 제거하는 데 이상적입니다.</td></tr><tr><td>체 수신기</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-866B</td><td>8 인치 직경</td></tr><tr><td>1.5 쿼트 샘플 팬&nbsp;</td><td>Seedburo 장비 Co.</td><td>모델 33</td><td>수집 팬</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>BioCold Environmental Inc</td><td>BC26-IN</td><td>Keep it 30 &deg; 습도 70%의 C.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>식용 염료&nbsp;</td><td>Kroger</td><td></td><td>녹색, 파란색 또는 빨간색 선호</td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>압정 - 잇 오버 & </td> 끈적끈적한 슬라이드를 위한 <td>Aleene의</td><td></td><td>재배치 가능한 접착제 위에. 양면 테이프를 대안으로 사용할 수 있지만 접착력이 다양하다는 것을 발견했습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 CD 케이스</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boroslilicate 유리 모세관</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-15</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.5mm, 15cm. 필라멘트</td></tr><tr><td>없이 바늘 풀러</td><td>셔터 악기</td><td>P-87 또는 P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>탈착 가능한 마운팅 퍼티&nbsp;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>압축 가스 먼지 제거기</td><td>OfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>11231-30</td><td>듀목셀 #3 (딱정벌레를 조작하기 위함)</td></tr><tr><td>펜치</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>11252-20</td><td>INOX #5 (바늘 끝을 깨뜨리기 위함)</td></tr><tr><td>에틸 에테르, 무수물&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>플라이스터프/Genessee Scientific</td><td>57-102</td><td>120 &마이크로; m 기공 크기/49% 개방 영역</td></tr><tr><td>미디어 병, 100ml</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V12. 주입 현미경.</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Fisher/Zeiss</td><td>12-070-513&nbsp;</td><td>Stemi2000입니다. 바늘을 부러뜨리고 끈적끈적한 슬라이드에 유충을 놓는 데 사용합니다.</td></tr><tr><td>X-Y 기계식 스테이지&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>43546000000000000</td><td></td></tr><tr><td>X-Y 기계식 스테이지&nbsp;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>저렴한 대체</td></tr><tr><td>매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>자기 스탠드</td><td>Narishige</td><td>GJ-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 홀더</td><td>Narishige</td><td>IM-H1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 일회용 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lok 팁</td></tr><tr><td>사방향 스톱콕&nbsp;</td><td>콜 - 파머 악기 (주)</td><td>EW-30600-03</td><td>루어 연결이 있는 스톱콕; 4-방향; 남성 슬립</td></tr><tr><td>아트 페인트 브러시</td><td>아마존</td><td>아트 어드밴티지 오일 및 아크릴 브러시 세트, 24-피스</td><td>모든 일반 페인트 브러시가 작동합니다.</td></tr></tbody></table>

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 rna 간섭, tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

빨간 가루 딱정벌레, Tribolium의 castaneum는 완전히 주석 게놈 시퀀스, 트랜스포존 기반의 형질 전환 및 효율적인 RNA 간섭 (RNAi에) 포함하여 유전 및 발달 연구를위한 실험 도구의 레퍼토리를 제공합니다. 이러한 장점 중의 RNAi 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. T. castaneum 가능 단순히 딱정벌레의 체강에 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 주입하여 모든 삶의 단계에서의 RNAi를 수행하고, 강력한 전신의 RNAi 반응을 보여줍니다. 이 보고서에서 우리는 T. 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다 castaneum. 프로토콜 T.의 적절한 스테이지의 (ⅰ) 분리를 포함 주사 castaneum 유충, 사출 용 설정 (ⅱ) 제제, 및 (ⅲ) dsRNA를 주입. 애벌레의 RNAi는 기능 상실 phenotyp에 빠르게 액세스와 함께 우리를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다여러 유전자 녹다운 표현형뿐만 아니라 hypomorphic 표현형의 시리즈를 포함 에스. 거의 모든 T. 이후 castaneum 조직은 세포의 dsRNA에 취약, 유생의 RNAi 기술은 연구자들이 외부 환경에 반응 유기체의 유전 적 기초 등 다양한 상황에서 조직의 다양한 연구 할 수있다. 또한,이 기술의 단순함을 T., 연구 개 학생 참여를 촉진 교실 환경에서 사용하기에 이상적인 유전자 시스템을 castaneum.

