Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면
2014년 11월 8일
제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.
다음 실험의 전반적인 목표는 수동 샘플 처리를 사용하여 제브라 피쉬 배아에서 화학적 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 성인 얼룩말 물고기를 칸막이가 있는 짝짓기 방에 밤새 넣은 다음 다음 날 아침 배아를 수집하기 위해 칸막이를 제거함으로써 달성됩니다. 다음으로 제브라피시 배아 그룹을 96개의 웰 플레이트에 배열한 다음 원하는 발달 단계에서 약물로 처리합니다.
그런 다음 배아를 4% 파라알데히드로 고정하여 발달시키고 분석하여 관심 있는 발달 과정에 대한 작은 분자의 영향을 측정합니다. 결과는 유전자 발현 도메인의 획득 또는 손실과 같은 발달 변화를 보여주며, 이는 조사된 작은 분자에 의해 야기된 황산염 또는 조직 형태 형성의 변화를 나타낼 수 있습니다. 이 기술의 의미는 잠재적으로 치료 가능한 화합물을 식별할 수 있는 능력 때문에 다양한 질병에 대한 임상 치료로 확장됩니다.
일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 배아를 손상 없이 다중 웰 플레이트 간에 이식하는 것과 같이 배아 작업에 필요한 민첩성을 습득해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 저와 얼룩말 물고기 짝짓기를 설정하는 실험실의 학부 연구원인 Eric Donahue가 할 것입니다. 칸막이가 있는 짝짓기 챔버를 사용하여 성인 수컷 얼룩말 물고기를 칸막이의 한쪽에 놓고 성인 암컷 얼룩말 물고기를 다른 쪽에 놓습니다.
테스트할 소분자의 96웰 플레이트마다 대해. 25개의 짝짓기 탱크를 설치하고 밤새 그대로 두십시오. 다음날, 각 물고기 쌍을 분리하는 챔버를 제거하고 1시간 후에 미세한 메쉬 스트레이너를 사용하여 배아를 수집한 후 전사 피펫이 있는 E 3 배지가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
플레이트와 입체경 아래에서 이물질을 제거합니다. 배아의 각 클러치를 관찰하고 수정되지 않은 난자를 제거합니다. E 3 매체를 디캔팅하고 새로운 E 3으로 교체하십시오.
그런 다음 배아의 각 접시를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다. 접시를 다시 확인하고 수정되지 않은 추가 난자를 버리십시오. 배아를 40%eely 단계까지 계속 배양합니다.
화학 라이브러리 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 제거합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 덮고 8채널 피펫으로 실온에서 해동시킵니다. 99 마이크로 리터의 E 3을 96 웰 플레이트의 2 열에서 12 열에 추가합니다.
그런 다음 1 마이크로 리터의 적절한 화합물을 2 열에서 11 열의 웰에 추가하고, 실험 샘플로 지정된 1 마이크로 리터의 DMSO를 12 열로 설계된 제어 열에 추가합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 희석판을 덮고 재고 화학 물질 라이브러리를 냉동실에 다시 넣습니다. 다음으로, 40%epi 단계에서 배아가 들어 있는 페트리 접시를 선택한 후 전달 피펫을 사용하여 웰당 약 10개의 배아를 96열 중 2열에서 12열에 조심스럽게 배치합니다.
웰 플레이트. 유리 전사 피펫을 사용하여 각 웰에서 초과 E 3개를 제거하고 액체 폐기물 용기로 배출합니다. 배아를 화학적으로 처리하려면 96개의 웰 플레이트에서 각 화학 희석액 100마이크로리터를 배아의 각 웰로 옮겨 종이 타월로 습한 챔버를 만들고 빛에 민감한 용기에 넣습니다.
96웰 플레이트를 수용할 수 있을 만큼 큽니다. 그런 다음 천장 매트를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 빛에 민감한 용기에 넣고 원하는 시간 동안 섭씨 28.5도에서 배양합니다.
화학 물질을 제거하려면 약물 처리 된 우물의 각 행에 300 마이크로 리터의 E 3을 첨가하십시오. 그런 다음 E 3을 사용하여 배아를 세 번 세척하여 배아를 고정하기 전에 배지를 제거하고 어두운 배경 앞에 피펫을 배치하는 4개의 레이블이 지정된 24웰 플레이트로 옮깁니다. 피펫에 남아 있는 배아를 식별하고 교차를 방지하기 위해 각 웰 이식 후 죽은 배아를 제거합니다.
배아가 액체에 거의 잠기지 않도록 E 3을 뽑아냅니다. 그런 다음 유리 피펫을 사용하여 밀리리터 프로나제당 50밀리그램을 두 방울 떨어뜨립니다. 글쎄, 우물을 휘젓기 전에 5 분 동안 배아를 부화시켜 코리안을 분해하십시오.
E 3을 사용하여 배아를 두 번 씻은 후 나머지 E 3을 뽑아내고 버립니다. 각 웰에 4%P-F-A-P-B-S를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배아를 배양합니다. 그런 다음 홀 마운트 in situ hybridization과 같은 관심 스크리닝을 수행하거나 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 화학적 스크리닝에서 배아의 점수를 매깁니다.
