Name: 효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 Hsp104 변종 라이브러리 스크리닝을 통해 효모 단백질병증 모델에서 단백질 독성을 억제하는 방법을. 이 기법은 단백질 오접힘 장애 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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시약을 친절하게 나눠 주신 Sue Lindquist, Aaron Gitler, Martin Duennwald에게 감사드립니다. 우리의 연구는 다음과 같은 지원을 받았습니다: 미국 심장 협회 박사후 연구원(M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH는 R21NS067354, R21HD074510 및 R01GM099836, Muscular Dystrophy Association Research Award(MDA277268), Johns Hopkins University의 Packard Center for ALS Research, Target ALS 및 Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award(J.S.)를 수여합니다.

1. 도서관 생성 <ol><li> 도메인 별 오류가 발생하기 쉬운 PCR 사용 Hsp104의 라이브러리를 구성하려면 먼저 오류가 발생하기 쉬운 DNA 중합 효소 (20) 관심의 영역을 증폭. </li><li> 겔을 추출하여 PCR 생성물을 정제 하였다. </li><li> 표준 부위 지정 돌연변이 유발 프로토콜을 사용 megaprimer 확장 단계를 수행하여 PCR 완충액 50 ng의 템플릿 플라스미드 250 겨 megaprimer, 200 μM의 dNTPs 및 고성능 DNA 중합 효소를 결합하고, PCR 등급의 물 (20)과 50 ㎕의 총 부피로 희석 . 표준 PCR 프로그램을 실행합니다. NOTE : 증폭되는 유전자의 특정 지역에 따라 달라질 사용될 특정 프라이머. <ol><li> PCR에 이어, 37 ° C에서 2 시간 동안 1 ㎕의 DPN I 제한 효소로 부모 주형 DNA를 소화. </li></ol></li><li> ultracompetent E.에서 전기 또는 다른 수단에 의해 라이브러리 변환 대장균 미니 프렙하여 정제하고. 참고 : 라이브러리 생성실질적으로 주어진 실험의 목적에 따라 달라집니다. Hsp104 매우 큰 단백질이므로 우리가 특정 도메인 에러 유발 PCR을 이용하는 이유는 전체 유전자를 랜덤 비실용적이다. 또한 Hsp104의 구조는 저조한 21 도전 관한 라이브러리 디자인을 이해 남아. 라이브러리 유일한 제한은 템플릿 플라스미드 백본 스트로스 미디어 -5- FOA 카운터의 선택을 허용하는 URA3 유전자를 포함해야한다는 점 이외에는, 돌연변이 유발에 관한 랜덤 접근 방식을 사용하여 구성 될 수있다. </li></ol> Hsp104 도서관 2. 변환 <ol><li> 표준 리튬 아세테이트 / PEG 변환 프로토콜 (22)를 사용하여 W303aΔ의 hsp104 효모에 질병 관련 기판을 통합 할 수 있습니다. 하나의 식민지를 선택하고, 기판 (23)을 관련 질병의 높은 독성을 가진 균주를 분리 독성을 화면. 참고 : 통합 변형 및 솔라를 사용하여모든 셀에 동일한 발현을 보장하기 위해 단일 ​​콜로니 테. pAG416GAL 플라스미드 (우라실 마커) (24)로 우라실 이외 마커 (우리는 히스티딘 사용) Hsp104 라이브러리 하에서 유전자의 통합을 허용하는 플라스미드로 질병 기판을 복제. 5-FOA의 counterselection을 허용하기 위해 라이브러리가 우라실 마커와 플라스미드로부터 발현되어 있는지 확인합니다. 다른 효모 균주도 사용될 수있다. 