Name: 엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 학습하세요 EPA 방법 1615를 사용하여 환경 및 음용수에서 장바이러스를 샘플링하는 표준화된 절차를. 전기양성 필터를 활용한 이 방법은 노로바이러스와 엔테로바이러스 검출률을 향상시켜 수질 모니터링의 신뢰성을 높입니다.

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저자는 그의 공헌 ICR과 동안 진행 모니터링을 만든 수많은 EPA 직원을 감사 할 수 UCMR3,보고 다른 EPA 연구의 다음 리드 연구자 : 다니엘 Dahling, 알프레드 푸르, 안드레이 에고 로프, 수잔 Glassmeyer, Asja Korajkic, 리처드 리버맨, 로버트 Safferman, 그리고 팀 웨이드; 결정적으로이 원고를 검토 섀넌 그리핀과 마이클 도자기합니다. 저자는 시료 채취를 보여주기 위해 자신의 펌프 주택 중 하나의 사용을 인도 힐 물 작품 감사합니다. 이 작품은 USEPA 검토 및 게시를 위해 승인되었지만, 반드시 공식 기관의 정책을 반영하지 않을 수 있습니다. 상표 이름 또는 상업적 제품에 대한 언급은 사용 승인 또는 추천을 구성하지 않습니다.

1. 예비 절차 <ol><li> 보충 자료에 기술 된 바와 같이 흡기 모듈 카트리지 하우징 모듈, 및 배출 모듈로 이루어진도 1에 도시 된 바와 같이 표준 필터 장치를 조립한다. </li><li> 처음 사용하기 전에 샘플링에 사용되는 유속 유량계 / 적산을 보정합니다. 첫 번째 사용 후 교정을 확인하고 사용 후 1 개월 후. 유량 교정 중 제 사용 후 또는 사용 첫 달 후에 변경된 경우 보충 자료에서 설명한 바와 같이, 보정 확인의 주파수를 결정한다. <ol><li> 흡기 모듈에 방전 모듈을 연결 한 후 탭에 흡기 모듈을 연결합니다. 유량을 읽​​어 유량계 / 적산을 설정한다. 완전히 탭 켠 다음 청동 글로브 밸브를 사용하여 10 L / 분의 유량을 조정합니다. 유량은 10 L / 분으로 안정되면, 총 부피를 읽어 유량계 / 적산 재설정. </li><li> 밖으로 배치4 L로 배출 모듈의하자 또는 더 큰 실린더를 졸업하고 동시에 제로로 적산을 재설정합니다. 4-L 시점에서 적산계와 실린더에 4 L 점수에 도달하는 데 필요한 시간을 측정한다. 유량을 다시 설정 유량계 / 적산을 변경합니다. 참고 : 유량이 아래 9.95 L로 떨어 뜨리거나 단계 1.2.2를 완료 한 후 이상 10.05 L로 증가했다 경우 유량이 안정적이고 반복 단계 1.2.2 때까지 기다립니다. 올바르게 교정 미터는 4.0 ± 0.04 L.의 적산계 24 ± 1 초에 눈금 실린더에 4 L 점수에 도달합니다 </li><li> 적산계 미만 또는 3.96 이상 4.04 L 인 경우, 관찰 된 차이를 조정하기 위해 필요한 보정 계수를 계산한다. 유량계 / 적산 눈금 실린더에 4 L 표선에서 3.9 L를 읽는 경우, 예를 들어, 보정 계수는 1.026 (4 ÷ 3.9) 일 것이다. 필드 샘플의 원하는 용적은 300 L였다 따라서 경우 ​​볼륨은 R을 따라 수집유량계 / 적산에 eading는해야 300 ÷ 1.026 = 292.4 L. </li></ol></li><li> 표준 필터 장치를 소독하고 시료 채취 준비를합니다. <ol><li> 어느 완전히 솔루션 모듈을 침지 또는 모듈은 펌프를 이용하면서도, 차아 염소산 나트륨을 순환함으로써 각각의 사용 전에 적어도 30 분 동안 0.525 %의 차아 염소산 나트륨 섭취량 및 카트리지 하우징 모듈 멸균. 멸균 dH보다 2 O 모듈로 헹구어 낸 후 5 분 동안 멸균 시약 등급 물 리터당 1 M 티오 황산나트륨 50 ㎖를 함유하는 용액에서 탈염 소화. 필터 샘플링 장치 모듈은 무균 알루미늄 호일로 끝나는 커버. </li><li> 카트리지 하우징 모듈 무균에 전성 카트리지 필터를 추가합니다. 참고 :이 카트리지 필터가 제대로 하우징에 장착하기 위해주의하십시오. 올바르게 장착 필터는 누설되지 않으며 흔들어도 필터는 하우징 내에서 이동하지 않는다. AP에 가스켓roperly 장착 필터는 어디 필터 접점을 보여주는 볼 들여 쓰기를해야합니다. 가스켓은 항상 필터 하우징으로부터 제거 직후 만입 점검되어야한다. </li><li> 샘플 데이터 시트의 고유 샘플 번호를 기록 (예를 들어 보충 자료 참조) 다음 걸릴 또는 샘플에 관한 필요한 지시를 따라, 필터 샘플링 장치 및 필드 샘플을 수집되는 개인에 대한 샘플 데이터 시트를 제공 컬렉션 (예를 들어, 샘플 볼륨, 샘플링 위치 등). </li></ol></li></ol> 샘플링 사이트에서 샘플 컬렉션 2. 준비 <ol><li> 수거 장소에 도착했을 때 손을 씻으 샘플 오염 가능성을 최소화하기 위해 수술 장갑을 돈. 장 또는 호흡기 증상을 경험하는 경우 샘플을 수집하지 마십시오. 