효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

다음 실험의 목적은 단백질 잘못 접힘 장애와 관련된 단백질의 독성을 억제하는 변이체를 선택하기 위해 HS P 1 0 4 라이브러리를 스크리닝하는 것입니다. 이는 HSP 1, 0, 4 변이 라이브러리를 효모의 질병 관련 기질과 함께 공동 형질전환하고 두 단백질을 두 번째 단계로 발현하는 coex에 의해 달성됩니다. 선택된 효모는 HSP 1 0 4 플라스미드에 대한 카운터 선택을 위해 5개의 Fluor utic acid 또는 5개의 FOA로 처리됩니다.

다음으로, 콜로니 PCR에 의해 돌연변이 영역을 증폭하거나 HSP 1 0 4 유전자의 돌연변이를 식별하여 히트를 염기서열분석합니다. 궁극적으로, 질병 관련 기질의 독성 억제를 평가하여 추가 특성화를 위해 가장 유망한 HS P 1 0 4 변이체를 식별할 수 있습니다. 결합 기반 선택과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 질병 관련 기질의 독성을 억제하는 변이체를 선택할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 단백질 잘못 접힘을 되돌릴 수 있는 단백질을 식별하여 단백질 접힘 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 HS P 1 0 4 강화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 효모에서 독성이 있는 기질의 독성 억제를 위해 모든 단백질의 스크리닝 라이브러리에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 유효한 히트를 찾기 위해 많은 콜로니를 스크리닝해야 할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다: 프로테아 독성 억제를 스크리닝하려면 라피노스가 보충된 드롭아웃 배지, 혈청학적 피펫 및 멸균 목재로 플레이트에서 HSP 1 0 4 콜로니를 세척하는 것으로 시작하고 어플리케이터는 액체 세척제를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 콜로니를 철저히 소용돌이하여 세포 덩어리를 분리합니다.

다음으로, 세포 현탁액을 약간 흐린 배양액으로 희석하고 섭씨 30도에서 진탕하면서 라피노스 드롭아웃 배지에서 하룻밤 동안 세포를 성장시킵니다. 이때 HSP 1 0 4 와일드 유형 및 벡터 컨트롤도 병렬로 성장시킵니다. 다음 날 아침 플레이트, 단일 콜로니가 있는 그룹당 적어도 하나의 플레이트를 생성하기 위해 개별 갈락토스 플레이트에 다양한 세포 농도

벡터와 HSP 1 0 4 세계 유형 배양을 라이브러리 및 플레이트의 OD 600으로 정규화합니다. 이러한 세포의 부피를 실험 균주 농도와 동일하게 하여 대조군과 관련된 라이브러리의 성장을 비교하여 선택을 평가합니다. 엄격함은 또한 포도당 억제 매체에 라이브러리를 도금한 다음 콜로니가 더 이상 HSP 1 0 4를 유지하지 않는 세포 선택을 위해 5개의 FOA를 사용하는 것으로 보일 때까지 섭씨 30도에서 2-3일 동안 모든 플레이트를 배양한 다음 각 균주의 단일 콜로니를 섭씨 30도에서 하룻밤 배양당 이중 및 단일 드롭아웃 배지 플레이트에 복제하여 제거합니다.

이 플레이트는 플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해 나중에 염기서열분석에 사용됩니다. SD 히스 유로 플레이트를 파라 필름으로 감싸고 5개의 FOA 스크린을 수행하면서 섭씨 4도에서 설치합니다. 그런 다음 SD 히스 플레이트에서 단일 콜로니로 콜로니를 5개의 FOA 플레이트에 줄무늬를 만들어 단일 콜로니가 나타날 때까지 섭씨 30도에서 하루에서 이틀 동안 배양합니다. 다음.

5개의 FOA 플레이트에서 각각 선택하고 줄무늬를 만듭니다. 3 개의 생존 식민지는 1 개의 SD 유로와 1 개의 SD 그의 플레이트에 생존 식민지 당 섭씨 30 도에서 1-2 일 동안 부화 한 후 생성됩니다. HSP 1 0 4 플라스미드를 잃은 콜로니는 SD 히스 플레이트에서 성장하지만 SD 유로 플레이트에서는 성장하지 않습니다.

96 년에 라피노스 드롭 아웃 미디어에서 이러한 균주를 포화 상태로 성장시킵니다. 깊은 우물 2 밀리리터 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 흔들어 놓습니다. 그런 다음 위양성을 제거하려면 스포팅 분석을 수행합니다.