우리는 W303a 모두 WT와 Δ hsp104 배경에 BY4741 효모 균주 (MEJ과 JS, 관찰되지 않은)을 사용하여 유사한 독성 억제 표현형을 언급했다. </li><li> 동일한 리튬 아세테이트 / PEG 변환 프로토콜 (22)을 사용하여이 균주에 Hsp104 라이브러리 변형. 라이브러리의 시퀀스 공간을 유지하고 예측 된 라이브러리 크기를 유지하기 위해 적절히 변형 배율 확대. </li><li> 충분히 판을 사용하여 noninducing, 선택적 플레이트 상에 변환 혼합물 (예 : SD-그의 우라)를 플레이트콜로니 다수의 성장을 보장한다. 필요한 접시의 수를 최소화하기 위해 큰 배양 접시 (150mm)를 사용합니다. 플레이트를 사용하여 형질 전환 체를 복구하는 것은 변환 효율을 평가 할 수 있습니다. </li><li> 병렬 Hsp104 WT 및 벡터 음성 대조군 변환. </li></ol> Proteotoxicity의 억제를위한 3. 심사 <ol><li> 피노 오스 보충 드롭 아웃 미디어 (예 : SRaff-그의 우라)를 사용하여 판 오프 식민지를 씻으십시오. 접시에서 식민지를 풀어 혈청 학적 피펫 멸균 나무 어플리케이터를 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브와 소용돌이에 액체 세척을 이동하는 것은 철저히 세포의 덩어리를 분리합니다. 약간 흐린 문화, OD 600 ~ 0.025로 희석. 참고 : 여기 라 피노 오스 따라서 갈락토스 매개 유도 세포를 프라이밍, 유도의 포도당 매개 억압의 세포를 완화하는 역할을한다. </li><li> 3에서 진탕 피노 오스 드롭 아웃 미디어에서 하룻밤 희석 문화를 성장0 ºC. 병렬 Hsp104 WT 및 벡터 제어를 성장. </li><li> 다음날 아침, 개인 갈락토스 위에 농도의 범위를 판 (예 SGal-그의 우라) 판 (400 μL 총 볼륨 문화를 집중 2 ml의 1 μL). 농도의 넓은 범위를 도금하는 것은 접시가 하나의 식민지있을 것이라는 점을 보장합니다. 필요한 실제 농도는 관심있는 질병 기판의 독성에 의존한다. </li><li> 라이브러리의 OD 600 벡터 및 Hsp104 WT 문화를 정상화하고 컨트롤 라이브러리 상대적인 성장을 비교하는 같은 부피를 접시. </li><li> 선택의 엄격 성을 평가하기 위해, 미디어 (억압) 포도당에 라이브러리를 접시. 식민지 (그림 2) 나타날 때까지, 30 ºC 2-3 일 동안 번호판을 품어. 그 결과 식민지를 평가하고 컨트롤에 비교합니다. NOTE : 종종 모두 크고 작은 콜로니가 수득되지만, 콜로니 크기와 행동 사이에 상관 관계의 ivity가 관찰된다. 시퀀싱 이월 가양 최소화 -5- FOA 카운터 선택 기술 (단계 4)를 사용하여 이러한 잠재적 히트 화면. </li></ol> 4. 5-FOA Counterselection 스포팅는 오판 가능성을 제거하기 위해 <ol><li> 단일 및 이중 드롭 아웃 매체에 중복 된 단일 콜로니 (예 : SD-그의 우라과 SD-그의 판) 30 ºC에서 하룻밤 성장 밖으로 행진. 벡터 및 Hsp104 WT 컨트롤을 반복합니다. 도금 SD-그의 종래 5-FOA들은 5-FOA에 도금되는 경우 세포 Hsp104 플라스미드를 상실한 가능성을 증가시켜 5-FOA 단계의 효율을 증가시킨다. </li><li> 5 FOA 화면을 수행하는 동안 마르지 판을 방지하기 위해, 4 ºC에서 SD-그의 우라의 파라 필름에 접시와 저장소를 포장. 이 판은 결국 시퀀싱에 사용됩니다. </li><li> 행진에서 식민지 SD-그의 5-FOA 플레이트에 하나의 식민지 판 (YPD 미디어 + 1g / L 5-FOA) 및 (30)에서 1~2 일 동안 배양# 186; C는 하나의 식민지가 나타날 때까지. 여기서, 5-FOA는 URA3 유전자를 포함하는 세포에서의 독성 생성물 (5-fluorodeoxyuridine)로 변환된다. 따라서, 여전히 Hsp104 플라스미드를 보유하는 모든 세포는 죽을 것이다. </li><li> 행진 SD 우라과 SD-그의 접시 위에 중복의 5-FOA 판에서 하나의 식민지. 