변경 장갑은 자주, 특히 수도꼭지 및 기타 항목을 터치 한 후 계속 될 수 있음아미 노화. </li><li> 샘플 데이터 시트에 대한 정보를 추적 기록 관련 샘플. 관련 정보는 사이트 및 샘플 식별, 샘플러의 이름 및 장비 모델과 일련 번호를 포함한다. </li><li> 라인에 정착 한 모든 파편을 취소 한 2-3 분 동안 수도꼭지를 켭니다. 필요한 경우,이 단계에 도달하는 드레인 정원 호스 또는 튜브를 사용한다. </li><li> 샘플링 장치 모듈이 연결되어있을 경우, 그것들을 분리하고 멸균 호일로 카트리지 하우징 모듈의 개방 단부를 보호한다. 흡기 모듈에 방전 모듈을 연결 한 후 수도꼭지에 모두 연결합니다. 방전 모듈의 끝에서 정원 호스를 연결하고 1 L 폴리 프로필렌 용기의 끝을 배치합니다. </li><li> 탭의 전원을 켜고 물을 최소 75 L이 장치를 통해 샘플링 패스. <ol><li> 측정 및 폴리 프로필렌 용기 염소 잔유로 흐르는 물에 세척 기간 동안 물 품질 파라미터를 기록연간, 산도, 온도, 탁도. </li><li> 수돗물에서 물을 끈 후, 흡기 모듈로부터의 방전 모듈을 분리 한 다음, 흡기 모듈의 출구와 카트리지 하우징 모듈의 출구로 배출 모듈 카트리지 하우징 모듈을 연결한다. 제로에게 책을 읽어 적산계를 재설정합니다. </li></ol></li></ol> 3. 필드 샘플 컬렉션 <ol><li> 날짜와 시간으로 초기 적산계를 함께 기록하고 천천히 수도꼭지를 엽니 다. <ol><li> 카트리지 하우징이 수직 위치에 있는지가 완전히 물을 채우고 있는지 확인합니다. 일부 하우징은 충전 공정 동안 하우징으로부터 공기를 배출하도록 가압 될 수 벤트 버튼을 가지고있다. </li><li> 완전히 탭을 엽니 다. 청동 글로브 밸브를 이용하여 10 L / 분의 유량을 조정하고, 초기 유동 속도를 기록한다. </li></ol></li><li> 표면의 물 300 L 또는 장치를 통해 지하수의 1,500 ~ 1,800 L 사용하여 전달적산 수치 (필요한 경우로는, 조정). 필요한 부피 전에 필터 막힘 도달 절반 이상 부피가 수집 된 경우, 가능한 경우, 잔여 시료를 수집하는 제 2 필터 하우징 모듈을 사용한다. </li><li> 샘플 량은 샘플링주기의 단부에 접근함에 따라 유량을 관찰 한 다음 샘플 수돗물에서 물의 흐름을 해제. 최종 유속, 날짜, 시간, 최종 적산계, 및 총 샘플 부피를 기록한다. </li><li> 탭에서 필터 샘플링 장치를 분리합니다. 다른 모듈에서 카트리지 하우징 모듈을 분리합니다. <ol><li> 거꾸로 필터 하우징 (들)을 켜고 여분의 물이 모두 입구와 출구 포트에서 배출됩니다 더 이상 물까지 유출 할 수 있습니다. </li><li> 똑바로 주택을 켜고 멸균 알루미늄 호일 양쪽 끝의 빠른 연결을 커버합니다. 하나 이상의 밀봉 비닐 봉지에 주택을 놓습니다. </li><li> 섭취와 D에서 물을 드레인ischarge 모듈. 하나 이상의 밀봉 비닐 봉지에 모듈을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 필드 샘플 4. 출하 <ol><li> 절연 저장 및 전송 쿨러에 필터 샘플링 장치 모듈을 놓습니다. </li><li> 스토리지에 얼어 붙은 얼음 팩 또는 이중 겹으로 싸서 얼음 조각을 추가하고 샘플 출하시 ~ 10 ° C의 사이에 유지되도록하는 쿨러​​ 운반 할 것. 큰 두 개 6-8 작은 얼음 팩은 충분합니다. </li><li> 얼음 팩이나 얼음 가방에 접촉하지 않고있는 위치에 절연 저장 및 전송 가슴에 온도 기록 장치를 놓습니다. 주 : 분석 실험실 바로 도착시 카트리지 하우징과 용기의 개구부의 온도를 측정하는 적외선 체온계 시각적 사용할 경우 온도 기록 장치는 선택 사항이다. </li><li> 포장 재료를 어떤 빈 공간을 채우고 다음 t에 밀봉 비닐 봉지에 보호 샘플 데이터 시트를 배치작전. 이 물 누출을 방지하기 위해 절연 저장 및 전송 가슴과 테이프를 닫습니다. </li><li> 전송 또는 분석 실험실에 샘플을 보내주십시오. 샘플 현장 시료 채취 시작 후 늦어도 24 시간보다 분석 실험실에 도착 없는지 확인합니다 (즉, 3.1 단계에서 기록 된 시간). </li></ol>