배양이 거의 끝나갈 무렵에는 웰당 200마이크로리터의 라피노스 드롭아웃 배지를 새로운 96웰 플레이트로 분주하여 깔끔한 배양을 위해 1열과 7열을 예약하는 다중 채널 피펫이 있습니다. 다음으로 16개의 포화 배양물 각각을 250마이크로리터의 분취액을 플레이트의 1열과 7열로 나누고 배양물을 플레이트의 각 열에 5배로 연속적으로 희석하여 다채널 피펫과 철저히 혼합합니다. 그런 다음 균일한 스포팅을 위해 컬럼 6 및 12에서 희석된 배양액 50마이크로리터를 제거하여 각 웰의 최종 부피가 200마이크로리터가 되도록 합니다.

그런 다음 96볼트 리플리케이터 도구를 사용하여 SD 히스 및 에스컬 히스 플레이트에 복제된 배양물을 찾습니다. 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양한 후, 에스칼 히스 플레이트에 독성을 나타내는 염기서열분석 균주를 선택합니다. 대조군의 거짓 양성 균주와 유사하며, 통제군을 폐기할 수 있는 것만큼 독성이 없습니다.

또한 sd에서 성장 결함을 보이는 균주를 폐기합니다. 그의 플레이트 또는 그 플레이트는 질병 기질 단독보다 실질적으로 더 큰 독성을 나타냅니다. 콜로니 PCR에 의한 HSP 1, 0, 4 변이체를 서열분석하기 위해, 먼저 SD 히스 유로 플레이트에서 약 10마이크로리터의 효모를 긁어내고, PCR에서 스트리핑된 튜브에서 20밀리 수산화나트륨 3마이크로리터로 세포를 동결 해동하여 세포를 제거합니다.

먼저 스트립을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 냉장고에서 10 분 후에, thermocycler에 있는 99 섭씨 온도에 10 분 동안 관을 배양하고, 그 후에 높은 뇌관 농도를 사용하여 PCR 급료 물로 100 microliters에 균주를 묽게 하십시오. 다음으로, 표본에 표준 PCR 프로그램을 달리고, 적합한 크기의 A PCR 제품의 확대를 확인하기 위하여 그 후에 agel 전기 이동법에 의하여 표본을 분석하십시오.

마지막으로, 돌연변이에 대한 염기서열분석 크로마토그램을 철저히 분석하면서 PCR 산물의 염기서열분석을 진행합니다. 돌연변이는 효모가 종종 여러 플라스미드를 보유하기 때문에 주어진 부위에 두 개의 뉴클레오타이드가 혼합된 것으로 관찰될 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서, 중간 영역에서 무작위 추출된 HSP 1 0 4 변이체의 라이브러리를 구축한 후, 라이브러리는 갈락토오스 유도성 TDP 43 발현을 위한 플라스미드를 함유한 효모로 변형되었습니다.

이어서, 형질전환체를 회수하여 글루코스 및 갈락토스 플레이트에 플레이팅하여 갈락토스 플레이트로부터 선택된 스크린 히트의 엄격성을 평가하였다. 초기 스크리닝에서 선택된 변이체의 하위 집합에 대한 5개의 FOA 치료 스포팅 분석에 따라. 선택된 4개의 콜로니 중 2개는 HSP 1 0 4를 나타내고 TDP 43 독성 억제를 매개함을 나타냅니다.

하나는 위양성이었고 다른 하나는 향상된 독성을 보였습니다. 5번의 FOA 처리 후, 2개의 실제 히트는 중간 도메인 돌연변이를 확인하기 위해 콜로니 PCR에 의해 염기서열 분석되었습니다. 이러한 HS P 1 0 4 돌연변이는 독성 억제를 확인하기 위해 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 부모 HSP 1 0 4 플라스미드에서 만들 수 있습니다.일단 마스터되면, 이 기술은 5개의 FO에서 한 번에 최대 200개의 히트를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며, 적절하게 수행되면 1-2주 동안 한 단계에 걸쳐 단계를 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 이 절차에 따라 플라스미드 혼합물을 얻는 경우가 많으므로 염기서열분석 결과를 주의 깊게 분석하는 것이 중요합니다. 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 HSP 1 0 4 변이가 질병 관련 기질의 응집에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 독성 억제제를 선택하기 위해 HSP 1 0 4 변이체 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.