성공적인 주입 주요 단계 중 하나는 좋은 바늘을 만드는 것이다. 단계 6에서 설명한 바와 같이, 니들의 팁은 종래 T. 주입로 세분화되어야 castaneum. 좋고 나쁜 바늘의 예를 그림 1에 나타내었다. 좋은 바늘은 약 0.05 mm 직경의 구멍 (그림 1B)로, 선명하고 단단한 팁이 있습니다. 도 2는 성공적인 주입 (도 2a 및도 2b)뿐만 아니라 실패한 주사 (도 2C-2F)의 몇몇 예를 나타낸다. 적절한 크기의 주사 바늘을 ​​사용, 바늘 끝은 최소한의 저항 (그림 2A)와 애벌레 표피를 관통하고, dsRNA에 용액 (녹색) 누출 (그림 2B)없이 유충으로 흐른다. 과다 주사로 그것을도 적절한 크기의 주사 바늘 (그림으로 dsRNA에 솔루션의 오버 플로우가 발생합니다하지 마십시오2C). 바늘의 선단이 너무 얇 으면, 바늘 끝이 어렵 주입 (도 2d)를 만들고, 유생 표피 및 굽힘을 침투하지 못한다. 이 경우, 트리밍 바늘 끝은 때때로 도움이됩니다. 큰 바늘 애벌레 표피 (그림 2E)를 관통에 어려움이기는하지만, 종종 계속 사용할 수 있습니다. 그러나, dsRNA를 용액의 많은 양이 쉽게 자주 dsRNA에 용액 (도 2F)의 오버플로의 결과에도 주입 주사기에 약간의 압력을 바늘로부터 압출된다. RNAi를 수행 할 때의 RNAi가 정상적으로 작동하고, 음성 대조군 관찰 효과의 dsRNA의 비특이적 효과 나 인한 이러한 부상 사출 절차 (의 결과가 아님을 확인하는 것을 평가하기 위해 포지티브 컨트롤하는 것이 중요 ) 에테르 마취에서 분사, 또는 이상에 의해. dsRNA를 대상으로 EYFP의 주입 역할을 할 수 있습니다양성 대조군 좋은 것은 PU-11 스트레인 5,7 사용시. EYFP하는 dsRNA가 최종 애벌레 단계에서 주입 될 때, 미래의 날개 primordia EYFP 신호에서의 상당한 감소는 초기 하루 포스트 분사 (도 3a)으로서 관찰 될 수있다. EYFP의 최저는 이일 EYFP dsRNA에 (그림 3B)의 주사 후 완료되고이 최저는 dsRNA에 농도가 충분히 (예 : 1 높은 경우 번데기 (그림 3C 및 3D)을 통해 딱정벌레의 전 생애에 걸쳐 지속 μg / μL) 7. EYFP dsRNA를 그것이 비 내인성 유전자 서열은 또한 같은 음성 대조군으로서 사용될 수 있고, 생리 학적 또는 중단 (도 3A-3D)를 일으키지한다. 우리는 어떻게 EF의 또 다른 예로서, 흔적 (VG)에 대한 애벌레의 RNAi의 이미지, 중요한 날개 유전자 (12)을 제공이 사출 기반의 RNAi 기술은 T.되어 fective castaneum. dsRNA에 대한 VG가 끝에서 두 번째 단계 유충 (최종 애벌레 단계 전에 1 단계)에 주입 될 때, 날개 구조의 완전한 손실 번데기 (도 3E 및 3F)에서 관찰 될 수있다. 얻어진 성인도 완전히 날개 구조 (도 3G 및 3H)으로 부족하다. VG에 대한 RNAi의 결과는 견고 함과 T.에서의 RNAi의 전신 한 자연을 예시 castaneum. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> 그림 1 : 끊어지지 않는 좋은, 나쁜 바늘 (A) 예 (B) 잘 깨진 좋은 바늘의 끝 (C)가 너무 크고 무딘 깨진 바늘의 끝 (D) 끝... 파산의 너무 얇은 n 개의 바늘입니다. 스케일 바 (빨간색)은 0.05 mm이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> 그림 2... (A)에 적당한 크기 주사 바늘이 지난 령 유충에 삽입 (B) 충 적절 녹색 dsRNA에 용액 주입, (C) 위에 주입에 의한 주입 지점에서 dsRNA를 용액의 오버플로 (D ) 유충 표피 침투하지 못하는 얇은 바늘. (E) 마지막 령 유충에 삽입 큰 주사 바늘. (F) 유충은 dsRNA를 용액 오버 플로우 및 누출의 결과, 큰 바늘 주사. 화살표는 바늘을 나타냅니다.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> 그림 3 : T. 성공의 RNAi의 예 castaneum. (AD) EYFP 발현 감소 EYFP dsRNA를 결과의 최종 애벌레 사출.에서 얻어진 (A) 유충 주입 후 일일. (B) 유충 주 사후 2 일후. (C) 제어 번데기. (D) 번데기 애벌레 EYFP dsRNA를 주입. 음성 대조군은 주사 버퍼 (A, B) 및 DsRed의 dsRNA를 주입 (C, D)이다. 화살촉과 화살이 EYFP 식을 표시 또는 각각 날개 primordia 눈에 그 부족합니다. (EH) 펜VG에 대한 궁극적 인 애벌레의 RNAi. (E) 야생 형 번데기. (F) VG의 RNAi 번데기. 날개 구조의 부족은 번데기 (화살표). G) 야생 형 성인. (H) VG RNAi의 성인에서 이미 볼 수 있습니다. 윙 관련 구조가 완전히 (화살표) 누락되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