각 테스트 3 식민지는 각각의 히트에 대해 적어도 하나의 식민지가 Hsp104 플라스미드를 상실 할 가능성을 증가했다. 30 ° C에서 1~2 일 동안 품어. SD-번호판하지만 SD 우라 판에 성장합니다 Hsp104 플라스미드를 잃은 식민지. </li><li> 분석을 안보에 대한 Hsp104 플라스미드를 잃은 균주​​를 성장. 진탕 30 ºC에서 하룻밤 (96) DeepWell 2 ml의 판에 (예를 들어 SRaff-그의) 라 피노 오스 드롭 아웃 미디어에서 포화 균주를 성장. 5 FOA 처리 제어 계통을 포함해야합니다. </li><li> 분석을 안보에 대 한 번호판을 준비합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 나누어지는 200 μL 피노 오스 드롭 아웃 미디어 (예 : SRaff-그의) 당96 웰 플레이트의 잘, 예약 열 깔끔한 문화 1, 7. 나누어지는 250 열 1에 16 포화 문화의 각 μL 및 플레이트 7. </li><li> 직렬 멀티 채널 피펫 철저하게 혼합, 플레이트의 각 열에 문화 5 배 희석. 각 웰의 최종 부피를 위해 컬럼 (6) 및 (12)로부터 희석 배양의 50 μl를 제거하여 200 μL이다. 이것은 심지어 안보 보장하기 위해 필수적이다. </li><li> 96 볼트 복제 도구 (Frogger와)를 사용하여 SD-그의 및 SGal-그의 판에 중복의 문화를 발견. 2~3일 30 ºC에서 번호판을 품어. </li><li> 컨트롤 유사한 SGal-그의 플레이트에 독성을 나타내는 균주를 시퀀싱을 위해 선택한다. 컨트롤로 유독하지 않음으로 오탐 (false positive) 균주를 폐기하십시오. 5-FOA는 그 자체로 종종 독성, 그래서 혼자 질병 기판보다 SD-그의 접시에 성장 결함 또는 전시 실질적으로 더 큰 독성을 나타내는 균주를 (폐기 <stronG&gt; 그림 3). </li></ol> 5. 식민지 PCR에 의해 Hsp104 변종을 시퀀싱 <ol><li> 다 쳤어요 ~ 10 μL의 PCR 스트립 관에서 3 μL 20 mM의 NaOH를에서 SD-그의 우라 판에서 효모와 동결 - 해동하여 세포를 용해. 다음 10 분 동안 열 순환기에서 99 ºC에서 부화, 10 분 동안 또는 액체 질소 -80 ºC 냉동고에서 스트립 튜브를 놓습니다. PCR 등급 물 100 μL에 균주를 희석. </li><li> PCR 반응 준비 : 5 μL PCR 템플릿, 0.5 μL 100 μm의 각 프라이머, 0.5 μl의 10 mM이의 dNTPs, PCR 버퍼 0.25 μL DNA 중합 효소를, 그리고 PCR 등급 물 25 μL 총 볼륨으로 구성한다. 디자인 프라이머는 무작위 지역 플러스 양쪽 끝에서 약 100 bp의 증폭합니다. 성공적인 증폭의 가능성을 증가시키기 위해 증폭 된 영역의 크기를 최소화한다. 표준 PCR 프로그램을 실행합니다. </li><li> 적절한 SIZ의 PCR 생성물의 증폭을 확인하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 시료를 분석전자. 어떤 제품이 존재하지 않는 경우 PCR을 반복한다. NOTE : PCR 장애가 통상적 단계 5.1에서 사용되는 너무 많은 효모 때문이다. </li><li> DNA 시퀀싱 샘플을 준비합니다. 이러한 엑소 뉴 클레아 I와 새우 알칼리 포스 파타 아제 효소로 PCR 정화 또는 PCR 제품 정리 시약을 사용하여 하나 PCR 프라이머를 제거 (ExoSAP-IT)의 단일 가닥 DNA를 분해합니다. 이 시약은 효소 높은 처리량을 허용, 비법 인 프라이머 및 dNTPs를 저하됩니다. </li><li> PCR 제품 시퀀싱. 철저하게 돌연변이 염기 서열 크로마토 그램을 분석해야합니다. 종종 여러 플라스미드 항구 효모로 돌연변이는, 특정 사이트 (그림 4)에서 두 개의 뉴클레오티드의 혼합물로 관찰 할 수있다. </li></ol>