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환경 워터스 바이러스를 농축하는 다른 필터 유형은 26 년 이상 사용되어왔다. 현재의 방법은 ultrafilters (27), 전기 음성 필터 13,28,29, 유리 섬유 필터 (23), 및 전기 양성 필터 (30)를 사용합니다. 전성 필터는 수년 동안 널리 사용되었지만, 염 및 첨가 전 또는 도중 샘플링 필드 물의 pH를 조정 요구 (13)는 그 유용성을 제한한다. 필드 샘플링을위한 가장 실용적인 필터의 선택은 전기 양성 필터입니다. 이러한 필터는 높은 유속에서 물과 임의의 물 조절없이 대량의 샘플링을 허용한다. 유리면 필터는 최소 비용 옵션이지만 전성 필터보다 느린 유속이 시판되지 않는다. Ultrafilters 수질의 넓은 범위에 걸쳐 높은 바이러스 회수율을 제공하지만 장비 sampli 필요한NG 용이 필드 휴대용 아닌 샘플들을 수집하는데 필요한 시간 (27)은 훨씬 더 길다. 방법은 최근 사용이 필드 조정에 대한 필요성을 회피하는 데에 전성 필터를 미리 조정하는 것이 개발되었지만, 이들은 큰 양의 샘플을 수집하기 위해 28, ​​29 적용될 수 없다. EPA 1615 방법은 알루미나 나노 파이버 또는 4 차 아민 중 하나에서 자신의 양전하를 구 전성 카트리지 필터를 사용한다. 후자 위에 전자의 이점은 덜 비싸고 효율적 30,31 천연의 pH 값의 넓은 범위에 걸쳐 바다로부터 바이러스를 수집한다; 그러나, 각각의 카트리지뿐만 아니라, 보 차트 및 동료에 의해 ​​사용되는 유리 섬유 필터는 물 23,31,32 (Cashdollar, 미발표)에서 노로 바이러스 및 엔테로 바이러스 유사 회수율을 준다. 카트리지 필터는 샘플의 수집을 단순화하기 위해 설계된 단순한 샘플링 장치에 배치된다샘플링하는 동안 오염을 줄일 수 있습니다. 많은 연구가 여러 분석 실험실을 사용하여 수행 할 때 표준 방법은 매우 중요하다. EPA 방법은 1615 표준 절차 및이 기간 동안 수집 된 데이터에 영향을 줄 수있는 두 가지 시료 채취 문제를 최소화하기위한 지침을 제공하는 연구를 거짓 오염 시료를 수집하는 동안 또는 부적절하게 소독 장치 구성 요소 및 구성 요소에 의해 필터 구멍의 막힘에 따른 긍정적 인 결과 물은 샘플링된다. 장용성 바이러스 부적절한 위생 일대일 확산 될 수있는 것처럼, 바이러스 오염 장갑 33 저조한 손이나 손 세척에서 샘플로 도입 될 수있다. 그것은 샘플러 오염의 잠재적 경로를 이해하고 샘플링하는 동안 무균 기술을 사용하는 것이 필수적이다. 샘플러 장갑은 주로 페이지에 노출되지 샘플러를 보호하기 위해 사용하지 않는 것을 이해한다오염 장치를 rotect. 샘플링 및 관리의 시작은 오염을 장갑에 손을 방지하기 위해 장갑을 걸치고 동안 촬영해야하기 전에 손 세척해야합니다. 그들은 높은 수준에서 엔테로 바이러스 또는 noroviruses을 발산 할 수 있으므로 장염이나 호흡기 증상이있는 샘플러는 샘플을 수집하지 않아야합니다. 둘째,주의가 이전의 샘플링 이벤트에서 바이러스의 이월을 방지하기 위해주의해야한다. 이러한 오염의 가능성을 최소화하기 위해 소스 방법 1615에서 샘플링 장치는 입구 및 카트리지 하우징 모듈의 압력 조정기 및 압력 측정기를 포함하지 않음으로써 ICR와는 개질 하였다. 샘플링 이벤트 동안 관찰 압력이 최대 주택 평가 아래에 항상 있었기 때문에 이러한 구성 요소가 제거 된 (예를 들어, 125 5 인치 카트리지 하우징에 대한 PSI)과 그들이 소독이 어려운 때문이다. 후자의 문제는 보안 목표 명세서의 장비 빈 컨트롤의 사용을 통해 입증되었다ICR 6,20 이후 udies. 정도는이 ICR 데이터를 알 수없는 영향을하지만, 가능성이 작은 하였다; 두 위양성 성능에 부정적인 평가 용 샘플은 연구 중에 있었다 (데이타 미기재). 상기 잔효 오염의 가능성을 줄이기 위해, 또한 입구 모듈 튜빙 각 샘플링 이벤트 후에 교환 할 것을 권장한다. 이 장치는 바이러스 글로리 품질이나 성능 제어에 사용 된 경우 충분한 소독을 보장하는 것이 특히 중요하다. 살균을 수행하기 전에, 잔류 염소 농도는 보관 중에 손실을 측정한다. 상술 한 장치의 구성을 변경하는 것뿐만 아니라, 그것을 정규 장비 블랭크 그 소독 효과가 입증 실행하는 것이 필수적이다. 방법 1615 장비 공백 바이러스 시드 컨트롤에 사용 후 소독 된 장치를 사용하여 수행 할 의무하여 단순화필요가 없으므로 절차 전에 소독 장치를 통해 바이러스 시드 용액을 통과. 이 농도가 가능한 장비에있는 어떠한 바이러스를 불활 화하는 핵산을 분해하는 동시에 필요로 살균제의 농도는 방법 1615 위해 0.525 % 차아 염소산으로 증가시켰다. 따라서, 장비 공백 세포 배양 및 qPCR에 분석을 모두 사용하여 분석해야합니다. 전기 양성 필터의 두 가지 유형은 표 1에보고 된 연구 중 막힘의 대상이었다. 감소 볼륨이있는 샘플의 알 수없는 수는 적산의 오독 또는 다른 사항을 충족하기 위해 샘플링의 의도적 인 초 정지로 인해 샘플링 오류되었을 수도 있습니다 특히 20 NTU 미만의 탁도 수치와 물에 대한 마감. 폐색의 정도는 필터 종별 수질 파라미터들 모두에 의존한다. 프리 필터는 어느 정도 개선을 제공하지만, 사용 된 경우, 처리 및 분석해야별도로 전기 양성 필터에서. UCMR3 대한 현재 샘플 포인트는 적어도 절반 부피가 제 1 필터를 사용하여 수집 될 수 있다면 두 알루미늄 산화물 계 나노 섬유 필터를 사용하여 사전 필터없이 수집 할 수 있느냐하는 것이다.

