Name: 망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 학습하세요 돼지 또는 소 망막에서 광수용체 외부 세그먼트를 초원심분리로 대규모 정화하는 방법을. 이 기술은 망막 색소 상피 세포의 탐식 활성 연구에 필수적인 재료를 제공합니다.

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이 작품은 직원은 국립 드 라 공들인 (Jeunes Chercheuses / EFN에 Jeunes Chercheurs), 파운데이션 VOIR 등 Entendre과 파운데이션 Bettencourt SCHUELLER (EFN에 젊은 연구자 지원 사업), 센터 국립 드 라 과학원 (CNRS, EFN에 대한 영구적 인 위치)에 의해 지원되었다 및 (SCF에 R01-EY13295) 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소. 또한, 문화원 드 라 비전은 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE, 대학 학자 피에르 등의 마리 퀴리 - 파리 6, 센터 국립 드 라 과학원과 부서 드 파리 재정 지원된다.

이 POS 분리 실험은 시간이 걸리고 POS 저장하기 전에 표시하는 경우 완료하는 데 12 시간까지 요구할 수있다. 프로토콜은 1997 10 SC Finnemann와 동료 1987 (31)에 RS Molday와 동료에 의해 ​​출판 및 수정 된 논문에서 적응하고있다. 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 (ARVO) 문 협회에 대한 연구에 따라 처리 하였다. 프로토콜을 검토하고 대학의 피에르와 마리 퀴리 - 파리 06에서 찰스 다윈 (Charles Darwin) 윤리위원회와 포드 햄 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 일반 설정까지 <ol><li> 가능한 도살 후 80 신선한 돼지 또는 소 눈 신선한 빨리 얻기과 어둠 속에서 냉장 보관하십시오. 이 회사는 같은 방식으로 진행 있도록 공급자에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 (80)의 눈에 최적화되어 있습니다. 에더 눈을 진행하고 더 큰 주식을 얻을 수 (예를 들어, 160 눈에서) 솔루션 수량을 두 배로 초 원심의 2 라운드를 수행; 풀 샘플은 이후 단계에서 수집한다 (단계 2.2.2 참조). </li><li> 빨간색 안전 등 램프, 흡수 패드는 벤치에 설정, (재료 표)를 정리합니다. (... 유리체되지 않는 눈 부분) 15cm 요리와 생물 학적 가방 폐기물 수집을위한 준비. 꽉 끼는 labcoat, 장갑, 소매 보호 고글을 착용 할 것. </li><li> 주의 사항 : <ol><li> 모든 솔루션을 사전 진정 모든 단계에서 감기에 보관하십시오. 가능한 한 많은 얼음에 냉장 눈과 구배를 유지합니다. </li><li> 초 원심 분리 후 수집 단계는 시각적 안료 및 photopigments의 활성 형태의 오렌지 핑크 색상의 손실 photobleaching에 방지 할 때까지 가능한 한 많은 어둠 속에서 눈과 파생 조직을 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 프로토콜 작업 <ol><li> 솔루션과 그라디언트를 준비합니다 <ol><li> 해동 타우린 주식은 완전히 37 ° C의 물을 욕조를 사용. </li><li> 원액의 모든 솔루션 (표 1, 재고 솔루션)를 준비하고 철저하게 각 솔루션에 대한 자기 교반기를 사용하여 다른 재료와 설탕을 섞는다. <ol><li> 20 % 수 크로즈의 최종 농도로 균질화 용액 15ml를 준비, 20 mM 중의 아세테이트 pH7.2 2 mM의 트리스의 MgCl 2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 타우린. </li><li> (70 % 수 크로즈 스톡을 사용) 25 % 슈 크로스, 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2, 10 mM의 포도당과 타우린 5mM의 최종 농도 25 % 수크로오스 용액을 제조 하였다. </li><li> (수크로오스 분말을 사용) 60 %의 자당 최종 농도 60 % 수크로오스 용액을 준비하는 20 mM 