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여기에서 우리는 효모 proteinopathy 모델을 사용하여 질병 관련 기판의 독성을 억제하는 효력을 더 Hsp104 변종을 분리에 대한 우리의 접근 방식을 제시한다. 이 방법을 사용하여, 변형의 큰 라이브러리 만 제한 -5- FOA 보조 스크린을 통과 변이체의 개수 인 상태, 높은 처리량 스크리닝 할 수있다. 96 웰 형식으로 다음 단계를 수행함으로써, 우리는 정기적으로 1-2주의 과정을 통해 5-FOA 단계에서 한 번에 200 안타까지 화면. 초기 스크리닝 단계에서 얻어진 히트 수는 크게 기판 독성 및 각 특정 라이브러리의 구성에 따라 달라질 것이다. 안타 시퀀싱 때 플라스미드의 혼합물은 일반적으로 각 셀에 존재하기 때문에주의 깊게 시퀀싱 크로마토 그램을 분석하는 것이 필수적이다. 우리는 때때로 Hsp104 WT의 큰 비율은 &#39;히트&#39;로 고립되는 지적했다. 이는 자발적 유전자의 존재 가능성억제 또는 매우 약한 활동. 이 문제를 회피하기 위...

효모 proteinopathy 모델은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 파킨슨 병 (PD) 1-3 포함한 단백질 미스 폴딩 장애 개발되어왔다. ALS 환자에서 misfold 단백질 TDP-43 및 FUS,의 발현은, 효모 1, 2에서 세포질 응집체를 형성하는 독성 및 mislocalize 있습니다. 마찬가지로, PD에 연루되어 α - 시누 클레인 (α-SYN)의 표현은, 독성 및 mislocalizes 효모 3 세포질 응집체를 형성 할 수 있습니다. 이러한 기능은 이러한 장애 4,5 환자의 표현형을 요점을 되풀이. 따라서, 효모 모델을 방지하거나 이러한 표현형 2,6-13 역 단백질이나 작은 분자 스크리닝을위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 저자들은 TDP-43, FUS 및 α-SYN에 집계 및 독성을 반전 할 수있는 단백질의 개발에 관심이 있습니다. 우리는 Hsp104, 모두 FR 단백질을 disaggregating의 고유 할 수있는 효모에서 AAA + 단백질에 초점효모에서 톰 비정질 단위 및 아밀로이드는 아직 더 인간의 상동 (14, 15)이 없습니다. Hsp104 미세 내생 효모 프리온을들을 분해하도록 조정하고 일반적으로 16, 17가 발생하지 인간의 신경 퇴행성 질환에 연루 기판을들을 분해하는 제한된 능력을 가지고 있습니다. 따라서, 우리는 efficaciously이 인간의 기판을들을 분해 할 수있는 Hsp104의 향상된 버전을 설계하는 것을 목표로하고 있습니다. Hsp104는 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용하여 변형이를 위해, 우리는 큰 라이브러리를 구성; 이 라이브러리는 효모 proteinopathy 모델 (17)를 사용하여 검사를 할 수 있습니다. Hsp104 (17) 매우 큰 것처럼 우리는 라이브러리를 구성하고 심사에 도메인 타겟 접근 방식을 채택했습니다. 유사한 접근법이 다른 도메인을 선별하기 위해 사용될 수 있지만 우리는 처음, 중간 도메인 Hsp104 17 (MD)에 집중했다. 예컨대, 나머지는 표면 디스플레이, 같은 대체 기술과 반대로 이러한 모델은, 직접적 disaggregase 활성 스크리닝 에이블18 바인딩 모니터링을위한 사용하기 ricted. 우리의 프로토콜은 두 심사 단계 (그림 1)을 기반으로합니다. 첫째, 효모 질병 기판의 독성을 억제 Hsp104 변이체가 선택된다. 이렇게하려면 Hsp104 변종과 질병 관련 기판은 Δ의 hsp104 효모에 cotransformed된다. 우리는 야생 형의 부재 (WT) Hsp104 17 Hsp104 시퀀스 공간을 탐험 Δ의 hsp104 효모를 사용합니다. 