인간의 장내 바이러스 위장관 내에서 복제하고 분변 - 구강 경로를 통해 확산됩니다. 이 바이러스는 종종 높은 농도 1-3 하수에서 발견된다. 그들은 하수 폐수 4,5 고집하고, 표면 6, 7, 지상 8 ~ 10, 그리고 11 물을 마시는 처리 할 수 있습니다. 존재하는 경우, US 환경에서 물에서 바이러스의 농도는 통상적으로 직접 측정 (12, 13)에 대해 너무 낮다. 이 바이러스는 다량의 물에서 집중해야합니다. 정보 수집 규칙 (ICR)가 미국 환경 보호청 (USEPA) (14)에 의해 실시 모니터링을하는 동안 감염 단위의 19.7 가능성이 가장 높은 번호로 전국 0.009에서 원거리 큰 유틸리티의 소스 물에 긍정적 인 샘플의 바이러스 농도 (MPN) / L. 긍정적 인 샘플의 중간 값과 평균 농도는 0.03 흐르는 스트림에서 수원 0.17 MPN / L, 0.01이었다호수와 저수지에서 사람들을 위해 0.07 MPN / L, 및 지하수 11 (2000년 4월 25일 일자 ICR 여유 포트 18개월 액세스 데이터베이스에서 데이터)를 사용하여 사람들을 위해 0.04-0.74 MPN / L이다. 국가 지하수의 USEPA 연구에서 긍정적 인 샘플의 바이러스 농도는 0.009 2.12에 감염 단위 / 평균 0.13과 0.29 감염 단위 / L (8)의 평균 농도가 L에서였다. 포지티브 지하수 시료에서 바이러스 농도가 흐르는 스트림에 비해 높았다. 이 연구에서 지하수를 사용하는 시설의 대부분은 카르스트 지역에있는 대수층에서 물을 얻을. 이들은 석회암과 결정에있는 사람들과 함께 (파쇄 암반) 설정은 다른 설정 8,15,16보다 더 높은 바이러스 농도를 가질 가능성이 있습니다. USEPA 바이러스 방법은 표면 물 200 L 300 L에 (ICR) (1,615 방법) 및 지하수 (17, 18)의 1000 L 1,500 L에 (ICR) (1,615 방법)의 샘플링 볼륨을 지정합니다. 그러나,의 사용과큰 샘플 볼륨은 대부분의 표면과 지하수 샘플은 바이러스 8,11,19,20 부정적이다. 지표수에 존재하는 바이러스는 식수의 소비자들에게 잠재적 인 건강 위험. 표면 수처리 규칙 적어도 4- 로그의 바이러스에 의해 농도를 감소시키는 표면 수를 사용하여 모든 처리 설비를 필요로한다. 비록 4 로그 감소, 0.0044 MPN / L만큼 작을 원수에서 감염성 바이러스의 농도는 평균 노광 및 처리 조건으로 로타 바이러스 11, 21에 대한 투여 량 반응 파라미터를 가정하면 하루 이상의 감염으로 이어질 수있다. 처리되지 않은 지하수에서 바이러스로부터 위험으로 인해 치료 및 바이러스 발생의 부족으로 더 큰 수 있습니다. 보 차트와 동료들은 성인에서 급성 위장염의 22 %와 63 %까지의 어린이 5 년 미만은 치료 지하수 (19)를 사용하여 지역 사회에서 물을 마시는 바이러스로 인해이 될 수 있다고 추정하고있다. USEPA Method 1615 보 차트의 결과와 동료 19, 23까지 따라 국가와 비 규제 오염 물질 모니터링 규정의 세 번째 모니터링주기 (UCMR3) 22시 장 바이러스와 노로 바이러스를 검출하기 위해 개발되었다. USEPA 방법은, 주로 미처리 지하수를 사용하는 시스템에서 바이러스를 측정하기 위해 설계 되었으나, 다른 물 매트릭스 유형을 포함하도록보다 일반적으로 기록 하였다. 새로운 방법은 ICR 17 동안 사용 이전 바이러스 방법과 많은 구성 요소를 유지 하이브리드 분자 절차 첨가 노로 24 보 차트 등. 19, 23, 및 추가의 프라이머 세트에 기초 방법. 본 연구의 목적은 샘플링 절차와 수집 및 운송 중에 시료의 무결성을 유지하는 데 필요한 단계를 설명하는 것이다. 전체 방법의 평가 Cashdollar 등. (25)에 대해 설명한다. 이 프로토콜은 간단한 필드 collectio을 커버펌프와 프리 필터가 필요하지 않습니다 및 조정이 pH와 물에 살균제의 존재에 필요하지 않은 경우 표면과 지하수의 n은 샘플링합니다. 더 복잡한 샘플링 요구는 Fout 등. (17, 18)에 기재되어있다.

<table><tbody><tr><td>1-L 폴리 프로필렌 병</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일 사각형</td><td>Cole-Parmer</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>오토 클레이브</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>버블 랩</td><td>US Plastics</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>클로스 가능한 백</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>클로스 블 