Name: 분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 학습하세요 인간 양막 상피 세포(hAECs)를 동물성 제품 없이 분리하고 배양하는 cGMP 준수 프로토콜. 이 방법은 재생의학 및 임상 시험에 적합한 순수한 세포 집단을 제공합니다.

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저자는 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원 프로그램(Operational Infrastructure Support Program)의 재정적 지원을 인정합니다.

참고 : 태반이 용어 선택 과목 제왕 섹션의 설정에, 싱글 건강한 임신에서 수집해야합니다. 작성된 동의서들은 태반의 수집을 위해 주어져야한다. 귀하의 관련 인간의 연구 윤리위원회는 승인 모든 수집 및 인체 조직의 사용을해야한다. 양막 상피 세포의 1. 분리 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 표면에 태반을 놓습니다. </li><li> 멸균에게 행크스 평형 염 용액 (HBSS)을 사용하여 태반 표면 및 막으로부터 가능한 한 많은 혈액을 세척한다. </li><li> 탯줄이 위를 향하도록 배치 태반으로, 기계적으로 양막과 융모막 세포막의 바깥 쪽 가장자리를 구분합니다. </li><li> 분리되면, 수동으로 탯줄, 멤브레인의 에지 주변에서 작업, 태반의 융모막 막에서 양막 멤브레인 스트립. 참고 : caref 될UL은 양막에서 융모막 막 오염의 조각을 제거합니다. </li><li> 멸균 가위를 사용하여, 250 ml의 HBSS를 포함하는 용기를 밀봉 한 500㎖의 탯줄과 장소의 기지에서 약 2cm를 양막 막 잘라. </li><li> 양막 멤브레인을 포함하는 밀봉 된 병을 흔들어 깨끗이 씻으십시오. </li><li> 15cm 페트리 접시에 수집 멸균 집게를 사용하여 컨테이너, 장소에서 양막 막을 제거합니다. </li><li> 피 묻은거나 찢어 조각을 폐기, (집게 수직으로 개최 할 때) 약 5cm 긴 조각으로 양막 멤브레인을 잘라. </li><li> 500 ml의에있는 장소는 용기를 밀봉하고 250 ml의 HBSS로 약 3 ~ 5 번 씻거나 양막 막 더 오염 혈액 반투명 될 때까지. 참고 : 모든 혈액에 존재하는 솔루션을 소화 효소의 효율을 감소시킬 수있다. </li><li> 주의하면서 소화 용액을 50 ml의 효소를 함유하는 용기에 양막 막 조각을 모두 전송HBSS의 이월을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 남아있는 혈액을 제거하기 위해 교반과 함께 15 분 동안 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 솔루션을 소화 효소에 양막 조각을 품어. </li><li> 새로운 멸균 용기에 솔루션과 장소를 소화 효소의 양막 조각을 제거합니다. </li><li> 신선한 효소 100ml를 양막 멤브레인 용액​​을 소화하고 수욕 또는 부드러운 진탕 (제 1 분해) 따뜻한 방에서 60 분 동안 37 ℃에서 추가 배양한다. </li><li> 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다. 주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 신선한 효소의 100 ml의 양막 막 조각에 솔루션을 소화하고 부드러운 흔들림 (초 소화) 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 60 분을 품어 추가. </li><li> 셀 suspensi 전달10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.14에서에. </li><li> 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득 1ml를 피펫으로 반복해서 피펫. 주 : 제 다이제스트로부터 세포가 동일한 처리 단계가 될 때까지이 단계에서 세포를 얼음에 남아있을 수있다. </li><li> 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다. 주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.18에서 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 1 ML의 페이지 반복적으로 피펫단일 세포 현탁액을 수득 ipette. </li><li> 두 다이제스트 또는 대안에서 풀 세포는 세포 수 때까지 분리 된 세포 다이제스트을 유지합니다. 참고 :이 높은 생존 세포에 잠재적으로 낮은 생존 세포의 혼합을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 10 ~ 20 ml의 최종 부피에 HBSS를 추가하고 생존 능력을 측정하기 위해 트리 판 블루를 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> 유동 세포 계측법에 의한 상피 세포 표현형을 확인합니다. 안티는 EpCAM-PE 사용하여 적절한 항체 칵테일을 확인 (1 : 2 희석) 항 CD90-PeCy5 (1 : 250) 및 안티 CD105-APC (1 : 100) HBSS에. </li><li> 25 × 106 세포 / ml의 농도로 하나의 세포 또는 항체 칵테일의 두 다이제스트의 서브 세트를 재현 탁. </li><li> 유동 세포 계측법, 얼룩 이소 컨트롤을 포함하는 항체 칵테일 1 × 10 6 세포의 경우 (예. IgG의 1 이소 제어-PE + 안티 CD90-PeCy5 + 안티 CD105-APC). 