아세트산은 pH7.2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 트리스 타우린. </li><li> 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도로 세척 한 용액을 준비한다. </li><li> 세척이 솔루션을 준비합니다10 % 수 크로스, 20 mM 트리스 pH를 아세트산 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도. </li><li> 10 % 수 크로스, 20 mM의 인산 나트륨 pH를 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도 3 워시 용액을 준비. </li></ol></li><li> 자석 교반기에 그라데이션 메이커 꾸준한 60 % 용액이 삽입됩니다 출구에서 가장 가까운 챔버에서 교반 막대를 삽입합니다. 적절한 주조 속도를 달성하기 위해 튜브의 출구에 배치 된 차단 P200 피펫 팁을 사용한다. </li><li> 섬세 희석 및 사전 냉장 초 원심 분리기 튜브에서의 각 용액 (80 눈 즉, 총 6 튜브)를 사용하여 12 ml의 25 %로 한 60 % 수크로오스 용액을 교반하여 선형 그라디언트 캐스트. 잘 점차-희석 60 % 자당 솔루션을 저어. 너무 빨리 원활하지 용액 쏟아지는 구배 흐름의 속도를 정상. 주 : 연속, 선형 구배를 얻기 위해서는, 전체 오른쪽 그라데이션 상자 형성 용 용액의 표면에 피펫 팁 개구 유지N. </li><li> 그라디언트 안정화를 위해 약 1 시간 동안 얼음에 앉아 보자. 로드 될 때까지 냉각 구배를 유지합니다. 그라디언트의 중단을 방지하기 위해 튜브를 흔들지 마십시오. </li></ol></li><li> 조직 컬렉션 : <ol><li> 희미한 붉은 빛 아래 조직을 수집합니다. 한 손으로 눈을 타고 멀리 눈을 유지하면서 면도날의 가장자리에 전면을 찌를 (튀는 것을 방지하기 위해, 그림 1). 2 반 (각막 플러스 공막에 최소 5mm)로 전방 안구를 잘라 면도날을 사용합니다. 렌즈를 제거하고, 따라서 하나의 손가락이 망막의 노출 선단에 걸쳐 유지 될 수 있도록 뒤집어 아이 컵 플립. </li><li> 각도 면도날을 사용하여 쉽게 분리하고 부드럽게 tapetum 표면에서, 분홍빛 층으로서 나타나고 시신경 (도 1)에서 절단, 망막 긁어. 2 × 50 ㎖ 튜브 얼음에 균질화 용액 15 ml에 포함 된 각각의 모든 망막를 수집합니다. </li><li> 망막 호모genization : <ol><li> , 다른 세포 층을 방해 PR 세포, 조각 POS의 나머지 떨어져 POS 휴식과 망막 서스펜션을 균질화하기 위해 2 분 동안 손으로 적극적으로 서스펜션을 흔들어. </li><li> 깨끗한 거즈 이중층를 필터링 3X 큰 조직편을 제거하고 관류 깨끗한 50ml의 튜브 (도 1)에 수집한다. 망막 서스펜션은 부드럽게, 수율을 극대화 각 여과 후 남은 조각 조직을 해제 거즈에 눌러, 아주 두껍게. </li></ol></li></ol></li><li> 광 수용체 외부 세그먼트 조각 (POS) 분리 : <ol><li> 60 % 자당 그라데이션 (그림 1) - 30 × 6 이상 ML의 초 원심 분리기 튜브 신선한 냉장 연속 25의 각 포함한 24 ml의 튜브 당 7 ml의 - 부드럽게, 6 주위를 원유 망막 준비를하다. 로터가 사용될 수 있도록 적절한 균형 대향 튜브. 4 ° C에서 50 분 동안 106,000 XG에 초 원심 분리기. </li&gt; <li> 흡인 (그림 2A)에 의해 그라디언트의 상위 세 번째에 오렌지 핑크 밴드 위의 솔루션의 대부분을 제거합니다. 커에 컷오프 P1000 팁과 오렌지 핑크 밴드를 수집합니다. 표백제 (생물학적 폐기물)를 사용하여 중화 한 후 나머지를 폐기하십시오. </li><li> 얼음처럼 차가운 세척 한 용액의 5 볼륨 - ~ 4로 희석. 필요한만큼 30 ml의 튜브로 분리합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 위에서 설명한 바와 같이 10ml에 재현 탁 펠렛 10 분 동안 3,000 XG에이 솔루션 스핀을 씻으십시오. (15) 용액에 재현 탁 펠렛 3 씻고 10 분 동안 3,000 XG에 다시 스핀. 