생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱 Aedes aegypti

이 절차의 전반적인 목표는 곤충에서 미각 뉴런의 반응을 관찰하고 미각 조직에서 유전자 발현을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 서로 다른 농도의 여러 맛에 대한 특정 미각 모발의 반응을 기록함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미각 조직을 조심스럽게 해부하는 것입니다.

그런 다음 샘플을 성별과 부속물별로 분리합니다. 다음으로, 각 조직 샘플에서 총 RNA를 분리하고 차세대 염기서열분석 및 QPCR을 위한 CD NA 제제를 만듭니다. 마지막 단계는 유전자 발현 데이터를 분석하고 발현된 화학 요법 감각 유전자가 곤충의 취향에 대한 생리적 반응을 어떻게 중재하는지 등의 가설을 형성하는 것입니다.

궁극적으로, 전기생리학적 기록은 곤충 미각 시스템의 수용 범위를 보여주는 데 사용되며 미각 조직의 RNA 염기서열 분석은 미각 수용의 가장 중요한 유전적 구성 요소를 강조하는 데 사용됩니다. 일반적으로 이러한 방법을 처음 접하는 개인은 곤충 화학요법의 크기가 작기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 감각 부속물.

작은 곤충 장기를 해부하거나 기록하는 것은 환자의 연습이 이러한 기술을 마스터하는 열쇠입니다. 이 절차를 시작하려면 해부 현미경 아래에 유리 모세관이 있는 피펫 풀러에서 얇은 팁 기록 전극을 당깁니다. 전극 끝을 조심스럽게 부러뜨려 개구부가 대상 센텀을 둘러쌀 수 있을 만큼 충분히 넓지만 주변 구조물과 접촉하지 않을 만큼 충분히 작도록 합니다.

다음으로, 영하 20도의 냉동실에서 2-4마리의 성충 곤충을 20초 동안 마취합니다. 그 후, 작은 셀로판 테이프 스트립이 있는 커버 슬립을 사용하여 곤충 중 하나를 고정시킵니다. 현미경 아래로.

형태와 위치로 표적 감지를 식별하고 전극 진입 각도에서 동물에 자유롭게 접근할 수 있도록 동물의 방향을 지정합니다. 그런 다음 텅스텐 와이어를 등쪽 흉부에 삽입합니다. 접지 전극으로 사용하려면, 팁의 유리 전극을 관심 있는 자극 용액으로 채웁니다.

팁을 누른 상태에서 기포를 튕겨냅니다. 은선을 전극에 삽입하여 기록 및 자극 전극 역할을 합니다. 그런 다음 전극을 프리 앰프에 연결하면 뉴런 활동을 포착하기 위한 침전 시간을 줄일 수 있습니다.

프리 앰프는 스파이크 레코딩 소프트웨어가 장착된 컴퓨터에 연결되어 전기 신호를 수집, 저장 및 분석합니다. 이제 제어 솔루션으로 centum을 자극하여 기능을 보장하십시오. 자극 아티팩트 이후 200밀리초부터 시작하는 스파이크를 계산합니다.

용량 반응 결과를 얻습니다. 센텀을 증가하는 실험 화학 물질의 농도에 노출시키고 적절한 회복을 보장하기 위해 자극 사이에 최소 3분 간격을 두십시오. 이 절차에서는 드라이 아이스로 얕은 쿨러를 준비합니다.

조직 채취 튜브의 경우 다양한 유형의 조직 채취를 위해 1.5 millil RNA free snap cap tube에 라벨을 붙입니다. 과도한 결로 현상을 방지하기 위해 튜브를 닫아 두십시오. 다음으로 영하 20도의 냉동고에서 15-30초 동안 30-40마리의 모기를 마취합니다.

그런 다음 마취된 모기를 차가운 단계로 옮기고 성별로 분류합니다. 곤충의 날개를 잡고 맛 부속지가 손상되지 않도록 주의하여 곤충의 등쪽을 아래로 향하게 합니다. 해부 현미경으로 표지 바로 근처에 있는 mosquito pro Bois를 부드럽게 잡아 수컷 또는 암컷에서 쌍을 이루는 Bella 또는 tarsi를 해부합니다.

한 쌍의 집게를 사용하여 내부 스타일러스를 노출시키고 다른 한 쌍의 집게로 레이블을 제거하는 Bella. 그런 다음 조직을 족근 조직용 냉장 수집 튜브에 넣습니다. 경골과 첫 번째 족근 분절의 접합부에서 모기 다리를 부드럽게 잡고 족근을 제거합니다.

그런 다음 조직을 차가운 라벨이 붙은 튜브에 넣습니다. 9, 000배 중력에 섭씨 0도 분리기에 있는 1 분 동안 관의 바닥에 조직을 지키기 위하여 수집 관을 돌린다. 해부 중 수집 튜브에 수분이 축적되면 수집된 조직을 덮고 보호하기 위해 50마이크로리터의 저온 트리올 시약을 추가합니다.

액체 질소가 들어 있는 1.5ml 튜브 랙에 튜브를 얼립니다. 그 후, 조직이 파괴되기 전에 드라이 아이스에서 냉각하여 단단히 맞는 RNA free 유봉을 준비합니다. 그런 다음 조직을 고운 가루로 갈아서 한 번 더 반복합니다.

트리올의 총 부피를 1ml로 가져오고 다시 만듭니다. 와류로 지면 조직을 매달아 놓습니다. 그런 다음 지상 조직에 200마이크로리터의 클로로포름을 넣고 철저히 섞습니다.

실온에서 5분 후 섭씨 4도의 원심분리기에서 11, 000배 중력에서 15분 동안 회전시킵니다. 수성층을 게놈 DNA 필터 컬럼에 직접 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 5분 동안 11, 000배 중력으로 스핀다운합니다.

동일한 부피의 RNAs free 70% 에탄올을 플로우 스루에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 액체를 RNA 수집 컬럼으로 옮기고 RNA 추출을 계속합니다. 그 후, 정밀 분광 광도계에서 전체 RNA의 순도를 정량화 및 평가하고 표준 RNA 염기서열분석 방법을 진행합니다.

보좌관의 E GTI gustatory illa의 활동 전위의 추적 기록은 다양한 화학 물질에 대한 직접 자극의 효과를 보여줍니다. 이 기술은 500밀리초 미만의 합리적인 시간 범위에 걸쳐 주어진 진폭과 지속 시간의 스파이크를 계산하여 자극 화학 물질에 대한 반응을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 세 가지 스파이크는 민감도가 다른 세 가지 감각 뉴런 하위 유형에 해당합니다.

RNA-Seq 데이터 세트에 대한 생물학적 복제는 조직 수집의 비용 또는 난이도에 따라 제한될 수 있습니다. Q-R-T-P-C-R은 더 적은 비용으로 전체 유전자 발현의 작은 부분 집합을 검증할 수 있는 기능을 제공하며 더 적은 소스를 필요로 합니다. 왼쪽 패널에 나란히 표시된 RNA는 RN Aeq에 의해 결정된 상대 발현과 Q-R-T-P-C-R에 의해 결정된 상대 발현을 비교

이 두 가지 방법은 유전자 풍부도 추정을 위해 서로 다른 화학 물질에 의존합니다. 오른쪽 패널에 그래픽으로 표시된 통계적 동등성 함수는 각 사례의 확실성 한계를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RNA 분리를 위해 곤충 조직을 해부하고 살아있는 곤충의 미각 털에서 신경 신호를 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.