설정 사이토 흐름에 대한 흠 ~ 1 × 10 6 세포를 보관하십시오. </li><li> 항체 세포를 품어60 분 동안 4 ° C에서 칵테일. </li><li> 워시 세포는 유동 세포 계측법 1 ㎖ 당 5-10000000 세포에서 HBSS 및 재현 탁에 3 배. </li><li> 유동 세포 계측법 및 참고 결과를 수행합니다. 셀 분리 (는 EpCAM 양성 및 CD90 / CD105 음성 세포의 백분율)의 순도 및 각각 90-95% &lt;1 %가 될 것으로 예상된다. </li><li> 최종 응용 프로그램에 의해 결정되는 적절한 품질 관리 또는 방출 기준에 대한 테스트를 위해 따로 세포의 적절한 수를 설정합니다. 참고 :이 질환 / 바이러스 차단, 또는 다른 안전 또는 생물학적 기준을 포함​​ 할 수 있습니다. </li><li> 나머지 세포의 경우, 냉동 보존 프로토콜에 따라, 또는 대안 (문화 단계 3.6 직접) 문화에 직접 배치합니다. </li></ol> hAECs 2. 냉동 보존 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 데이터 또는 트리 판 블루 배제와 수동 계산 유동 세포 계측법을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다. </li><li> 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기. </li><li> 재현 탁 셀동물 제품 무료 냉​​동 보존 매체에 1 ㎖ 당 1-10000000 세포 사이의. </li><li> O 고리 동결 튜브에 세포의 적절한 볼륨을 피펫 및 냉각이 약 발생하는 위치 제어 속도 냉동 장치에 배치 1 ° C / 분까지 -80 C이 달성 °. </li><li> 장기간 저장을 위해 액체 질소로 전송 튜브. </li></ol> Cyropreserved hAECs 3. 해동 문화 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 액체 질소에서 냉동 보존 튜브를 제거하고 얼음에 배치합니다. 참고 : 전송의 경우 - 다음 단계로 빠르게 진행합니다. </li><li> 얼음이 남아의 작은 조각 (~ 5mm X 5mm) 때까지 37 ℃에서 급속 냉동 보관 유리 병을 녹여. 주 : 세포 용액은 동결 배지에서 DMSO의 독성을 감소시키는 가온하지 않는 것이 중요하다. </li><li> 감기 (~ 4 ° C) 혈청이없는 매체와 냉동 보존 매체 10 배 희석 점적 적당한 크기에 추가D 튜브 또는 용기. </li><li> RT에서 5 분 700 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 mL 당 1 백만 세포의 농도로 근사, 무 혈청 배지에 재현 탁. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다. 예상 생존 후 해동 미리 냉동 보존 생존보다 5 ~ 10 % 적습니다. </li><li> 플레이트 표준 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품에 세포, 또는 선택적으로 사용 유형 I 코트 문화 표면에 콜라겐. </li><li> I 형 콜라겐 코팅는 아래의 프로토콜을 따라 <ol><li> 인간의 태반 (25 ml의 탈 이온수 50 μL 빙초산 15 mg의 콜라겐)에서 산 가용성 I 형 콜라겐을 준비합니다. </li><li> 파라 필름으로 비이커를 커버하고 콜라겐 가닥이 용해 될 때까지 37 ° C에서 적당히 저어. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 여과 콜라겐 용액. </li><li> 탈 이온수로 필터링 된 콜라겐 스톡 1:10 희석. 이 희석 주식은 작업 conce입니다코팅 플라스틱 및 막 표면에 대한 ntration 솔루션입니다. </li><li> 콜라겐 코트 플라스틱, 37 ° C의 실온에서 2 시간 동안 유리와 막 표면, 또는 O / N 2-8 ° C에서. </li><li> 코팅 된 표면에서 초과 액체를 제거하고 O / N을 건조 할 수 있습니다. </li><li> 세포와 매체를 도입하기 전에 무균 조직 배양 등급의 물 또는 HBSS로 씻어. </li></ol></li><li> 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs, 그리고 첨부 72-96 시간 동안 발생할 수있다. </li><li> 첨부 파일에 따라주의 깊게 흡입 및 무 혈청 배지의 적절한 볼륨 2-3 일마다로 대체하여 미디어를 변경합니다. </li><li> 아래의 프로토콜을 이용하여 세포 통로 <ol><li> 기음 세포 배양 미디어 및 무균 HBSS의 1 배 부피로 세척 </li><li> 세포는 세포 배양 물 표면으로부터 분리 될 때까지 관찰되는 효소의 양을 추가 1X 용액을 소화하고 5-15 분 동안 인큐베이션하거나. </li><li> 용액은 세포를 포함하는 소화 효소 CE 보장 모아서LLS 반복 세포 배양면에 용액을 소화 효소를 피펫 팅하여 세포 배양 물 표면으로부터 분리되고 </li><li> 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 HBSS의 적당한 부피에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득하여 1ml 피펫으로 반복해서 피펫. </li><li> 1 백만 세포 / ml의 대략적인 농도 무 혈청 배지를 추가합니다. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다. </li><li> 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs하고 표준 방법으로 배양을 계속. </li></ol></li></ol>