워시 2 원심 분리하기 전에 필요한 튜브의 수를 줄이고 3 솔루션을 세척하기 위해 여러 펠릿에서 현탁액을 결합합니다. </li></ol></li><li> POS는 표시하지 않고, 분취 : <ol><li> 20 ml의 DMEM - 10에 재현 탁 POS. 예비 희석 (10) 490 μL DMEM (1시 50분)에 μL와에 휙 POS뿐만 아니라 신장 카운트세포 계수 챔버 (도 2B). 1 mL 당 POS 입자의 수​​율과 농도를 계산한다. 참고 : - 8 × 10 9 POS에서 80 돼지 눈 수율은 예를 들어 연령 및 변형 돼지 / 소와 눈의 크기에 주로 따라 달라집니다, 좋은 준비는 5 범위. </li><li> 최종 부피 DMEM 결정 (전형적 10-20 ml) 및 2.5 % 수 크로스의 최종 농도를 수득 크로즈를 추가한다. </li><li> 예를 들어, 원하는 크기의 분량을 준비 / 웰 40 μL에서 96 웰 실험 2 ML의 재 부상 볼륨에 대한 튜브 당 5 × 10 7 POS. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 1 나누어지는 스핀과 펠릿 크기를 평가한다. POS 두 번 냉동 및 해동하지 말아 서로 다른 응용 프로그램의 볼륨에 대한 다양한 나누어지는 크기를 준비합니다. </li><li> 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 POS 씩 동결. 참고 : 분취 량 몇 달 동안 안정하다. 우리의 손에, 레이블 또는 레이블 POS는 1 년 이상 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> POS 라벨 및 분취 : 참고 : 우리는 일반적으로 식균 작용 분석의 정량화를위한​​ POS 라벨을 FITC를 사용하지만, 다른 염료를 사용뿐만 아니라 필요에 따라 할 수있다. <ol><li> 1.4 ml의 0.1 M 나 2 CO 3의 pH 11.5 (표 2, 재고 솔루션)와 2.6 ml의 0.1 M의 NaHCO3 pH가 8.4를 혼합하여 0.1 M 나 탄산 완충액 pH 9.5에서 2.5 ㎎ / ㎖ 농도로 재현 탁 (1) 10 mg을 FITC 유리 병. 비 재현 탁 FITC 고체 펠릿 최대 속도로 5 분 동안 빛과 스핀에서 보호하면서 실온에서 1 시간 동안 회전합니다. </li><li> 워시 3 솔루션 (또는 DMEM) 10ml에 POS 펠렛을 재현 탁 80 눈 FITC 용액 2 ㎖를 추가합니다. -80 ° C에서 냉동 남은 FITC 저장합니다. 실온에서 적어도 1.5 시간 동안 회전합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 2.3.4 절에 설명 된대로 거의 무료 FITC가 뜨는 F에서 볼되지 않을 때까지 한 번 또는 두 번 DMEM에 두 번 씻으 3 솔루션을 사용하여 표시 POS를 씻으raction. DMEM에 재현 탁 POS 및 계산하고, 분취 (2.4 절)에 대한 레이블이없는 POS 용으로 진행합니다. </li></ol></li><li> 실험에 POS를 사용 : <ol><li> 해동 RT에서 POS, 그들이 형광 표지 된 경우 최대한 어두운에 보관. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 스핀. 뜨는을 기음. </li><li> 실험에 의해 지시 된 바와 같이 즉시 분석 용액의 적절한 용적에 재현 탁. POS 도전 달라지는 경우, 저장소는 수 시간 동안 시간 어두운 점 사이에서 RT에서 POS 재현 탁. </li></ol></li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세 단계 또는 조건이 최적화 된 정제에 매우 중요하다 : 그라데이션 주조 섬세한 그라데이션 튜브 조작의 품질, 냉장 및 수집 단계까지 어둠 속에서 조직을 유지, 망막 균질의 흔들림의 강도는 PR의 나머지 부분에서 적절한 POS 격리을 얻었다 세포. 몇 가지 문제가 제대로 오렌지 대역을 보는 발생할 경우, 인해 상기 세 가지 이유 중 하나 (도 결과 섹션의 두 번째 단락 참조) 가장 가능성이 높다. 단계 33,21 그라디언트 Optiprep 32 또는 50 % 수 크로스 구배 농도 - 특정 조건의 일부 변형 (27)의 사용과 같이 가능하다. 일부주의 POS 두 번 냉동 및 해동 안으로 실험 분량에 대해주의 할 필요가있다. 따라서 다른 응용 프로그램의 볼륨에 대한 다양한 크기를 준비하는 데 유용합니다. POS 사전 라벨은주의해서 사용해야합니다. 공유라벨은 매우...