RNA 간섭 (RNAi의) 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. 여기서 우리는 Tribolium의 castaneum 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다. 애벌레의 RNAi 연구자들이 다양한 상황에서 유전자의 기능을 연구 할 수 있도록, 기능 상실 표현형에 대한 빠른 액세스를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다.

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

이 절차의 전반적인 목표는 유충 체강에 이중 가닥 RNA 용액을 주입하여 붉은꽃딱정벌레 트리움 카듐(trium cadium)에서 RNA 간섭을 통해 관심 유전자를 녹다운하는 것입니다. 이것은 먼저 배양 꽃을 체로 치고 종자 팬에서 유충을 딱정벌레의 다른 단계와 분리하여 배양에서 유충의 적절한 단계를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 바늘 끝을 부러뜨려 바늘 홀더에 놓고 원하는 농도의 이중 가닥 RNA 용액을 바늘에 삽입하여 주사 바늘을 준비하는 것입니다.다음으로, 고립된 유충을 승인하고 유충을 끈적한 유리 슬라이드에 놓습니다. 마지막 단계는 해부 현미경으로 유충에게 이중 가닥 RNA 용액을 주입하는 것입니다. 궁극적으로 원하는 단계에서 RNAi 관련 표현형을 분석하여 표적 유전자의 기능을 결정합니다.신경 발생 또는 형질전환 발생과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 딱정벌레 체강에 이중선 가닥 RNA 용액을 간단히 주입하는 것만으로도 원하는 bedo 발달 단계에서 효율적이고 오래 지속되는 유전자 녹다운을 유도할 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 약간의 수정을 가하여 트리움 캐스틴 유충에 초점을 맞추지만, 주입 절차는 트리움, 캐스틴 및 기타 곤충의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 유충을 죽이지 않고 좋은 바늘을 만들고 적절한 양의 이중 가닥 RNA 용액을 주입하는 데 어려움을 겪을 것입니다.doublet stranded RNA 주입 및 바늘 준비 단계는 설명하기 어렵고 관찰 및 배양 실습을 통해서만 배울 수 있기 때문에 이 기술의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명 된대로 선택되는 차 캐스트 균주. 딱정벌레 배양 병 하나를 즉시 25번 체에 비우고 공격적으로 체질하여 나이가 많은 유충, 번데기 및 성충을 수집합니다.그런 다음 딱정벌레가 탈출하는 것을 방지하기 위해 엑수스와 함께 딱정벌레를 씨앗 팬으로 옮깁니다. 이제 씨앗 팬을 부드럽게 불어 딱정벌레 표면에서 엑수스와 꽃 입자를 제거합니다. 종자 팬을 두드려 가라앉힙니다.내용. 더 많은 이동성이 있는 성인이 더미에서 나올 때까지 기다렸다가 제거하여 퍼피 각도를 분리하고 팬을 약간 아래쪽으로 분리합니다. 부드럽게 두드려 굴리고 번데기를 제거하고 종자 팬에 유충만 남깁니다.이제 고립된 유충을 깨끗한 페트리 접시에 넣으십시오. 현미경으로 주입할 원하는 유충 단계를 선택하고 승인될 때까지 페트리 접시에 보관합니다. 딱정벌레의 나머지 단계를 결합하여 배양 병에 다시 넣으십시오.뽑은 유리 바늘을 유리 현미경에 부착합니다. 해부 현미경 아래로 미끄러져 들어갑니다. 팁이 구부러지는 위치를 찾습니다.끝 쪽쪽으로 약간 잡고 비틀어 부러뜨리면 유충 표피가 최적으로 침투할 수 있으며 직경이 약 0.05mm인 각진 구멍이 있는 바늘을 선택합니다. 이제 바늘 홀더의 끝을 푸십시오. 