이 다이어그램에 설명된 대로 실체 현미경을 사용하여 관찰하기 전에 레이블이 지정된 12개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 한 사람이 9주간의 헌신적인 노력으로 약 600개의 화합물에 대한 화학적 유전자 검사를 수행하는 것은 실용적이며, 3명이 수행하면 그 시간을 3주로 줄일 수 있습니다. 따라서 한 명 또는 몇 명의 벤치 타임은 자동화 시스템과 같이 자원이 많이 필요한 장비의 필요성을 우회할 수 있습니다.
여기에서 볼 수 있듯이, 얼룩말 물고기 배아를 생체 활성 라이브러리의 개별 화합물을 사람의 50%에서 24 HPF까지 적용한 다음, 네프론 세그먼트를 검출하기 위해 3개의 리보 프로브의 칵테일을 사용하여 원하는대로 분석했습니다. 예를 들어, 등급 시스템, 극적으로 확대된 근위 나선형 세뇨관 또는 PCT를 초래한 화합물은 클래스 1로 분류되며, 이는 관찰된 표현형에서 가장 심각한 결함 및 가장 높은 수준의 신뢰도와 관련된 클래스를 나타냅니다. 그런 다음 화합물에 클래스 1 PCT로 주석이 추가됩니다.
또한 이 분류는 유기체에 미치는 영향의 심각성, 약물의 영향을 받는 영역, 영역이 영향을 받는 방식을 포함하여 관심 있는 작은 분자를 설명하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다. 이 절차를 시도하는 동안 올바른 발달 시점에 배아를 단계화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 배아로 수동 화학 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
개요
이 기사는 전체 장착 현장 하이브리드화(WISH)를 이용하여 제브라피쉬 배아에서 수동 고처리량 화학 스크리닝을 수행하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 제브라피쉬는 척추동물 발달과 인간 질병을 연구하는 데 귀중한 모델로 사용됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발달 생물학
- 약리학
배경
- 제브라피쉬는 투명한 배아로 인해 발달 생물학에서 널리 사용됩니다.
- 고처리량 스크리닝은 다수의 화합물을 효율적으로 평가할 수 있게 합니다.
- 전체 장착 현장 하이브리드화는 유전자 발현을 시각화하는 데 사용되는 기술입니다.
- 이 연구는 발달 과정에 영향을 미치는 작은 분자를 식별하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 제브라피쉬 배아에서 화학 스크리닝을 위한 수동 방법을 개발합니다.
- 작은 분자가 유전자 발현과 조직 형태 형성에 미치는 영향을 평가합니다.
- 이 기술에 익숙하지 않은 연구자들이 사용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 제브라피쉬 배아를 수집하기 위한 교미 챔버 설정.
- 약물 처리를 위해 96웰 플레이트에 배아를 배열합니다.
- 전체 장착 현장 하이브리드화를 사용하여 유전자 발현 변화를 평가합니다.
- 발달 표현형에 대한 영향에 따라 화합물을 분류합니다.
주요 결과
- 화학 처리로 인한 제브라피쉬 배아의 발달 변화 식별.
- 관찰된 결함의 심각성에 따른 화합물 분류.
- 최대 600개의 화합물에 대한 수동 스크리닝의 실현 가능성 시연.
- 치료 화합물 식별에 대한 잠재적 영향.
결론
- 수동 화학 스크리닝 방법은 발달 과정을 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 치료 잠재력이 있는 화합물의 발견을 촉진할 수 있습니다.
- 정확한 결과를 위해서는 배아의 적절한 단계 설정이 중요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Manual high-throughput small molecule screening in zebrafish embryos enables early-stage target validation and phenotypic assessment without the need for automated platforms. This approach supports rapid hypothesis testing and functional de-risking in discovery biology, making it accessible for diverse R&D teams. The method provides a scalable entry point for identifying compounds with developmental or disease-modifying effects, directly informing portfolio triage and lead prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-organism vertebrate context.
- Supports functional target validation by visualizing gene expression and tissue morphogenesis changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of compound-induced phenotypes.
- Provides actionable data for predictive confidence in early-stage compound selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish embryo systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via standardized WISH-based readouts.
- Enables scalable screening of up to hundreds of compounds with minimal infrastructure.
- Supports reliable evaluation of compound effects on developmental processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic screening with disease-relevant developmental pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking gene expression changes to organismal outcomes.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on observed severity and specificity of phenotypes.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification when supported by gene expression data.
Pipeline & Workflow Integration
This manual screening protocol bridges early discovery and lead identification by enabling functional assessment of small molecules in a vertebrate model. It integrates with workflows requiring hypothesis testing, phenotypic screening, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of compound effects on developmental pathways and gene expression.
- Screening: Provides assay-ready zebrafish embryos and standardized WISH outputs for reproducible screening.
- Analytics: Enables classification and quantitative scoring of phenotypic outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic findings to disease models and potential biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing compound library evaluation and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible results without reliance on high-cost automation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of promising compounds.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish embryo handling and WISH analysis.
- Needs basic laboratory infrastructure, including multi-well plates, pipettes, and stereomicroscopy.
- Demands cross-team standardization for staging, scoring, and data annotation.
- Adaptable to various developmental stages and gene targets within zebrafish models.
- Manual throughput is limited by personnel availability and dexterity with embryo manipulation.