망막, 시력은 뇌의 시각 영역까지 뉴런 사이에서 전송 될 수있는 신호로 변환되기 전에, 감광성 opsins 불리는 분자의 이성화에 의해 트리거된다. 이들 분자는 시각 세포의 외부 세그먼트 부 PRS ()를 구성 팬케이크 닮은 멤브레인 디스크 스택에 포함된다. 빛과 산화 스트레스 때문에 상당한 수준으로 일정하게 노출 실시한, 푸에르토 리코 놈들은 지속적으로 잠재적 인 산화 적 손상을 제한하기 위해 자신의 외부 세그먼트를 갱신. 감광체 외부 세그먼트는 인접하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 미세 융모 꼭대기에 밀착된다. RPE 세포는 혈액 망막 장벽의 외측 부분을 구성하며, 이러한 멜라닌 색소, 광 반응성 옵신 성분 망막 재 이성화 제공 영양분 g 통해 광선 담금질 감광체 건강과 기능 1에 중요한 수많은 작업을 보장홍보 대사 처리에 참여하는 요인을 rowth. 또한, RPE 세포는 POS를 보냈다 및 구성 요소, 포유류 망막 2,3의 일주기 리듬에 의해 조절된다 매일 직업을 재활용 제거합니다. 창고 POS의 간격은 PR 생존에 절대적으로 필요하다. 이 완전히 폐기 될 때, POS 파편 축적 PRs를 급속 시력 손실을 야기 4,5- 퇴화. 리듬 프로필이 손실 일정한 활동으로 대체하는 경우, PR 및 RPE 결함은 6 세에 축적된다. 따라서, 해당 장애에 링크 표현형을 이해하기 위해서는 시험관 내에서 RPE 탐식의 분자 특성을 조절하는 것이 매우 중요하다. 흥미롭게도, 망막 색소 상피 세포에서 분자 기계는 세포 사멸을 취소 식세포에서 사용하는 것과 매우 유사하며, 모두 식세포 파편 7-9에 노출 된 포스파티딜 세린의 인식에 따라 달라집니다. 그러나 망막 색소 상피 세포와 대 식세포는 산도를 조절대 식세포는 만남시 사멸 세포의 즉각적인 제거에 대한 선택으로 agocytosis는 다르게, 망막 색소 상피 세포는 리듬 외부 세그먼트 영구 접촉에도 불구하고 하루에 한 번만 POS를 침몰한다. 이것은 아직 완전히 이해되지 않는 특정 규제 메커니즘을 제안한다. 망막 색소 상피 식세포 기계에 연루 분자의 대부분은 확인 또는 격리 된 POS 및 세포 배양 식세포 작용 분석의 사용 덕분에 확인되었다. 리간드 MFG-E8와 협응 혀끝 RPE 세포 표면에 위치 alphavbeta5 인테그린 수용체는 다음 MerTK 티로신 키나제 수용체를 통해 내부화되는 13-15 POS 10-12에 특이 적으로 결합. 소제 CD36 수용체 POS 섭취에 참여하고 그 속도 (16, 17)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, POS면 (18)에서 산화 인지질의 센서로서 기능 할 수 있습니다. 국제화는 F-액틴 세포 골격 엉덩이의 채용이 필요이러한 넥신 2 (19), 미오신 II (20)과 미오신 VIIA 21, 22로 ociated 단백질. 체외에서 기본 또는 산화 POS도 제대로 소화 산화 POS 23-28의 축적에 연결된 생체 내에서 망막 색소 상피 세포의 노화 표현형을 이해하기 위해 사용된다. 줄기 세포 유래의 RPE 세포의 생성은 동물이나 환자 29,30,27 이식 전에 세포 기능을 증명하기 위해 사용되는 절연 POS 용의 애플리케이션을 개시하고있다. 먼저 1987 31 Molday와 동료에 의해 ​​기술, 소 POS의 분리를위한 프로토콜 (11- 시스 망막을 운반) 표백 망막 photopigment의 특성 오렌지 모양의 관찰 연속 자당 그라디언트에 망막 균질의 초 원심 분리 단계를 결합합니다. 지난 10 년에 광우병의 위험을 최소화하기 위해 취해진 조치에 의한은 돼지의 사용은 눈 increasi되었다ngly 눈에 띄는. 여기에 설명 된 프로토콜은 돼지 또는 분주 장시간 동안 저장 될 수 소의 눈에서 POS 다량 획득하는 방법을 보여준다. 이 POS 준비 및 분석 32,33,21,22 당 동물의 다수 사용해야 쥐 눈에서 POS를 준비 할 필요를 없애 준다. 또한, 형광 분자를 사용하여 저장하기 전에 POS 라벨에 대한 자세한 내용은 정량화 식균 작용 분석 32, 10 후 라벨 POS에 비해 일부 응용 프로그램에 대한 간단하고 비슷한 방식으로 POS를 시각화하기 위해 제공됩니다. 따라서,이 물량은 큰 실험의 다양한 종류의 재현성 및 사용의 용이성을 허용한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> 특정 재료/장비</td></tr><tr><td>2 챔버 그라디언트 메이커</td><td>그라디언트 메이커</td><td></td><td></td> 30ml 챔버가 있는 그라디언트 메이커</tr><tr>그라디언트 주조용<td>3mm 직경의 실리콘 튜빙</td><td></td><td></td><td>튜빙 그라디언트 주조용</td></tr><tr><td>소형 마그네틱 교반 바</td><td></td><td></td><td>그라디언트 메이커 챔버에 맞는 교반 바</td></tr><tr><td>빨간색 safelight 램프</td><td></td><td></td> 해<td>부용 무법 램프 dark</td></tr><tr><td>Ultra Clear 25 x 89 cm 튜브</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>초원심분리 튜브</td></tr><tr><td>PP Oak Ridge 튜브</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>30 ml 원심분리 튜브</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>초원심분리기</td></tr><tr><td>SW 32Ti 스윙 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>초원심분리기용 스윙 로터</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>JA-25.50 로터</td><td></td><td>Avanti J-26 XP 원심분리기</td>FITC 이성체 I Life Technologies F-1906 용 <td>Beckman Coulter</td> 363058 로터</tr> 형<tr><td></td><td></td><td></td><td>광 염료</td></tr><tr><td colspan="4">기타 재료/장비</td></tr><tr><td>계수 챔버(예: Neubauer 또는 Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뚜껑</td><td></td><td></td>이 있는 어두운 얼음 양동이<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>저울</tr><tr><td>자석 교반기 및 지지대 냉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장 마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>-80 &deg; C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">소모품</td></tr><tr><td>실험복</td><td></td><td></td><td>건강 및 안전</td></tr><tr><td>장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬리브 프로텍터 고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡수 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학적 위험 쓰레기 봉투 및 쓰레기통</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weck-Prep 블레이드</td><td></td><td>해부</td><td>60mm/2.25인치 너비 면도날</td></tr>, <tr><td>15cm 플라스틱 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 멸균 거즈 시트</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>15ml 및 50ml 튜브</td><td></td><td></td><td>공통 소모품,</td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