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이 방법의 성공에 중요한 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. hAECs의 분리하기 전에 최대 3 시간 동안 태반이나 양막의 저장 그러나 그것은 조직은 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋습니다, 물류 또는 스케줄링을 위해 바람직 할 수있다. 티슈가 저장 될 경우에는 저장 양막 막의 박리 및 세정 다음 수행하는 것이 권장된다. 양막은 39 ° C에서 멸균 항생제를 함유하는 HBSS에 저장 될 수 있으나 세포 생존이 연장 된 축적 시간에 따라 감소 할 수있다. 우리와 다른 세포 수율과 생존의 변동성을 발견하고, 바람직하게는 제왕 절개에 의해 전달 건강한 용어 출생에서 수집되는 태반을 권장이 변동성을 최소화하기 위해. 우리는 혈구 양막 막의 오염이 효소 활성의 억제 및 세포 수율 감소를 초래할 것으로 발견했다. 따라서프로토콜에서 중요한 단계는 태반의 철저한 세척과 양막을 권장합니다. 이 다운 스트림 효소 억제를 방지하기 위해 / 화이트 분명 나타날 때까지 양막 ...

이러한 태반과 같은 주 산기 소스, 태반 막, 탯줄과 양수에서 파생 된 세포는 재생 의학 1,2 세포의 잠재적 인 소스로 연구자와 임상의의 주목을 받고있다. 이 관심의 이유는이 세포 유형 모두 소성 및 면역 기능 3, 그들의 잠재적 인 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 특성을 어느 정도 가지고 있다는 것입니다. hAECs 회생 세포 물질의 풍부한 전위 소스를 제공, 용어 또는 용어 사전 양막 멤브레인 (4)로부터 유도 될 수 상피 이종 집단이다. 세포 치료 매력적 hAECs을 속성은 자신의 다 능성, 낮은 면역 원성 및 항 염증 기능을 포함한다. hAECs은 (높은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 능성 중배엽 계통으로 분화 할 수 cardiom를 밝혀졌다yocytes, 근육 세포, 골 세포, 지방 세포), 내배엽 계통 (췌장 세포, 간 세포, 폐 세포)와 외배엽 계통 (헤어, 피부, 신경 세포와 성상 세포) 5-10. 안심, 자신의 다 능성의 hAECs 어느 형태의 종양에 표시 또는 생체 내에서 종양 발생을 촉진하지 않습니다에도 불구하고. 또한, hAECs 또한 클래스 II 인간 백혈구 항원 (HLAs) 8의 낮은 수준을 표현, 특권 면역 있습니다. 이 속성은 가능성이 면역 능력 원숭이, 토끼, 기니피그, 쥐, 돼지 11 ~ 13을 사용하여 연구에서 입증 된 바와 같이, 동종 및 이종 이식 후 면역 거부를 회피 할 수있는 능력의 기초가. hAECs는 강력한 면역 조절 및 면역 속성을 표시함으로써자가 면역 질환 치료에 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 중요한 실용적인 장점을 제공한다. hAECs는 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템에서 면역 기능을 발휘하는 것으로 추정된다. 에면역의 분비가 (14) 요인을 통해 제안 된 메커니즘의 전자입니다. 