중요한 것은, Hsp104의 삭제는 효모의 α-SYN, FUS, 또는 TDP-43 독성에 영향을주지 않으며, Hsp104 (WT)의 표현은 최소한의 구조 1,13,17을 제공합니다. 효모는 양쪽 단백질의 발현을 유도하는 유도 배양액에 도금된다. 식민지의 질병 관련 기판 협의 성장의 독성을 억제 Hsp104 변종을 품고 효모. 식민지 독성 다이를 억제하지 않는 변종을 유지하면서 이러한 변형은, 추가 분석을 위해 선택됩니다. 그러나,오탐 (false positive)이 화면에 상당한 문제가 있습니다. TDP-43, FUS 및 α-SYN의 식으로 표현되는 Hsp104 변형과 관련이없는 독성의 자발적인 유전자 억제의 모양에 대한 강력한 선택적 압력을 생성하는, 매우 독성이 있습니다. 따라서, 우리는 이러한 비특이적 독성 억제 (17)를 제거하기 위해 상대적으로 높은 처리량입니다 보조 화면을 사용했다. 이 보조 화면에서 선택 효모 Hsp104 플라스미드 (19)에 대한 선택에 대응하기 위해 5 Fluorootic 산 (5-FOA)로 처리된다. 균주 후 기판의 독성 Hsp104 플라스미드의 손실 후 복원 될 수 있도록 분석을 통해 안보 (TDP-43, FUS, 또는 α-SYN) 독성 기판에 대한 평가된다. 따라서, 독성이 보조 화면에 복원되는 효모는 아마도 원래 인해 Hsp104 변종의 존재에 대한 독성 억제를 표시. 이러한 효모 &#39;히트&#39;로 표시되고 Hsp104 플라스미드는되어야회수 Hsp104 유전자 17 (도 1)의 변이를 식별하는 서열. 모든 히트 곡은 다음 독성 억제에 대한 재검사 후 독립적으로 돌연변이를 구성하는 부위 특이 적 변이를 사용하여 재확인해야한다. 이 프로토콜에 대한 잠재적 인 응용 프로그램은 광범위하다. 이러한 방법을 이용하여 단백질의 임의의 타입의 라이브러리가 효모의 독성 어떤 기질 단백질의 독성을 억제하는 변형에 대해 스크리닝 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain 돌연변이 유발 키트</td><td>애질런트</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150mm 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2ml 플레이트</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V& P 사이언티픽</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

효력을 더 hsp104 변종 사용 효모 proteinopathy 모델을 분리

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

많은 단백질 잘못 접힘 장애는 발아 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 모델링할 수 있습니다. 근위축성 측삭 경화증과 관련된 TDP-43 및 FUS와 파킨슨병과 관련된 α-synuclein과 같은 단백질은 독성이 있으며 효모에서 세포질 응집체를 형성합니다. 이러한 특징은 이러한 질환을 가진 환자에서 관찰되는 단백질 병리학을 요약합니다. 따라서 효모는 단백질 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 분리하기 위한 이상적인 플랫폼입니다. 우리는 잘못 접힌 독성 단백질 순응자를 제거하기 위해 단백질 디스아그레가스를 적용하는 데 관심이 있습니다. 특히, 당사는 무질서한 응집체와 아밀로이드를 모두 용해시키고 단백질을 원래 형태로 되돌릴 수 있는 고유한 능력을 가진 효모의 헥사메릭 AAA+ 단백질인 Hsp104를 엔지니어링하고 있습니다. Hsp104는 진핵생물과 진균에서 고도로 보존되어 있지만 알려진 후생동물 상동체는 없습니다. Hsp104는 인간 질병과 관련된 무질서한 응집체와 아밀로이드 섬유를 제거하는 능력이 제한적입니다. 