바늘의 뒤쪽 끝을 홀더 팁에 넣고 고무 개스킷을 홀더 팁 아래에 놓습니다.그런 다음 바늘 뒷면을 홀더에 삽입하고 고무 개스킷이 구멍에 삽입되었는지 확인합니다. 팁을 홀더에 다시 나사로 고정합니다. 이제 조립된 바늘 홀더를 바늘 조작기에 놓습니다.바늘 끝이 현미경 시야 아래 중앙에 오도록 위치를 조정합니다. 주입 직전에 이중 가닥 RNA 용액을 준비합니다. 20 마이크로 리터 일회용 피펫 팁의 끝을 자릅니다.이제 10 마이크로 리터의 용액을 트리밍 된 피펫 팁에 피펫으로 넣습니다. 배압을 제공하여 팁에 유체를 유지하면서 피펫에서 피펫 팁을 조심스럽게 제거합니다. 이중 가닥 RNA 용액이 있는 피펫 팁을 현미경 스테이지에 놓습니다.현미경을 통해 바늘 끝이 주입된 피펫 팁 바로 안쪽과 용액 안으로 들어갈 때까지 주입된 팁을 바늘 쪽으로 천천히 움직입니다. 그런 다음 주사기 주사기의 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 바늘에 과부하가 걸리지 않도록 용액을 천천히 바늘로 당깁니다. DS RNA 용액의 끝이 바늘 끝에 가까워짐에 따라 바늘 끝이 공기에 도달하기 전에 당기는 속도를 늦추고 용액 로딩을 중지하여 바늘 홀더로 빠르게 흡수되는 것을 방지합니다.스톱 콕을 열어 주입 주사기와 바늘 홀더의 압력을 제거합니다. 그런 다음 피펫 끝을 바늘 끝에서 멀리 이동합니다. 이제 바늘을 스테이지 위로 올리고 현미경 스테이지에서 비워진 파이펫 팁을 제거합니다.유충을 전자 인증 바구니에 넣은 다음 바구니를 에테르 병에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 3분 후 유충이 움직이는지 확인하십시오. 그래도 움직이면 에테르 병에 다시 30초 동안 더 넣으십시오.E 인증 유충을 바구니에서 끈적끈적한 유리 슬라이드의 달라붙지 않는 가장자리로 옮깁니다. 유충을 슬라이드로 순차적으로 옮깁니다. 각각을 옆으로 놓습니다.집게로 몸통을 머리부터 꼬리까지 부드럽게 두드리고 약간 늘려 유충을 슬라이드에 고정합니다. 이제 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 배치합니다. 이중 가닥 RNA 장전 바늘을 유충의 등쪽 쪽에 부드럽게 삽입하고 단계를 사용하여 유충을 바늘로 이동합니다.그런 다음 DS RNA를 위해 바늘을 약간 뒤로 당깁니다. 유충 체강에 들어가려면 유충이 녹색으로 변하고 늘어나고 꽉 찬 것처럼 보일 때까지 주사기를 부드럽게 누르십시오. 그런 다음 주사기를 살짝 뒤로 당기면서 유충의 바늘을 제거합니다.슬라이드에 모든 유충을 주입합니다. 성공적으로 주입되지 않은 유충을 제거하십시오. 모든 유충이 E 승인에서 회복될 때까지 주입된 유충을 따로 보관하십시오.이제 머리에서 꼬리까지 유충을 부드럽게 들어 올려 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 주입 상처가 응고될 수 있도록 최소 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 배양, 주입 된 유충을 섭씨 30도에서 70 % 습도로 만듭니다. RNAI 표현형에 대한 유충을 정기적으로 관찰하십시오.이러한 예는 적절한 크기의 주삿바늘을 사용하여 마지막 instar 유충에 녹색 이중 가닥 RNA 용액을 주입하는 다양한 성공 수준을 보여줍니다. 바늘 끝은 최소한의 저항으로 유충의 표피를 관통하고 녹색 DS RNA 용액은 누출 없이 유충으로 흘러 들어갑니다. PU 11 균주에서 향상된 황색 형광 단백질은 이중 가닥 RNA 주입 실험을 위한 우수한 양성 대조군 역할을 할 수 있습니다.