백</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>상업용 아이스팩</td><td>Cole-Parmer</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>Cool safe box</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>눈금 실린더</td><td>Cole-Parmer</td><td>06135-90</td><td>4-L 이상</td></tr><tr><td>Hype Wipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>iButtons 온도 데이터 로거</td><td>Maxim</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>절연 보관 및 운송 상자</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>포장 테이프</td><td>U.S. Plastics</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 염소 색도계 II 테스트 키트</td><td>Hach</td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 pH 및 온도 프로브</td><td>Omega</td><td>PHH-830</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 탁도 측정기</td><td>Omega</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 스레드 테이프</td><td>Cole-Parmer</td><td>08270-34</td><td>모든 스레드 연결에 사용</td></tr><tr><td>펌프, 원심 마그네틱 드라이브</td><td>Cole-Parmer</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>감소 니플</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨(NaClO)</td><td></td><td></td><td>현지에서 사용 가능한 가정용 표백제 사용</td></tr><tr><td>티오황산나트륨(Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>방수 마커</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr><td>배지</td><td>조성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.525% 차아염소산나트륨(NaClO)</td><td>가정용 표백제를 dH2O.&nbsp에 1:10으로 희석하여 0.525% NaClO 용액을 준비합니다. 0.525% NaClO 용액을 실온에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan = "4 "> [헤더]</td></tr> <tr><td>1 M 티오 황산나트륨 (Na2S2O3) 펜타하이드레이트</td><td>248.2 g의 Na2S2O3를 dH2오.&nbsp; 티오황산나트륨은 실온에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

엔테로 바이러스 및 문화 rt-qpcr에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 epa 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 i. 컬렉션

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615는 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 측정하기 위한 표준 방법을 제공하기 위해 개발되었습니다. 이 방법의 표준화된 샘플링 구성 요소는 전기 양성 카트리지 필터를 통해 지정된 최소 부피의 물을 통과시켜 물에 존재할 수 있는 바이러스를 농축합니다. 지표수와 완성수/지하수에 대해 지정된 최소 부피는 각각 300L 및 1,500L입니다. 분석법의 주요 제한 사항은 시료 부피 요구 사항을 충족하기 전에 필터가 막히는 경향입니다. 서로 다르지만 동등한 두 가지 카트리지 필터 옵션을 사용한 연구에 따르면 필터 유형 중 하나를 사용하는 샘플의 10%에서 필터 막힘이 문제인 반면 다른 필터 유형의 경우 6%가 문제인 것으로 나타났습니다. 막힘은 탁도에 따라 증가하는 경향이 있지만 탁도 측정만으로는 예측할 수 없습니다. 비용 측면에서는 필터 옵션 중 하나가 다른 옵션보다 선호되지만 필터를 선택할 때 수질과 샘플링할 정수 시스템에 대한 경험을 고려해야 합니다.