따라서 우리는 신경퇴행성 질환과 관련된 단백질 잘못 접힘을 역전시키기 위해 Hsp104 변이체를 엔지니어링하는 것을 목표로 합니다. 당사는 효모의 단백질 독성을 억제하기 위해 Hsp104 변이체의 대규모 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 개발했습니다. 효모는 독성의 자발적인 비특이적 억제가 발생하기 쉽기 때문에 위양성을 제거하기 위해 2단계 스크리닝 프로세스가 개발되었습니다. 이러한 방법을 사용하여 TDP-43, FUS 및 α-synuclein의 독성 및 응집을 강력하게 억제하는 일련의 강화된 Hsp104 변이체를 확인했습니다. 여기에서는 효모에 독성이 있는 단백질의 독성을 억제하기 위해 단백질 골격을 사용하여 구성된 스크리닝 라이브러리에 적용할 수 있는 이 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다.

우리는 중간 영역에서 무작위 Hsp104 변종의 라이브러리를 구축하고 TDP-43 독성 억제를 위해 그것을 상영했다​​. 도서관은 변화와 화면의 엄격 성을 평가하기 위해 포도당과 갈락토스 판 (그림 2)에 도금. 단일 콜로니를 선택하고, 균주 카운터 Hsp104 플라스미드를 제거하기 위해 5-FOA를 사용하여 선정되었다. 이 균주는 그 독성을 확인하기 위해 평가되었다 것은 Hsp104 변종 않고, TDP-43 형 때문. 초기 화면에서 선택한 변형의 부분 집합의 안보 분석이 선택되는 4 식민지, (2) (1) 거짓 양성 반응, Hsp104 매개 TDP-43 독성 억제를 표시하고, (1) 5-FOA 처리 다음과 같은 강화 된 독성을 표시 것으로 나타났다 (그림 3). 이 진정한 히트는 중간 도메인 돌연변이 (도 4)를 식별하기 위해 콜로니 PCR에 의해 서열 분석 하였다. 이러한 돌연변이가 확인 된 후, Hsp104 돌연변이가 건설되었다 새...

효모 단백병증 모델은 질병과 관련된 단백질의 독성 및 응집을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 Hsp104 변이체 라이브러리에서 독성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 효모에서 독성이 있는 단백질의 독성 억제자에 대해 모든 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

다음 실험의 목적은 단백질 잘못 접힘 장애와 관련된 단백질의 독성을 억제하는 변이체를 선택하기 위해 HS P 1 0 4 라이브러리를 스크리닝하는 것입니다. 이는 HSP 1, 0, 4 변이 라이브러리를 효모의 질병 관련 기질과 함께 공동 형질전환하고 두 단백질을 두 번째 단계로 발현하는 coex에 의해 달성됩니다. 선택된 효모는 HSP 1 0 4 플라스미드에 대한 카운터 선택을 위해 5개의 Fluor utic acid 또는 5개의 FOA로 처리됩니다.다음으로, 콜로니 PCR에 의해 돌연변이 영역을 증폭하거나 HSP 1 0 4 유전자의 돌연변이를 식별하여 히트를 염기서열분석합니다. 궁극적으로, 질병 관련 기질의 독성 억제를 평가하여 추가 특성화를 위해 가장 유망한 HS P 1 0 4 변이체를 식별할 수 있습니다. 결합 기반 선택과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 질병 관련 기질의 독성을 억제하는 변이체를 선택할 수 있다는 것입니다.