분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포 또는 마우스 조직에서 호흡 미토콘드리아를 분리한 다음 세포 상태의 척도로서 막 전위의 강도를 평가하는 것입니다. 배양된 세포의 경우, 이는 먼저 도금한 다음 세포를 처리함으로써 이루어집니다. 다음으로, 세포는 균질화되고 균질화는 바늘을 통과하여 세포에서 미토콘드리아를 추가로 방출합니다.

생쥐 조직의 경우, 생쥐에서 간을 절제한 다음 두 가지 유형의 출발 물질과 함께 얼음 위에서 균질화합니다. 그런 다음 차등 원심분리를 사용하여 나머지 세포 내용물로부터 미토콘드리아를 분리합니다. 미토콘드리아에 막 전위에 민감한 형광 염료를 첨가하는 등 일부 처리를 거친 후 TMRE 형광 측정을 수행하여 막 전위의 강도를 계산합니다.

궁극적으로, 미토콘드리아 막 전위의 미토콘드리아 기능 및 섭동은 형광 플레이트 리더와 함께 막 전위에 민감한 형광 염료를 사용하여 평가할 수 있습니다 커플러 및 억제제에 일반적인 미토콘드리아로 치료할 때, 이 방법은 사이토카인 유도 세포사멸 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 LS.It 두 개 이상의 서로 다른 샘플 간의 비교가 필요한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 건강한 동물과 질병 또는 신진대사율이 다른 두 가지 다른 종의 동물. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 미토콘드리아 분리 단계는 배우기 어렵습니다.

이는 기술을 수행할 때 전통적인 방법 섹션에서 간과할 수 있는 많은 뉘앙스가 있기 때문입니다. 사이토카인 처리 플레이트 48시간 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인간 배아 신장 세포를 성장시키는 것으로 이 절차를 시작하고, 160, 000개의 세포를 T 1 75 플라스크에 넣어 치료 시 약 70% 밀도를 산출합니다. 그런 다음 혈청은 24시간 후에 배지를 흡인하고 동일한 부피의 무혈청 배지로 교체하여 세포를 굶주리게 합니다.

마지막으로, 세포 배양 배지에 직접 용해된 사이토카인을 첨가하여 혈청이 부족한 세포를 치료하여 미토콘드리아를 분리합니다. 먼저 배지를 흡인하고 15ml의 1 x 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 부착 세포를 두 번 세척합니다. 세척 후 매번 완충액을 흡인하고 플라스크를 긁어내어 바닥에서 부착 세포를 제거합니다.

그런 다음 각 플라스크에 15ml의 XPBS를 넣고 휘젓고 얼음 위의 개별 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 긁어내기가 완료되면 원심분리, 상층액 흡입 및 소생 후 스윙 버킷 로터가 있는 탁상용 원심분리기를 사용하여 섭씨 700배에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 각 펠릿을 1ml의 미토콘드리아 분리 완충액에 현탁시킵니다.

다음으로, 두 현탁액을 결합하고 미토콘드리아 재현탁액에서 균질화를 위해 작은 유리 용기로 옮기고 용액이 첫 번째 라인에 도달할 때까지 유리 용기에 미토콘드리아 분리 완충액을 전달합니다. 드릴에 유봉을 부착한 상태에서 얼음 위의 세포를 중간 속도로 3회 통과하여 균질화합니다. 유봉을 용액에 넣을 때 기포를 제거하도록 주의해야 하며, 액체 위의 유봉을 제거하지 말고 연속 통과로 일정한 속도를 사용해야 합니다. 균질화된 용액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 18 게이지, 1/2 인치 바늘을 사용하여 용액을 3 밀리리터 주사기에 넣고 27 게이지 1/2 인치 바늘을 사용하여 얼음 위의 원뿔형 튜브로 다시 배출합니다. 세포막 파괴에 그 힘을 활용하기 위해 튜브의 내벽으로 용액을 배출하도록 주의하십시오. 주사기 단계를 총 5회 반복한 다음 용액을 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 스윙 버킷 로터를 사용하여 탁상용 원심분리기에서 섭씨 600배 G에서 4°C로 5분 동안 원심분리합니다.

미토콘드리아는 이 첫 번째 저속 회전 후 상층액에 있으며, 일부 막과 깨지지 않은 세포는 펠릿화되어 상층액을 조심스럽게 제거하고 3개의 1.5밀리리터 튜브에 분포합니다. 다음 10, 000 시간 G 5 분 동안 4 섭씨 온도에 조정 각 회전자에 있는 3개의 관을 분리기. 배양된 세포의 미토콘드리아는 색이 희끄무레하게 나타납니다.

