사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

이 절차의 전반적인 목표는 세포 배양에서 개별 플라크를 계수하여 감염성 변이의 정량화를 통해 바이러스 농도를 측정하는 것입니다. 이는 감염을 위한 융합 단층을 형성하기 위해 먼저 세포를 도금함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 정량화할 미확인 바이러스 샘플의 연속 희석을 수행하는 것입니다.

다음으로, 합류 단층은 바이러스 스톡의 연속 희석을 사용하여 감염된 다음 고정 오버레이를 적용합니다. 마지막 단계는 신중한 플라크를 계수하기 위해 해당 바이러스에 대한 적절한 배양 시간 후에 플라크를 고정하고 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 플라크 분석은 알려지지 않은 바이러스 샘플의 바이러스 역가를 결정하기 위해 여러 가지 다른 방법으로 사용 및 수정될 수 있습니다.

반고체 오버레이(semi-solid overlay)와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량과 기존 응용 프로그램 모두에서 적용 및 제거가 훨씬 간단하다는 것입니다. 또한 시약의 가열이 필요하지 않습니다. 이 기술의 의미는 액체 오버레이의 사용과 같은 다양한 용해성 바이러스에 대한 연구로 확장됩니다.

96웰 형식에서는 새로운 치료 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있으며, 이는 분석 플레이트 전날에 감염 당일 90-100% co-유창성을 달성하기 위해 기존 플라크 분석을 수행하는 실험실에서 보내는 오랜 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 원액은 또한 분석 전날 준비할 수 있으며, 먼저 5.56ml의 36% 스톡 포름알데히드와 14.44ml의 증류수를 혼합하여 증류수에 10%포름알데히드의 고정 용액을 준비할 수 있습니다. 그런 다음 증류수로 희석 된 20 % 에탄올에 1 % 크리스탈 바이올로 구성된 크리스탈 바이올렛 염색을 준비합니다.

다음으로, 멸균 상태에서 작업하는 동안 사용 중인 세포 유형에 적합한 2개의 x 플라크 배지를 준비합니다. 시약이 멸균되지 않은 경우 0.2 미크론 필터를 통해 용액을 필터링합니다. 플라크 분석에 사용할 액체 오버레이를 준비하기 위해 교반 막대와 빠르게 혼합되는 97.6ml의 증류수가 들어 있는 플라스크에 2.4g의 avy cell에서 분석합니다.

교반 막대에 비해 너무 점성이 높아질 때까지 용액을 실온에서 혼합합니다. 이 시점에서 플라스크를 플라스크 셰이커에 옮기고 균일한 균질화를 보장하기 위해 30분 동안 심하게 교반합니다. 마지막으로 섭씨 121도에서 14PSI에서 30분 동안 용액을 오토클레이브합니다.

그리고 프로그램이 끝나면 aros 오버레이를 위해 실온에서 밀봉하여 보관하십시오. 증류수에 0.6% 농업 원료 용액을 준비합니다. 교반 막대 및 오토클레이브와 혼합하여 용액 또는 카르복시 메틸셀룰로오스 오버레이로 가져옵니다.

증류수에 2% 카르복시 메틸셀룰로오스 용액을 준비하고 도금 다음날 이전과 같이 오토클레이브보다 혼합합니다. 분석을 시작하기 전에 도립 현미경을 사용하여 세포의 co-fluency와 viability를 확인합니다. 세포가 표준 세포 형태와 약 90%co 유창성을 나타내는지 확인합니다.

세포 성장 배지에서 감염 샘플의 10배 연속 희석을 수행하여 해당 바이러스의 예상 역가에 따라 필요한 희석 횟수를 변경합니다. 또한 감염되지 않은 대조군 샘플을 준비하여 세포 생존력을 독립적으로 보장하고 플라그 식별을 돕습니다. 감염되지 않은 대조군과 연속 희석액을 플레이트의 웰에 피펫으로 주입하고 단층이 방해받지 않도록 주의합니다.

세포를 덮을 수 있도록 충분한 양의 접종물을 사용하되 단층과의 바이러스 접촉을 최대화하기 위해 부피를 가능한 한 낮게 유지합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣고 20분마다 45분에서 1시간 동안 세포를 감염시킵니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 균일한 적용 범위를 보장하고 감염 중에 세포 단층이 건조되는 것을 방지합니다.