전임상 동물 질병 모델에서 hAECs 현재 애플리케이션은 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 폐 질환의 치료를 포함한다. 연구자들은 그들의 고유 한 속성에 뇌졸중 후 뇌 염증을 치료하는 hAECs를 사용에 관심을 보여 주었다. hAECs, 그들은 생착 할 수있는 혈액 뇌 장벽을 통과 최대 60 일 동안 생존, 뉴런으로 분화, 염증을 감소시키고 신경 질환 (15)의 동물 모델에서 손상된 중추 신경계 조직의 재생을 촉진 할 수 있다는 증거가있다. hAECs 타겟팅 및 다발성 경화증의 발생 및 진행에 기여하는 여러 병리학 적 경로를 취소하는 기능을 제공한다. 예를 들면, 전임상 동물 실험의 결과 hAECs 강하게 면역 것을 제안하고잠재적으로 말초 면역 관용을 유도하고 지속적인 염증 반응을 취소 할 수 있습니다. hAECs는 또한 생체 내에서 신경 세포로 분화 및 신경성의 방대한 16 인자 분비를 통해 내인성 신경 재생을 향상시키는 능력을 갖는 것을 나타내고있다. 설치류 및 인간 양막 상피 세포는 이미 동물 모델에서 간 질환의 치료를위한 그들의 치료 효능을 증명하고있다. 감소 된 간세포 자멸사 수반 간 질환, 간에서의 생착 가능한 hAECs HAEC에 이식 리드의 사염화탄소 유도 손상 모델에서 간 염증 및 섬유증 및 17의 감소. hAECs는 인슐린과 포도당 수송을 포함하여 표현 췌장 요인으로 자극 할 수있다. 몇몇 연구는 당뇨병 마우스 (18)에서 혈당 수준을 복원 hAECs 가능성을 조사 하였다. 마우스에서 수신hAECs는 모두 동물 체중 및 혈당 수준은 감염 후 세포의 정상 수준으로 감소 하였다. 이들 연구는 당뇨병의 치료를위한 hAECs의 사용을위한 강력한 바이다. hAECs는 성인과 신생아 모델 19 두의 예방 및 실험 급성 및 만성 폐 손상의 수리 검증 역할을한다. 이러한 연구는 hAECs은 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), 낭포 성 섬유증 (20) 환자에서 돌연변이 이온 채널 등 다양한 폐 관련 단백질을 발현하는 기능 폐 상피 세포로 체외에서 분화 것을 발견했다. hAECs가 부상당한 성인과 신생아 폐에 전달 될 ​​때 또한, 그들은 호중구, 대 식세포와 림프구 21-23을 포함한 폐 백혈구 모집을 감소, 호스트 면역 세포의 변조를 통해 자신의 수복 효과를 발휘한다. 자신의 풍요 로움을 감안할 때,안전 기록, 여러 질병에 대한 입증 된 임상 적용, hAECs를 사용하여 임상 시험은 불가피하다. 임상 시험에 HAEC 치료의 번역을 촉진 목표로, 우리는 현재 좋은 제조 기준 (cGMP의) 지침에 따라 동물 제품 무료 시약을 사용하여, 임상 시험에 적합한 방식으로 문화 hAECs을 분리 cryopreserve과하는 방법을 개발 . 우리는이 프로토콜에게 우리가 동물 유래 시약 6을 사용 hAECs을 분리 성공적으로 사용하고 이전에 출판 된 프로토콜을 기반으로. 우리는 동물 제품 무료 시약 동물 유래 제품을 대체 할 수있는 원래의 프로토콜을 변경, 이후의 최적화는 세포 수율, 생존 및 순도를 최적화하기 위해 실시 하였다. 우리의 목표는 인간의 임상 시험에 대한 전지 제조에 대한 규제 기준을 준수 할 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다.