각 동물의 간을 절제하고 칼슘이나 마그네슘이 없는 얼음처럼 차갑게 한 XPBS를 넣어 피를 헹굽니다. 간 조직을 얼음이 담긴 접시에 옮기고 새 면도날을 사용하여 1분 동안 잘게 자릅니다. 다음으로, 완충액이 첫 번째 라인에 도달할 때까지 조직과 적절한 완충액을 혈관에 추가합니다.

얼음 위의 조직을 유봉으로 손으로 5회 동안 균질화합니다. 유봉을 용액에 넣을 때 기포를 제거하도록 주의해야 하며, 액체 위의 유봉을 제거하지 말고 연속 통과로 일정한 속도를 사용해야 합니다. 텍스트 프로토콜에서 solicit에 따라 원심분리 및 균질화로 샘플을 계속 처리합니다.

각 표본에서 첫번째 상등액도 새로운 상등액을 결합한 후에, 10, 000배 G 5 분 동안 4 섭씨 온도에 조정 각 회전자에 있는 관을 분리기. 피펫 팁을 사용하여 상단의 흰색 솜털 층을 조심스럽게 흡인하거나 튜브 측면으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 나머지 상등액을 부드럽게 붓고 소생시킵니다.

간 미토콘드리아 알갱이를 500마이크로리터의 미토콘드리아 분리에 현탁시킵니다. 간에서 추출한 완충 미토콘드리아는 갈색입니다. 반응이 설정되기 직전에 샘플을 얼음 위에 빠르게 놓습니다.

미토콘드리아를 밀리리터당 0.5mg으로 희석합니다. 실험용 완충액을 사용한 작업 농도. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 적절한 치료법을 추가하여 희석된 미토콘드리아의 총 부피인 10분의 1에서 튜브를 분리합니다.

다음으로, 희석된 미토콘드리아를 각 반응 튜브에 넣고 각 튜브를 부드럽게 교반하여 적절한 혼합을 보장합니다. 7분 동안 벤치탑에서 반응을 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 2 마이크로 몰 테트라 에틸, 막대 도민, 에틸 에스테르, 약칭 TMRE를 미토콘드리아 반응 부피에 첨가합니다.

다시 말하지만, 적절한 혼합을 보장하기 위해 각 튜브를 부드럽게 저어줍니다. 추가 7 분 동안 benchtop에 반응을 배양한 후에, 10, 000 시간 G 5 분 동안 4 섭씨 온도에 조정 각 회전자에 있는 분리기 분리에 의하여 미토콘드리아를 펠릿으로 만드십시오. 그런 다음 각 샘플의 상등액 부피의 절반을 3 84에 로드합니다.

웰 플레이트는 샘플의 형광을 판독한 다음 텍스트 프로토콜 처리에 설명된 대로 대조군과 각 처리 사이의 형광 차이를 계산합니다: 24 - 48시간 동안 TNF 알파 IL 1베타 및 IFN 감마를 가진 HEK 2 93 T 세포의 처리는 점진적인 세포 사멸을 초래합니다. 24시간 처리 시 세포 생존율이 약 10% 감소하고 약 20% 감소하는 것을 일관되게 입증하는 MTT 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가했습니다. 48시간 처리로 유사한 농도로 처리된 세포는 48시간 후에 유사한 세포 사멸 결과를 산출합니다.

그리고 개별 사이토카인을 사용한 치료는 생존력의 감소가 조합 효과에 기인한다는 것을 밝혔습니다. 생존력 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 표준 편차를 나타냅니다. 각 실행은 세 번씩 실행되며 오차 막대의 견고함은 데이터의 재현성을 보여줍니다.

사이토카인 처리된 세포에서 분리된 미토콘드리아의 막 전위 감소율은 미토콘드리아 건강이 사이토카인 처리에 의해 영향을 받았음을 의미하며, 이 절차에 따른 생존 가능성 데이터를 확증합니다. TP 발전량, 총 발전량, TP 또는 산소 소비량 평가와 같은 다른 방법을 형성하여 서로 다른 샘플 간의 에너지 및 호흡 차이와 같은 추가 질문을 평가할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 온전한 기능성 미토콘드리아를 분리하고 세포 상태를 반영하여 막 전위의 강도를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.