마지막 유충 단계에서 EYFP DS RNA를 주입하면 주입 후 하루 이내에 미래 날개 원시 단계에서 EYFP 신호의 현저한 감소를 관찰할 수 있습니다. EYFP 발현의 녹다운은 일반적으로 주입 후 2일 후에 관찰할 수 있으며, DS RNA 농도가 충분히 높으면 동공 단계를 통해 그리고 딱정벌레의 수명 동안 지속됩니다. EYFP는 비내인성 유전자 염기서열이기 때문에 이 유전자는 형태학적 또는 생리학적 파괴를 일으키지 않는 음성 대조군으로도 사용될 수 있습니다.이 실험에서는 중요한 날개 유전자인 흔적을 위한 이중 가닥 RNA를 끝에서 두 번째 단계의 유충에 주입했습니다. 날개 구조의 완전한 손실은 동공 단계에서 관찰 할 수 있습니다. 그 결과 성체는 날개 구조가 완전히 부족합니다.마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 이 기술을 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 정량적 real-time PCR in situ hybridization 또는 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행하여 개발 후 표적 유전자에 의해 어떤 유전자가 조절되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 복잡한 유전학 기술을 활용하지 않고 트라움 카스텐에서 기능 상실 분석을 수행하고 배아 단계를 사후 수행할 수 있는 길을 열었습니다.이 방법의 단순한 특성으로 인해 교육 환경에도 매우 적합합니다. 이 동영상을 보고 나면 주사에 적합한 사랑의 단계를 선택하는 방법, 주사 바늘을 만드는 방법, 이중 표준 RNA의 허용 주입을 성공적으로 수행하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 Trium의 레벨 RNI를 통해 유전자의 기능을 평가할 수 있습니다.

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을...

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

이 비디오는 예쁜꼬마선충에서 RNAi 처리의 원리를 설명하고 형질전환 웜 균주에서 lin-35를 knockdown하는 프로토콜을 보여줍니다.

예쁜꼬마선충 공급을 위한 RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata:...

오도나타에서 전기 기화 매개 RNA 간섭 방법

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

RNA 간섭(RNAi)의 조작은 Trichogramma 말벌과 같이 크기가 작은 많은 기생충 종에서 만만치 않은 도전을 제시합니다. 이 연구는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 설명했습니다. 본 방법론은 Trichogramma 말벌의 유전자 조절을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공합니다.

계란 기생충의 RNA 간섭, Trichogramma dendrolimi Matsumura

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT의 절연 (대한 방법을...

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

배우세요 Tribolium castaneum 애벌레 RNA 간섭 기법으로 유전자 기능을 연구하는 방법입니다. 이 실험은 주사를 통해 효율적인 유전자 녹다운을 가능하게 하며 발달 생물학 및 유전학 연구에 활용됩니다.

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, Tribolium castaneum

더 많은 동영상 탐색