<table><tbody><tr><td>수집 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트리핑 트레이</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, 뾰족한 13cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>가위 - 날카롭고 뭉툭한 스트레이트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 라텍스 장갑&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>보호 의류</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>보호 의류 (가운)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>격리 가운</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>멸균 라텍스 장갑&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>범용 안면 마스크</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>보닛</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>신발 커버</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>미디어 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)</td> <td>칼슘이나 마그네슘이 없는</td> <td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>14175095 TrypZean (동물성 제품&ndash; 무료 재조합 트립신)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제&nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype 제어</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5 isotype 제어</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype 제어</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 VI</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 눈금 피펫</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 눈금 피펫</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 눈금 피펫</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 팔콘 튜브</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 팔콘 튜브</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15cm 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 필터</td><td>BD / 팔콘</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; M 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 피펫 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 피펫 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 주사기</td><td>BD/의료용</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 계량 보트</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>크라이오 바이알</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 위험 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

만삭 또는 만기 전 양막에서 유래한 인간 양막 상피 세포(hAEC)는 재생 의학을 위한 세포의 잠재적 공급원으로 연구자와 임상의의 관심을 끌고 있습니다. 이러한 관심의 이유는 이 세포가 매우 다재다능한 분화 능력, 낮은 면역원성 및 항염증 기능을 가지고 있다는 증거 때문입니다. 이러한 특성으로 인해 연구자들은 전임상 동물 연구에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는 hAEC의 잠재력을 조사하여 많은 성공을 거두었습니다.
hAEC는 다양한 질병 및 장애 치료에 널리 적용되고 있습니다. hAEC의 잠재적인 임상 응용 분야에는 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 및 급성 폐 질환의 치료가 포함됩니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 진행하려면 세포 치료제에 대한 더 높은 수준의 품질 관리 및 안전성이 필요합니다. 안전성 및 품질 관리 고려 사항을 위해 세포 분리 프로토콜은 동물성 제품이 없는 시약을 사용하는 것이 좋습니다. 
우리는 연구자들이 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 hAEC를 분리, 동결 보존 및 배양할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법의 장점은 적절한 세포 수율, 생존력 및 성장 잠재력을 유지하면서 잠재적으로 유해한 동물 병원체를 인간에게 전달할 위험 없이 이러한 세포를 분리, 특성화, 동결 보존 및 배양할 수 있다는 것입니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 전환하는 연구자에게 이러한 방법론은 규제 승인을 크게 가속화하고 위험을 줄이며 치료용 세포 집단의 품질을 개선할 것입니다.