액체 오버레이를 위한 오버레이 작업 솔루션을 준비합니다. 가온된 플라크 매체와 1.2 - 2.4%의 실온 스톡 avy 셀을 일대일 비율로 혼합하여 0.6 - 1.2% avy 셀 오버레이 매체 또는 AROS 또는 CMC 오버레이 혼합 온열 플라크 매체의 작업 용액과 가열된 0.6% AROS 또는 2% CMC의 원액을 일대일 비율로 얻습니다. 그런 다음 섭씨 56도의 수조에 넣고 온도 평형을 위해 30분 동안 놓습니다.

용액이 따뜻하지만 만졌을 때 뜨겁지 않은지 확인하여 세포 사멸과 바이러스 역가 감소를 방지합니다. 감염 후 분석중인 바이러스에 따라 섭씨 37 도에서 5 % 이산화탄소로 2-14 일 동안 오버레이 인큐베이트 플레이트를 추가 한 후 감염된 단층에 오버레이를 적용하여 액체 오버레이로 세포를 고정하고 전자 세포 오버레이를 붓거나 흡인 한 다음 10 % 포름 알데히드 용액을 우물에 피펫으로 넣고 하룻밤 또는 aros 또는 CMC에서 30 분 동안 실온에서 고정합니다. 포름알데히드 용액을 오버레이에 1시간 동안 첨가하여 고정 후 실온에서 하룻밤 동안 포름알데히드를 버리고 주걱으로 아로가 있는 반고체 플러그를 수동으로 제거합니다.

염색하기 전에 잔류 오버레이 고착제를 제거하기 위해 비세포 플라크를 물로 헹굽니다. 염색하려면 약 15분 동안 최소량의 크리스탈 바이올렛 용액으로 세포를 덮습니다. 균일한 적용 범위를 보장하기 위해 필요한 경우 플레이트를 흔듭니다.

크리스탈 바이올렛 얼룩은 물로 부드럽게 씻어내고 고정하고 염색 및 건조하면 향후 분석을 위해 플렉스를 무기한 보관합니다. 각 우물에 있는 플라크를 세고 5개 미만 또는 100개 이상의 플라크가 있는 우물을 할인합니다. 동일한 희석액의 기술적 반복에 대한 평균을 구합니다.

플라그의 크기와 형태를 기록해 두십시오. 원유 샘플의 바이러스 역가는 희석에 대한 평균 플라크 수와 총 희석 계수의 역수를 취하여 결정합니다. 이 이미지는 12개의 웰 플레이트를 사용하여 12개의 웰 플레이트를 사용하여 12개의 웰 플레이트에 있는 5번째 세포의 2.5배, 10개에 도금하고 MP 12의 동일한 연속 희석 시작 샘플을 사용하여 200마이크로리터로 감염된 Rift Valley 열병 바이러스 플라크 오버레이 비교를 보여줍니다.

감염 후 0.3%aros, 0.6%AVY 또는 1%CMC의 1.5ml 오버레이를 적용하여 오버레이를 직접 비교했습니다. 이 히스토그램은 세 가지 오버레이 모두에 대한 플라크 수 및 적정 결과를 보여줍니다. 여기. 12개의 웰 플레이트를 사용한 ViiV 플라크 오버레이 비교는 감염 후 ViiV TC 83 백신 균주의 동일한 직렬 희석 시작 샘플을 사용하여 200마이크로리터 부피로 감염된 국을 이전과 같이 도금하고 200마이크로리터 부피로 감염시켰으며, 0.3%aros, 0.6%avy 세포 또는 1%CMC의 1.5ml 오버레이를 이전과 같이 적용했습니다.

다시 말하지만, 히스토그램은 세 가지 오버레이 모두에 대한 플라크 계수 및 역정의 결과를 보여줍니다. 이 이미지는 고처리량 플라크 오버레이의 예를 보여줍니다. 웰당 4번째 세포 중 10개를 3회 플레이팅한 VIR의 96웰 플레이트에 50마이크로리터의 접종물을 사용하여 50마이크로리터의 접종물로 감염시켰고, 오버레이 0.6 및 1.2%에 대한 쿼드 복제로 1시간 동안 avy 세포의 최종 농도를 시험하여 높은 처리량 방식으로 액체 오버레이를 활용하는 타당성과 재현성을 결정하기 위해 시험했습니다.

이 히스토그램은 각 오버레이에서 결정된 역가를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 바이러스는 서로 다르며 다른 세포 유형, 배양 시간 및/또는 성장 배지를 활용하는 등의 최적화가 필요할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 액체 및 반고체 오버레이를 모두 사용하여 기본 플라크 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.