망막 색소 상피 (RPE) 세포, 감광체 외측 세그먼트 (POS)의 소비 세 말단 단편의 탐식 중요한 기능 중 하나의 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. phototransduction 기계를 포함하는 멤브레인 디스크의 스택과 함께 광 수용체 외부 세그먼트는 지속적으로 망막에 갱신됩니다. 소비 POS는 망막 색소 상피 세포에 의해 매일 제거된다. 설치류, 돼지 / 소 및 인간 RPE 세포는 유사한 방식으로 다양한 종으로부터 POS 인식. 작은 변동으로 큰 시리즈의 실험을 수행하는 것을 용이하게하기 위해, POS의 큰 눈 스톡은 돼지로부터 분리 및 분취 냉동 저장 될 수있다. 이 프로토콜은 어두운 곳에서 보관시 오렌지색 표시 photopigments의 특성을 이용한다. 희미한 붉은 빛에서 절반으로 잘라 열 eyecups에서 버퍼에 망막 수집됩니다. 망막 세포 현탁액을 균질화 연속 수크로오스 구배 상으로 여과시키고로드된다. CEN 후trifugation는 POS는 오렌지 색상 특성을 갖는 그래디언트의 상단부에 개별 대역에 위치한다. POS는 다음 수집, 회전, 세척 버퍼에 순차적으로 재현 탁, 카운트 분주합니다. 이 방법으로 얻어진 POS 식세포 작용 분석 및 POS 도전 후 다양한 시점에서의 단백질 활성 지역화 또는 상호 작용의 분석에 이용 될 수있다. 또한, POS는 전자. 형광 물질로 표시 할 수 g., FITC, 이후의 형광 결합 POS의 정량 또는 말림을 위해, 분취 전에. 다른 가능한 애플리케이션은 산화 스트레스 또는 RPE 세포에 대한 노화의 효과를 연구하기 위해 스트레스 조건과 결합 된 변성 또는 POS POS 도전 사용을 포함한다.