이 절차가 제대로 따라하면, 1 억 2 천만 hAECs의 평균 수익률은 80-160000000 세포의 전형적인 범위, 예상해야한다. 이러한 수율에서 83 ± 4 %의 평균 생존 능력을 기대할 수있다. 임상 방법에 증가 된 평균 수익률과 약간 낮은 가능성으로 인해 혈청 단백질의 부족으로 아마 또한 동물성 제품보다 더 높은 트립신의 활동으로 인해, 그리고 수 있습니다. 격리 hAECs은 &lt;1 % CD90, CD105 간충직 마커 양성 세포와 92 %는 EpCAM 양성 세포의 평균 기포 표면 프로파일을 갖는다. 이 마커는 각각 상피 (24, 25)와 중간 엽 26 계통에 대한 자신의 특이성으로 인해 선정되었다. 이 과정은 (그림 1)을 완료하는 데 약 4-5 시간이 걸릴 수 있습니다. 냉동 보존은 튜브 및 최종 세포 수율의 수에 따라 20 ~ 60 분을 필요로한다. 우리는 이전에 냉동 보존 매체의 범위를 테...

우리는 현행 cGMP(Good Manufacturing Practices) 지침에 따라 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 인간 양막 상피 세포(hAEC)를 분리하고 배양하는 프로토콜을 설명합니다.

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 양막에서 상피 세포 집단을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 두 번째 단계에서 코리온 막과 태반에서 양막을 벗겨냄으로써 이루어집니다. 양막은 모든 미량의 혈액을 씻어낸 다음 동물성 제품이 없는 트립신 효소 용액으로 소화합니다.마지막 단계에서는 조직 슬러리를 여과하여 분리된 상피 세포를 수집합니다. 궁극적으로 양막 상피 세포 집단의 순도는 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포를 동물성 제품에 노출시킬 필요가 없다는 것인데, 이는 이러한 세포가 임상 시험에 유용하다는 것을 의미합니다.양막 상피 세포를 분리하려면 먼저 태반을 2등급 생물학적 안전 캐비닛 내의 멸균 표면에 놓습니다. 그런 다음 멸균 HBSS를 사용하여 태반 표면에서 가능한 한 많은 혈액을 씻어냅니다. 다음으로, 탯줄과 태반막이 위를 향하도록 태반을 배치하고 탯줄을 향해 막 가장자리를 따라 작동하는 태반의 코리온 막에서 양막을 수동으로 제거합니다.양막에서 오염된 코리온 멤브레인 조각을 제거하도록 주의한 다음 멸균 가위를 사용하여 탯줄 바닥에서 약 2cm 떨어진 양막을 자르고 250밀리리터의 HBSS가 들어 있는 500ml 용기에 멤브레인을 넣고 용기를 밀봉하고 철저히 흔들어 조직을 씻습니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 멤브레인을 15cm 페트리 접시로 옮깁니다. 이제 멤브레인을 5cm 길이의 수직 조각으로 자르고 멤브레인이 오염된 혈액 없이 반투명해질 때까지 방금 설명한 것처럼 조각을 3-5번 더 씻습니다. 모든 혈액이 제거되면 조직 조각을 50ml의 Enzymatic Digest 용액에 옮겨 HBSS의 캐리오버를 최소화하고 섭씨 37도의 따뜻한 방에서 양막 조직을 부드럽게 저어 배양하여 15분 후에 남아 있는 혈액을 제거한 다음 용기의 내부 가장자리를 따라 각 조각을 드래그하여 오래된 소화 용액을 배출하고 조각을 추가합니다. 100 밀리리터의 신선한 효소 분해 용액.동일한 조건에서 한 시간 동안 분해한 후, 멤브레인을 Enzymatic Digest 용액의 새 용기로 옮깁니다. 방금 보여준 것처럼 조직을 배출하도록 주의하고 두 번째 소화 후 마지막 60분 동안 멤브레인을 부드럽게 교반합니다. 70 마이크로 미터 필터를 통해 세포 현탁액을 변형시킨 다음 1000 Gs 및 실온에서 10 분 동안 세포 슬러리를 스핀 다운하고 펠릿을 4 밀리리터의 대두 기반 효소 억제제에 부드럽게 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 생성 한 다음 HBSS를 세포에 10-20 밀리리터의 최종 부피로 첨가합니다.triam blue exclusion을 통해 생존 가능한 세포의 수를 결정한 다음 분리된 양막 상피 세포를 동결 보존합니다. 먼저 치즈 700개와 실온에서 5분간 구부린다. 그런 다음 펠릿을 동물성 제품 무료 극저온 보존 배지에서 밀리리터당 7번째 세포의 6-1 곱 10 중 10개로 다시 현탁시키고 적절한 부피의 세포를 o 고리형 극저온 보존 바이알에 피펫팅합니다.마지막으로, 바이알을 섭씨 영하 80도가 될 때까지 분당 약 섭씨 1도에서 냉각이 이루어지는 제어 속도 동결 장치에 넣은 다음 장기 보관을 위해 바이알을 액체 질소로 옮깁니다. 많은 동물성 제품 무료 미디어가 적절하게 수행됩니다. 그러나 최적의 DMSO 농도는 약 5-10%입니다.일반적으로 해동 후 예상되는 생존력은 사전 동결 보존 생존율보다 5-10% 낮으며 경험이 없는 사용자에게는 훨씬 더 클 수 있습니다.인간 양막 상피 세포로 세포 배양을 수행하여 무혈청 배양 배지에서 상피 표현형을 유지함에 따라 추가 다운스트림 분석을 위해 세포의 특성화 또는 분화를 가능하게 할 수 있습니다. 면역 조절 및 항염증 특성을 가지고 있는 것 외에도 인간 양막 상피 세포는 체외 및 생체 내에서 매우 다효능적인 것으로 나타났으며, 발달 후 3개의 주요 생식층을 대표하는 세포 계통으로 분화됩니다. 이 기술은 연구자들이 폐 질환 및 이식편 대 숙주 질환과 같은 질환에 대한 임상 시험을 수행할 수 있는 길을 열었습니다.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