이 방법은 단백질 잘못 접힘을 되돌릴 수 있는 단백질을 식별하여 단백질 접힘 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 HS P 1 0 4 강화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 효모에서 독성이 있는 기질의 독성 억제를 위해 모든 단백질의 스크리닝 라이브러리에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 유효한 히트를 찾기 위해 많은 콜로니를 스크리닝해야 할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다: 프로테아 독성 억제를 스크리닝하려면 라피노스가 보충된 드롭아웃 배지, 혈청학적 피펫 및 멸균 목재로 플레이트에서 HSP 1 0 4 콜로니를 세척하는 것으로 시작하고 어플리케이터는 액체 세척제를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 콜로니를 철저히 소용돌이하여 세포 덩어리를 분리합니다.다음으로, 세포 현탁액을 약간 흐린 배양액으로 희석하고 섭씨 30도에서 진탕하면서 라피노스 드롭아웃 배지에서 하룻밤 동안 세포를 성장시킵니다. 이때 HSP 1 0 4 와일드 유형 및 벡터 컨트롤도 병렬로 성장시킵니다. 다음 날 아침 플레이트, 단일 콜로니가 있는 그룹당 적어도 하나의 플레이트를 생성하기 위해 개별 갈락토스 플레이트에 다양한 세포 농도를 생성합니다.벡터와 HSP 1 0 4 세계 유형 배양을 라이브러리 및 플레이트의 OD 600으로 정규화합니다. 이러한 세포의 부피를 실험 균주 농도와 동일하게 하여 대조군과 관련된 라이브러리의 성장을 비교하여 선택을 평가합니다. 엄격함은 또한 포도당 억제 매체에 라이브러리를 도금한 다음 콜로니가 더 이상 HSP 1 0 4를 유지하지 않는 세포 선택을 위해 5개의 FOA를 사용하는 것으로 보일 때까지 섭씨 30도에서 2-3일 동안 모든 플레이트를 배양한 다음 각 균주의 단일 콜로니를 섭씨 30도에서 하룻밤 배양당 이중 및 단일 드롭아웃 배지 플레이트에 복제하여 제거합니다.이 플레이트는 플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해 나중에 염기서열분석에 사용됩니다. SD 히스 유로 플레이트를 파라 필름으로 감싸고 5개의 FOA 스크린을 수행하면서 섭씨 4도에서 설치합니다. 그런 다음 SD 히스 플레이트에서 단일 콜로니로 콜로니를 5개의 FOA 플레이트에 줄무늬를 만들어 단일 콜로니가 나타날 때까지 섭씨 30도에서 하루에서 이틀 동안 배양합니다. 다음.5개의 FOA 플레이트에서 각각 선택하고 줄무늬를 만듭니다. 3 개의 생존 식민지는 1 개의 SD 유로와 1 개의 SD 그의 플레이트에 생존 식민지 당 섭씨 30 도에서 1-2 일 동안 부화 한 후 생성됩니다. HSP 1 0 4 플라스미드를 잃은 콜로니는 SD 히스 플레이트에서 성장하지만 SD 유로 플레이트에서는 성장하지 않습니다.96 년에 라피노스 드롭 아웃 미디어에서 이러한 균주를 포화 상태로 성장시킵니다. 깊은 우물 2 밀리리터 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 흔들어 놓습니다. 그런 다음 위양성을 제거하려면 스포팅 분석을 수행합니다.배양이 거의 끝나갈 무렵에는 웰당 200마이크로리터의 라피노스 드롭아웃 배지를 새로운 96웰 플레이트로 분주하여 깔끔한 배양을 위해 1열과 7열을 예약하는 다중 채널 피펫이 있습니다. 다음으로 16개의 포화 배양물 각각을 250마이크로리터의 분취액을 플레이트의 1열과 7열로 나누고 배양물을 플레이트의 각 열에 5배로 연속적으로 희석하여 다채널 피펫과 철저히 혼합합니다. 그런 다음 균일한 스포팅을 위해 컬럼 6 및 12에서 희석된 배양액 50마이크로리터를 제거하여 각 웰의 최종 부피가 200마이크로리터가 되도록 합니다.그런 다음 96볼트 리플리케이터 도구를 사용하여 SD 히스 및 에스컬 히스 플레이트에 복제된 배양물을 찾습니다. 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양한 후, 에스칼 히스 플레이트에 독성을 나타내는 염기서열분석 균주를 선택합니다. 대조군의 거짓 양성 균주와 유사하며, 통제군을 폐기할 수 있는 것만큼 독성이 없습니다.또한 sd에서 성장 결함을 보이는 균주를 폐기합니다. 