선형 자당 구배 초 원심 분리의 조합은 망막 밀도 현탁액의 다른 구성 요소의 분리를 허용한다. 크고 무거운 망막 및 RPE 세포 파편은 구배 (도 2a)의 바닥 또는 근처에 가라. 망막 라이터 POS 라이터 개별 세포 또는 세포 파편은 원심 분리 기간의 종료에 의해 그라데이션의 상단 절반에 도달하는 등의 별도의 대역을 이동한다. 원심 분리 단계 이후까지 어두운 눈과 샘플을 유지함으로써, POS 함유 대역 즉시 밝은 오렌지 색으로 인식 할 수있다. 이 밴드의 폭과 강도는 그라데이션 품질과 튜브 높이 (89mm 높이가 바람직)에 따라 달라집니다. 제대로 격리 할 때 현미경 슬라이드 (그림 2B)에서 관찰 할 때 일반적으로 POS는 직선 또는 구부러진, 길게 나타납니다. 현미경의 초점 평면에 따라, 그들은 어둡거나 빛나는 하나를 표시 할 수있다. 하지 resus 경우제대로 보류, 그들은 대단히 짧은 시간에 남아있을 것입니다. 그들은 (아래 단락 참조) 손상된 경우, 그들은...

이 기사에서는 균질화 및 자당 구배 원심분리를 사용하여 돼지/소 망막에서 초원심분리를 통해 광수용체 외분절 조각(POS)을 정제하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 -80°C에서 보관할 수 있는 라벨링 또는 라벨링되지 않은 POS 부분 표본을 대량으로 준비할 수 있습니다.