제임스 톰슨 외 문화에 hES을 분리하고 성장 1998 년 기술을 개발 때문에, 나중에 사용하기 위해 및 냉동 주식에서 세포를 해동 및 확대 냉동 세포는 일상 hES 세포 배양에서 수행한 중요한 절차가있다. hES 세포는 동결 융해의 스트레스에 민감하고 있으므로 특별한주의가 있어야합니다. 여기 우리는 신속하게, 액체 질소 주식에서 hES 세포를 해동 마우스 배아 피더 세포를 도금하고, 천천히 장기 저장을 위해 그들을 오해해서 적절한 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.

인간 양막의 다른 해부학 적 영역에서 상피 세포의 시험관 내 배양

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

본 연구는 배아 생검을 피하고 NGS를 사용하여 염색체 ploidy 식별을 가능하게 하는 폐배양 배지를 사용하는 인간 배아의 염색체 스크리닝 프로토콜을 보고합니다. 본 논문에서는 배양액 제조, 전장 유전체 증폭(WGA), 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 준비, 데이터 분석 등 자세한 절차를 제시한다.

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

이 연구는 인간 줄기세포 유래 망막 색소 상피 세포의 효율적인 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 최적 단계에서 동결 보존

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

이 프로토콜은 티라민 결합 히알루로난 하이드로겔을 사용하여 마우스 난소에서 전방의 여포를 캡슐화하고 배양하는 새로운 3차원(3-D) 배양 모델을 설명합니다. 또한 유리화(vitrification)에 의한 난소 여포 동결 보존에 대한 두 가지 접근 방식에 대해서도 자세히 설명합니다.

3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

학습하세요 인간 양막 상피 세포(hAECs)를 동물성 제품 없이 분리하고 배양하는 cGMP 준수 프로토콜. 이 방법은 재생의학 및 임상 시험에 적합한 순수한 세포 집단을 제공합니다.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

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