그의 플레이트 또는 그 플레이트는 질병 기질 단독보다 실질적으로 더 큰 독성을 나타냅니다. 콜로니 PCR에 의한 HSP 1, 0, 4 변이체를 서열분석하기 위해, 먼저 SD 히스 유로 플레이트에서 약 10마이크로리터의 효모를 긁어내고, PCR에서 스트리핑된 튜브에서 20밀리 수산화나트륨 3마이크로리터로 세포를 동결 해동하여 세포를 제거합니다.먼저 스트립을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 냉장고에서 10 분 후에, thermocycler에 있는 99 섭씨 온도에 10 분 동안 관을 배양하고, 그 후에 높은 뇌관 농도를 사용하여 PCR 급료 물로 100 microliters에 균주를 묽게 하십시오. 다음으로, 표본에 표준 PCR 프로그램을 달리고, 적합한 크기의 A PCR 제품의 확대를 확인하기 위하여 그 후에 agel 전기 이동법에 의하여 표본을 분석하십시오.마지막으로, 돌연변이에 대한 염기서열분석 크로마토그램을 철저히 분석하면서 PCR 산물의 염기서열분석을 진행합니다. 돌연변이는 효모가 종종 여러 플라스미드를 보유하기 때문에 주어진 부위에 두 개의 뉴클레오타이드가 혼합된 것으로 관찰될 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서, 중간 영역에서 무작위 추출된 HSP 1 0 4 변이체의 라이브러리를 구축한 후, 라이브러리는 갈락토오스 유도성 TDP 43 발현을 위한 플라스미드를 함유한 효모로 변형되었습니다.이어서, 형질전환체를 회수하여 글루코스 및 갈락토스 플레이트에 플레이팅하여 갈락토스 플레이트로부터 선택된 스크린 히트의 엄격성을 평가하였다. 초기 스크리닝에서 선택된 변이체의 하위 집합에 대한 5개의 FOA 치료 스포팅 분석에 따라. 선택된 4개의 콜로니 중 2개는 HSP 1 0 4를 나타내고 TDP 43 독성 억제를 매개함을 나타냅니다.하나는 위양성이었고 다른 하나는 향상된 독성을 보였습니다. 5번의 FOA 처리 후, 2개의 실제 히트는 중간 도메인 돌연변이를 확인하기 위해 콜로니 PCR에 의해 염기서열 분석되었습니다. 이러한 HS P 1 0 4 돌연변이는 독성 억제를 확인하기 위해 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 부모 HSP 1 0 4 플라스미드에서 만들 수 있습니다.일단 마스터되면, 이 기술은 5개의 FO에서 한 번에 최대 200개의 히트를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며, 적절하게 수행되면 1-2주 동안 한 단계에 걸쳐 단계를 수행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 이 절차에 따라 플라스미드 혼합물을 얻는 경우가 많으므로 염기서열분석 결과를 주의 깊게 분석하는 것이 중요합니다. 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 HSP 1 0 4 변이가 질병 관련 기질의 응집에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 독성 억제제를 선택하기 위해 HSP 1 0 4 변이체 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

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이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

학습하세요 Hsp104 변종 라이브러리 스크리닝을 통해 효모 단백질병증 모델에서 단백질 독성을 억제하는 방법을. 이 기법은 단백질 오접힘 장애 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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