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

이 절차의 전반적인 목표는 전쟁 징후 또는 소의 눈에서 정제된 광수용체 외부 세그먼트의 대규모 스톡을 생성하는 것입니다. 망막 색소의 가장 중요한 기능 중 하나인 상피 세포, 리듬감 있는 일일 OC 산 활동을 연구합니다. 이것은 먼저 초원심분리기 튜브에서 25-60%의 자당, 구배를 주조하여 수행됩니다.다음으로 돼지 또는 소의 눈을 해부하고 레이를 수집하고 균질화합니다. 다음으로, re를 여과하고 슈크로스 구배(sucrose gradient) 및 원심분리(centrifuge)에 로드하여 광수용체 외부 세그먼트를 분리합니다. 마지막으로, 광수용체 외부 분절을 포함하는 주황색 띠는 있는 그대로 보관된 부분 표본에 수집되거나 Ali, 인용 및 저장 전에 라벨링됩니다.궁극적으로, 자동 형광 스캐닝, 형광 현미경 검사 또는 면역 블로팅은 세포주, 줄기 세포에서 유래한 분화된 세포 또는 다양한 조건의 1차 배양의 식세포 활성을 연구하는 데 사용됩니다. 각 실험에서 질량 또는 눈으로부터 자동 세그먼트를 분리하는 것에 비해 이 기술의 주요 장점은 동일한 재료 풀을 여러 실험에 사용할 수 있으므로 더 높은 수준의 재현성을 허용한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 격리된 외부 세그먼트의 범위를 조절하기 때문에 중요한 단계가 이온 주조에 있기 때문에 실용적입니다.절차를 시연하는 것은 대학원생이자 내 실험실의 기술자인 Celia Parino가 될 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 80개의 신선한 돼지 또는 소 눈을 얻은 후 가능한 한 어두운 곳에 보관하고 얼음 위에서 차갑게 유지합니다. 벤치에 설치된 시각적 안료의 사진 표백 및 주황색 분홍색 손실의 손실을 방지하기 위해 빨간색 안전 조명 램프 흡수 패드와 물티슈. 쓰레기 수거를 위한 15cm 접시, 생물학적 위험 봉투, 면도날을 준비하십시오.모든 솔루션이 준비되면 텍스트 프로토콜에 따라 미리 식히고 모든 단계에서 차갑게 유지하십시오. 그라디언트 메이커를 자기 교반 플레이트에 고정하고 60% 용액이 부어질 출구에서 가장 가까운 챔버에 교반 막대를 삽입합니다. 튜빙 출구에 배치된 절단 P 200 피펫 팁을 사용하여 각 25% 및 60% 자당 용액을 12ml씩 적절한 주조 속도로 달성합니다.그리고 60% 용액을 교반하는 동안 사전 냉각된 원심분리 튜브에 선형 자당 구배를 주조하여 지속적으로 상승하는 구배 용액의 표면에서 피펫 팁의 개구부를 유지합니다. 티슈 채취를 위해서는 꽉 끼는 실험복, 장갑, 소매 보호대, 고글을 희미한 붉은 빛 아래에서 착용하고 한 손에는 눈을 잡고 절단면을 외면한 채 면도날의 가장자리를 사용하여 눈 앞쪽을 뚫습니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 앞쪽 안구를 두 반으로 자릅니다.렌즈를 제거하고 아이컵을 뒤집어 한 손가락 끝에 잡을 수 있도록 합니다. 따라서 면도날을 비스듬히 사용하여 망막을 노출시키고 망막을 부드럽게 긁어내면 망막이 쉽게 분리되어 테텀 표면에서 분홍빛이 도는 층으로 나타나고 시신경두를 절단합니다. 얼음 위에 15ml의 균질화 용액이 들어 있는 2-50ml의 튜브 중 하나로 망막을 옮깁니다.모든 망막을 모은 후 2분 동안 손으로 서스펜션을 세게 흔듭니다. 서로 다른 세포층을 파괴하기 위해서는 광수용체 외부 분절을 끊거나 나머지 광수용체를 POS로 분리하고 POS를 단편화하여 망막 현탁액을 균질화합니다. 큰 조직 조각을 제거하려면 깨끗한 거즈의 이중층을 사용하여 서스펜션을 50ml 튜브에 세 번 여과합니다.거즈를 부드럽게 눌러 남아 있는 조각난 조직을 제거합니다. 각 여과 후 조잡한 망막 제제를 6-24 밀리리터, 25-60 % 자당 구배로 부드럽게 놓습니다. 튜브 울트라 원심 분리기를 106, 000 °C에서 50 분 동안 균형을 잡은 후 섭씨 4 도에서.스핀이 완료되면 그래디언트의 위쪽 1/3에 있는 주황색 분홍색 띠 위의 용액 대부분을 흡인합니다. 그런 다음 P 1000 팁을 사용하여 주황색 분홍색 밴드를 비커에 모읍니다. 약 4-5 부피의 Wash One을 사용하여 용액을 희석하고 필요한만큼 많은 30 밀리리터 튜브로 분취하십시오.3000GS에서 섭씨 4도에서 10분간 원심분리기를 하고 상등액을 조심스럽게 버립니다. 그런 다음 두 개의 용액을 세척하고 다시 회전시키기 전에 펠릿을 중단하십시오. 펠릿을 세척하기 위해 세척 3 용액을 사용하십시오.세 번째로. POS를 분주하기 위해. 10-20밀리리터의 DMM을 사용하여 세포를 재현탁합니다.그런 다음 490마이크로리터의 DMM을 사용하여 10마이크로리터의 셀을 희석하고 밀리리터당 POS 입자의 수율과 농도를 다시 계산합니다. 최종 DMM 부피를 결정하고 최종 농도 2.5%로 자당을 첨가합니다.