필터 막힘 막힘은 필터를 통해 물의 흐름 속도를 감소 방법 (1615)으로 발생 될 수있는 잠재적 인 큰 문제이다. 일부 경우에 이러한 큰 흐름을 허용하도록 글로브 밸브를 개방함으로써 극복 될 수있다. 필요한 부피가 통과하기 전에 다른 경우, 상기 필터가 완전히 막힌해질 것이다. 표 1은 필터 타입, 물 타입, 탁도의 함수로서 감소 된 볼륨이있는 샘플의 비율을 나타낸다. 막힘은 반대의 표면 물 시료의 경우 동안 산화 알루미늄 나노 섬유 기반의 필터는 지하수 샘플 급 아민 계 필터를 능가로, 지하수 및 지표수 모두 샘플 발생했습니다. 알루미늄 산화물 계 나노 섬유 필터로 수집 한 샘플의 10 %에 의한 막힘 필요한 최소한 지정된 볼륨 불합격하면서 전체적으로 급 아민 - 기반 필터를 이용하여 수집 한 샘플의 6 % 부피 불충분했다. 장군에서난, 탁도 증가 막힘,하지만 다른 구성 요소의 수는 탁도에 기여 이들 중 일부는 막힘으로 이어질하지 않습니다. 예를 들어, ICR 연구 중에 발생하는 모든 사건의 막힘은 43 % (데이터는 미도시) 두 강 시스템에 국한되었다. ICR 동안 표면의 물에 대한 최소한의 대상 볼륨은 연구 기간 동안 수집 된 평균 볼륨이 208 L의 평균 부피가 217 ± 32 L이었다 200 L.이었다 (ICR 여유 포트 18개월 액세스 데이터베이스에서 데이터가 2000년 4월 25일 일자) . 따라서, 전체 부피는 심지어 고 탁도으로 많은 물로부터 회수 할 수있다. 탁도 75 NTU 이상있을 때 ICR은 프리 필터를 사용하는 샘플러를 요구하지만, 심지어 프리 필터와, 75 탁도와 바다에서 수집 된 샘플의 34 %는 NTU 막혔습니다. 방법 1615 50 NTU 이상의 물과 함께 프리 필터의 사용을 권장합니다 그러나, 방법 1615의 발행 이후, 상기 방법에서 설명한 것 이외에도 여러 가지 옵션이 프리 필터왔다테스트. 샘플 량에 상당한 개선이 초래 중에 (데이터는 도시하지 않음). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> 그림 1. 표준 필터 장치. 표준 필터 장치는 흡입, 필터 하우징, 방전 모듈 (각 모듈에 대한 설명은 보충 자료 참조)로 구성되어있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 총 샘플 </td><td> 불충분 한 샘플 B의 수 </td><td> 비율 결핍 샘플 </td><td> 탁도 (NTU) </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> NanoCeram를 사용하여 지하수 필터 C </td></tr><tr><td> (113) </td><td> (1) </td><td> (1) </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> 표면 물 NanoCeram 필터 C를 사용하여 </td></tr><tr><td> (83) </td><td> (12) </td><td> (14) </td><td> &lt;20 D </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> (50) </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> (6) </td><td> (5) </td><td> (83) </td><td> ≥ 50 D </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center"> 총 NanoCeram의 C </td></tr><tr><td> (210) </td><td> (22) </td><td> (10) </td><td> ≥ 0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> 1MDS 필터 C를 이용하여 지하수 </td></tr><tr><td> (374) </td><td> (75) </td><td> (20) </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>1MDS 필터 C를 이용하여 중심 "&gt; 표면 물 : EXT-정렬 </tr><tr><td> 2,693 </td><td> (27) </td><td> (1) 전자 </td><td> &lt;20 전자 </td></tr><tr><td> (505) </td><td> (36) </td><td> 7 F </td><td> 20 - &lt;50 F </td></tr><tr><td> (122) </td><td> (19) </td><td> (16) 전자 </td><td> (50) - &lt;75g </td></tr><tr><td> (175) </td><td> (60) </td><td> 34 E, F </td><td> ≥ 75 E, F, G, </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center"> 총 1MDS의 C </td></tr><tr><td> 3,869 </td><td> (217) </td><td> (6) </td><td> ≥ 0 </td></tr></tbody></table> 표 1. 필터 생산 능력 샘플은 다음 볼륨 및 탁도 데이터를 사용할 수있는 연구에서 다음과 같습니다. 4/2 일자 ICR 여유 포트 18개월 액세스 데이터베이스에서 1) USEPA의 ICR 연구 (데이터2천분의 5), 2) USEPA 지하수 연구 8, 3) USEPA 로렌스 로웰, MA 연구 (게시되지 않은 데이터), 4) USEPA 미시시피 강 연구 (게시되지 않은 데이터), 5) USEPA 마시는 물 처리장 연구 (게시되지 않은 데이터) 6) USEPA 방법 1615 평가 연구 25, 7) 각각의 연구를 위해 지정된 물의 최소량 전에 막힌 필터 수집 하였다 UCMR3 모니터링의 첫 3 개월 (미발표). 샘플 B. 이 지표수 200 L 및 지하수 1,500 L했지만, USEPA 지하수 연구를위한 USEPA ICR에서 지하수 및 1893 L이었다 소스 물 200 L이었다. 볼륨 지정된 전체 최소를 수집 할 수있는 기능 C는 크게 다르다 샘플은 모두 전체 (P &lt;0.001) NanoCeram 및 지표수 및 지하수 사이 1MDS 필터 (P = 0.002)를 사용하고 각 필터 유형 (P &lt;0.001) 맨 - 휘트니 순위 ​​합계 테스트를 사용하여. D &amp; # 수집 된8211; 같은 첨자 값 g 그룹 (P &lt;0.05) 순위 테스트에 분산의 크루스 칼 - 월리스 편도 분석 및 던의 인접 쌍 다중 비교 절차에 따라 크게 다르다. 모든 통계 학적 시험에서 종속 변수가 있지만 1.0의 최대 값으로, 지정된 최소의 부피 분율로서 필터에 통과 부피이다.

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

이 절차의 전반적인 목표는 EPA 방법 1615에 따라 장 바이러스 발생을 위해 환경 및 음용수를 샘플링하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 샘플링 장치를 조립하고, 장치의 흡입구 및 카트리지 하우징 모듈을 멸균한 다음, 멸균 전기 양성 카트리지 필터를 무균 방식으로 추가하여 수행됩니다. 다음으로, 정의된 부피의 물이 샘플링 장치에 포함된 전기 양성 필터를 통과합니다.그런 다음 장치 및 카트리지 필터 하우징에서 여분의 물을 배출하고 샘플링된 부피를 샘플 데이터 시트에 기록합니다. 마지막으로, 샘플링 장치 구성 요소는 섭씨 1도에서 10도로 유지되는 더 시원한 선적 컨테이너에 포장되어 분석 실험실로 전달됩니다. 궁극적으로, 환경 및 음용수 내의 엔테로바이러스와 노로바이러스는 전체 방법의 일부로 이 샘플링 절차를 사용하여 측정됩니다.이 절차는 전기 양성 필터를 사용하여 바이러스, 일부 환경 식수를 농축합니다. 이 절차를 수행하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 다른 필터 유형이 있습니다. 하나는 울트라 필터이고 다른 하나는 음전하를 띤 필터입니다.울트라 필터에 비해 일렉트로 포시 필터의 장점은 샘플링이 약 2.5배 빠르다는 것입니다. 음전하를 띤 필터를 사용하여 바이러스를 포집하려면 염을 첨가할 때 pH를 조정해야 합니다. 필터를 양전하로 전하하는 장점은 시료 채취 전에 조정이 필요하지 않다는 것입니다.일반적으로 이 절차를 처음 접하는 개인은 멸균 상태를 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있으며 샘플 채취를 위한 편리한 탭이 없는 것과 같은 예기치 않은 조건으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 오늘 절차를 시연하는 것은 저, sha out, Jennifer Cash dollar 및 Eunice VER 거위가 될 것입니다. 우리는 모두 오하이오주 신시내티에 있는 EPA 국립 노출 연구소의 전문 직원입니다.샘플 채취를 준비하려면 텍스트 프로토콜의 보충 자료에 설명된 대로 흡입 모듈, 카트리지 하우징 모듈 및 배출 모듈로 구성된 표준 필터 장치를 여기에 표시된 대로 조립합니다. 샘플링을 위해 유량을 사용합니다. 처음 사용하기 전에 배출 모듈을 흡기 모듈에 연결한 다음 흡기 모듈을 탭에 연결하여 유량계 적산계를 보정하십시오.수도꼭지를 완전히 켠 다음 청동 글로브 밸브를 사용하여 유량을 분당 10리터로 조정하십시오. 유속이 분당 10리터로 안정되면 유량계 적산계를 재설정하여 총 부피를 읽습니다. 그런 다음 방전 모듈의 배출구를 4리터 이상의 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 동시에 적산계를 0으로 재설정합니다.4리터 표시에서 토탈라이저 판독값과 실린더의 4리터 표시에 도달하는 데 필요한 타이머를 측정합니다. 적산계 판독값이 3.96 미만 또는 4.04리터 이상인 경우 관찰된 차이를 조정하는 데 필요한 수정 계수를 계산합니다. 예를 들어, 유량계 적산계가 눈금이 매겨진 실린더의 4리터 표시에서 3.9리터를 읽는 경우 보정 계수는 1.026 또는 4를 3.9로 나눈 값이 됩니다.표준 필터 장치를 멸균하고 샘플 채취를 준비하려면 0.525% 차아염소산나트륨을 사용하여 흡기 및 카트리지 하우징 모듈을 완전히 담그고 최소 30분 동안 담가둡니다.또는 펌프를 사용하여 모듈을 통해 용액을 순환시킵니다. 멸균 DH 2 O를 사용하여 모듈을 헹군 다음 멸균 시약 등급 물 1리터당 50ml의 티오 황산나트륨 멸균 용액을 사용하여 5분 동안 염소를 제거합니다. 그런 다음 멸균 알루미늄 호일을 사용하여 필터 샘플링 장치를 덮습니다.모듈이 무균 상태로 끝납니다. 카트리지 하우징 모듈에 전기 포지티브 카트리지 필터를 추가하고 제대로 장착되었는지 확인합니다. 하우징에서 샘플 데이터 시트에 고유한 샘플 번호를 기록한 다음 필터 샘플링 장치, 샘플 데이터 시트 및 샘플 수집에 필요한 지침을 현장 샘플을 수집할 개인에게 가져가거나 배송합니다.채취 장소에 도착하여 손을 씻은 후 샘플 오염을 최소화하기 위해 새벽 수술용 장갑을 착용합니다.장갑은 자주, 특히 수도꼭지 및 기타 오염될 수 있는 물건을 만진 후에는 자주 교체하십시오. 차아염소산나트륨이 들어있는 패드를 사용하여 샘플링 장치의 탭과 정원 호스의 내부 나사산을 살균합니다. 사이트 및 샘플 식별, 샘플러 이름, 장비 모델 및 일련 번호를 포함한 관련 샘플 추적 정보를 샘플 데이터 시트에 기록합니다.