원하는 부분 표본을 준비합니다. 2, 300 GS에서 단일 부분 표본을 실온에서 3-5분 동안 회전시킵니다.펠릿 크기를 평가하고 여러 부분 표본 부피를 준비하여 한 번 이상 동결 해동을 방지합니다. Eloqua 와팅 전에 셀에 레이블을 지정합니다. 0.1몰 탄산나트륨 완충액을 사용하여 10mg 바이알 1개를 10mg ZI를 1ml당 2.5mg의 농도로 재현탁합니다.어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 회전하고 5분 동안 최대 속도로 회전하여 남아 있는 ZI 고형물을 펠릿화합니다. 10ml의 세척 3 용액 또는 dmm을 사용하여 POS 펠릿을 재현탁하고 80개의 눈에 2ml의 Fite 용액을 추가합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고 최소 1.5시간 동안 회전하십시오.실온에서. 비디오에서 앞서 설명한 대로 세척 3 용액을 사용하여 세포를 두 번 세척한 다음 상등액에서 유리 피트가 거의 보이지 않을 때까지 EM을 1-2회 DM합니다. DM EM을 사용하여 POS를 일시 중단하고 여기에 표시된 것처럼 레이블이 지정되지 않은 POS와 유사한 쿼트를 계산합니다.원심분리 단계가 끝날 때까지 눈과 샘플을 어두운 곳에 유지함으로써 POS를 함유한 자당 구배 금지는 밝은 주황색으로 즉시 인식할 수 있습니다. 그리고 손상되면 먼지가 많은 배경과 같이 훨씬 더 작은 조각으로 나타납니다. 일반적으로 적절하게 격리되면 POS는 길쭉하거나 곧거나 구부러진 것처럼 보여야 합니다.현미경으로 관찰하면 현미경의 초점 평면에 따라 어둡거나 반짝이는 것처럼 보일 수 있습니다. 제대로 부유하지 않으면 덩어리로 남게 됩니다. 분리된 POS는 돌연변이 RPE 세포의 식세포 능력을 직접 테스트하는 역할을 합니다.이 예에서 POS는 야생형 마우스의 1차 RPE 세포에 의해 쉽게 식세포화되는 반면, 베타 5 인테그린 및 MFG 8 녹아웃 마우스의 세포는 동일한 시간 동안 POS가 적습니다. POS 식균작용의 정량화는 현미경 사진에서 FSE로 표지된 POS를 수동으로 계수하거나, 형광 강도를 측정하거나, 세포 트립신 후 유세포 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 이 그림은 면역형광법, 공동국소화 분석을 사용하여 단백질 동원을 분석하며, 면역침전 후 면역 블록에서 또는 개발 후 인산화를 확인하여 단백질 동원 또는 활성화를 검증할 수 있습니다.이 기술은 인산염 세인 매개 식세포작용 분야의 연구자들이 망막 색소 꽃잎 세포의 분자 메커니즘을 탐구 및 특성화하고 그 결과를 대식세포와 같은 다른 식세포 세포와 비교할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 돼지의 눈에서 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하여 in vivo 및 ex vivo 연구를 위한 기본 배양을 얻는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 색소 세포는 안구 질환을 치료하기 위한 재생 접근법을 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.

IPE 및 RPE 세포의 분리: 분리된 돼지 눈에서 색소 상피 세포를 얻는 기술

이 동영상은 채취한 소의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포와 홍채 색소 상피(IPE) 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 분리된 세포를 배양하여 안구 질환 치료에서 자신의 역할을 연구할 수 있습니다.

소의 눈에서 RPE 및 IPE 세포 분리: 소 1차 색소 상피 세포를 수확하고 배양하는 절차

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

이 프로토콜은 국소에서 공급된 돼지 눈에서 원발성 망막 색소 상피(RPE) 세포를 얻고 배양하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 세포는 줄기 세포의 고품질 대안 역할을 하며 체외 망막 연구에 적합합니다.

In vitro 모델링을 위한 Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells의 분리

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

학습하세요 돼지 또는 소 망막에서 광수용체 외부 세그먼트를 초원심분리로 대규모 정화하는 방법을. 이 기술은 망막 색소 상피 세포의 탐식 활성 연구에 필수적인 재료를 제공합니다.

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

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