정원용 호스를 수도꼭지에 연결합니다. 호스의 배출구를 물이 안전하게 배수될 수 있는 곳에 놓고 물을 켭니다. 2-3분 동안 탭하여 라인에 쌓인 파편을 제거합니다.배출 모듈을 흡기 모듈에 연결한 다음 둘 다 수도꼭지에 연결합니다. 정원용 호스를 배출 모듈 끝에 연결하고 자유 끝을 1리터 프로필렌 용기에 넣습니다. 그런 다음 수도꼭지를 켜고 장치를 통해 샘플링 할 물을 75 리터 이상 통과시킵니다.세척 기간 동안 프로필렌 용기로 유입되는 물, 염소 잔류 pH, 온도 및 탁도에 대한 다음 수질 매개변수를 측정하고 기록합니다. 수도꼭지에서 물을 끈 후 흡기 모듈에서 배출 모듈을 분리한 다음 카트리지 하우징 모듈을 흡기 모듈의 배출구에 연결하고 배출 모듈을 카트리지 하우징 모듈의 배출구에 연결합니다. 그런 다음 적산계 판독값을 0으로 재설정합니다.현장 샘플 수집을 시작합니다. 날짜 및 시간과 함께 초기 적산계 판독값을 기록한 다음 수도꼭지를 천천히 엽니다. 카트리지 하우징이 똑바로 세워져 있고 물이 완전히 채워졌는지 확인합니다.이제 탭을 완전히 열고 청동 글로브 밸브를 사용하여 초기 유량을 기록하기 전에 분당 10리터로 유량을 조정하십시오. 적산계 판독값을 사용하여 300리터의 지표수 또는 1500-1800리터의 지하수를 장치를 통해 통과시킵니다. 샘플 볼륨이 샘플링 기간의 끝에 가까워짐에 따라 유속을 관찰한 다음 샘플 탭에서 물의 흐름을 끄고 최종 유속, 날짜, 시간, 최종 적산계 판독값 및 총 샘플 볼륨을 기록합니다.필터 분리amp수도꼭지에서 링 장치. 카트리지 하우징 모듈을 다른 모듈에서 분리합니다. 필터 하우징을 거꾸로 뒤집고 입구와 출구 포트 모두에서 더 이상 물이 배출되지 않을 때까지 과도한 물이 흘러나오도록 합니다.하우징을 똑바로 세우고 멸균 호일을 사용하여 양쪽 끝의 빠른 연결을 덮습니다. 하우징을 하나 이상의 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다. 흡입 및 배출 모듈에서 물을 배출합니다.모듈을 하나 이상의 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣어 샘플을 배송할 준비를 합니다. 필터 샘플링 장치 모듈을 절연 보관 및 운송 냉각기에 넣습니다. 냉동 얼음 팩 또는 이중 봉지에 든 얼음 조각을 보관 및 운송 냉각기에 추가하여 샘플이 섭씨 1도에서 10도 사이로 유지되도록 합니다.선적 중. 빈 공간을 포장재로 채운 다음 샘플 데이터 시트를 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고 포장재 위에 놓습니다. 단열 보관소를 닫고 상자 운반을 하거나 샘플을 분석 실험실로 배송합니다.상자를 배송해야 하는 경우 누출을 방지하기 위해 테이프로 밀봉하십시오. 현장 채취 시작 후 24시간 이내에 샘플이 분석 실험실에 도착하도록 합니다. 필터 막힘은 물의 유속을 감소시키기 때문에 Method 1615에서 발생할 수 있는 주요 잠재적 문제입니다.이 표는 부피가 감소된 샘플의 비율을 필터 유형, 물 유형 및 탁도의 함수로 보여줍니다. 지하수 샘플을 여과할 때 나노 일루미나 섬유가 포함된 필터는 4차 아민 기반 필터보다 성능이 뛰어났습니다. 아리 아민 기반 필터는 지표수 샘플을 여과하는 데 더 좋았습니다.전체적으로 4차 평균 기반 필터를 사용하여 수집된 샘플의 6%는 부피가 부족했습니다. 산화알루미늄으로 수집된 샘플의 10%가 나노섬유 기반 필터는 막힘으로 인해 필요한 최소 지정 부피를 충족하지 못했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이것은 전체 방법의 첫 번째 절차일 뿐입니다. 이 절차에 따라 필터 용출, 2차 농도 및 총 배양 바이러스, 분석 및 분자 분석과 같은 분석이 수행됩니다. 이러한 최신 분석은 실제로 바이러스 발생 및 농도를 측정하는 데 필요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 환경 및 음용수에서 바이러스 샘플을 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 바이러스성 병원체와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 말아야 하며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 사용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

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