Name: 마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 형광 리포터 마우스의 태아 내이 explant를 5일간 30분 간격으로 장기 시간 경과 영상 촬영하는 방법을. 이 기법은 형태 발생 운동과 유전자 발현 변화를 관찰하여 청각 발달 및 난청 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다

마우스 조직을 유지 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리 지침에 캐나다위원회에 따라 안락사 쥐 12 -reporter SOX2 EGFP에서 수확했다. 1. 배양 배아 Cochleae <ol><li> DMEM 8.89 ml의 소 태아 혈청 1 ㎖ (FBS), 100 × N2 보충제 100 ㎕, 및 / ㎖ 시프로플록사신 10 ㎎의 10 μl를 혼합하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 보충. 100 % HEPES 5 ㎖와 함께 495 ㎖의 HBSS를 혼합하여 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 보충. </li><li> 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다 : <ol><li> 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 </sub&gt; 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터. 참고 : 요리의 기본은 투명하고 이미지에 적합 함을 보장하기 위해, 잘 외식 결국 쉽게 찾을 지역에 정착 할 수있는 요리의 중심에를 만들려면 유리 요리는 다음과 같은 이유로 사용되는 바닥 그래서 실험 후의 샘플을 면역 염색 이후의 분석을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li><li> 워크 스테이션 및 도구를 준비합니다 : <ol><li> 층류 클린 벤치를 켜고 깨끗한 작업 공간을 만들기 위해 70 % EtOH로 다운 스프레이. 70 % EtOH로에서 (에이전트 (1 부) 및 숯 분말 (2.5 g)을 경화 (184) 실리콘 엘라스토머 (10 부)의 혼합) 집게, 숟가락, 검은 184 실리콘 엘라스토머 요리를 만끽 해보세요. </li></ol></li><li> 깨끗한 워크 스테이션에서, 실험 수확 배아. 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음의 적절한 임신의 배아를 수집합니다. <ol><li> 시연 외부 또는 눈에 보이는 기관을 결정리포터 활성 및 형광 실체 현미경을 이용하여 배아를 조사. 실험 대상은 이들과 같은 1 % HEPES로 보충되어 차가운 HBSS 얼음 리포터 활성을 나타내는 배아를 수집. </li></ol></li><li> 시간적 뼈를 수집 : <ol><li> 멋진 광원 및 미세 집게를 사용하여 신속하게 작동, 새끼의 머리를 수집합니다. 시간적 뼈의 손상을 방지하려면 경추에서 턱 아래에 클립주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거 머리의 앞을 트림, 깨끗한 접시에 1 % HEPES와 보충 신선한 얼음 차가운 HBSS에 후방 두개골을 전송합니다. 조심스럽게 전술에 전정 시스템을 유지하기 위해주의하면서 땅콩 모양의 시간적 뼈를 해부. </li></ol></li><li> 달팽이관을 해부 : <ol><li> 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음에 검은 색 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 시간적 뼈를 이동시켜 뼈의 전정 부위를 고정. 에 곤충 핀을 삽입측두골을 안정시키고 집게를위한 공간을 만들기 위해 경사 각도. 측두골는 그것이 그대로 달팽이관을 수확하는 것은 매우 어렵다 너무 많이 이동시킨다 것처럼 피닝 공정에서 중요한 단계이다. </li><li> 조심스럽게 달팽이관을 둘러싸고있는 연골을 제거합니다. 달팽이관의베이스의 바깥 쪽 가장자리에있는 연골에 포셉 한 가지를 넣고 연골에 구멍을 클립. </li><li> , 측면 플랩을 클립 집게의 가지를 넣고 부드럽게 연골에서 덕트의 지붕을 분리합니다. 대각선 위쪽과 가로로 클립, 조심스럽게 캡슐의 앞 부분을 들어 올립니다. 나머지 연골과 덕트 사이에 집게의 단자를 삽입하고 부드럽게 마지막 부분을 클립. 달팽이관의 꼭대기의 표면은 지금 노출되어있다. </li><li> 기본에서 시작, 덕트의 지붕은 인공 와우 상피에 맞는 영역을 잡아 인공 와우 덕트를 엽니 다. 조심스럽게 트리밍, 지붕을 벗겨필요한 경우이를 완전히 제거 될 때까지. 덕트의 내측에 남아있는 멤브레인의 어떤 부분을 잘라냅니다. 초과 중간 엽 조직의 덕트를 청소하고 전정 시스템에서 덕트를 분리합니다. </li></ol></li><li> 문화 외식 : <ol><li> 신중하게, 기판 코팅 유리 바닥 배양 접시의 중앙에, 절편, 내강 표면이 위로 가게 모든 액체를 그리는 2 분 동안 둡니다. 그것을 방해하지 돌보는 DMEM 드롭 현명한 절편을 보충 150 μl를 추가합니다. 절편, 무료 떠 집게로 위치를 변경하지만, 기판에 부착 할 수 있도록 절편은 접시의 바닥에 침전 있음을주의해야한다. </li><li> 습도를 유지하기 위해 멸균의 작은 접시로, 깊이 12cm 직경 페트리 접시에 유리 바닥 요리를 놓습니다. 하룻밤 절편이 기판에 부착하고 평평하게하기 위해서는 35 ° C의 배양기에 문화를 넣습니다. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 IMAGING <ol><li> 절편 샘플을 선택합니다. 각 외식 달팽이관의 상태를 평가하기 위해, 형광 실체 현미경을 사용한다. 덕트가 손상되지 및 삼각 형상에베이스에서 유리에 부착 된 경우에만 외식을 선택합니다. </li><li> 문화 인공 조직에 5 % CO 2와 35 ° C에서 인큐베이터를 설정합니다. 인큐베이터 현미경으로 문화를 넣어 : <ol><li> 조심스럽게 보충 DMEM을 대기음 적어도 500 μL 신선한 용지로 교체합니다. 육일까지 이미징, 1.5 ml를 더 좋다. 이식편이 느슨하게 부착되는 경우에, 접시의 가장자리 주위 미디어 링 피펫. 이 매트릭스에 부착 계속하면서 여분의 액체가 절편을 방해하지 않고 소형 &#39;가습 실&#39;을 만들 것입니다. <ol><li> 또한, 사용 시약 이미지 컬렉션 사이의 간격 동안 교환 할 필요가있는 경우 요리는 현미경에서의 피팅에 체류하는 동안 요리가 뚜껑을 엽니 다 커버 힌지. 힌지 접시 덮개는 덮개가 될 수 있도록샘플을 방해하거나 설정에서 요리를 제거하지 않고 열었다. 이 이후의 이미지 캡처에 대한 자신의 정확한 위치를 유지합니다. </li></ol></li><li> 샘플 접시 홀더에 적절한 샘플을 포함하는 유리 바닥 요리를 삽입합니다. 이 예에서 현미경 여덟 35mm 샘플 요리를 보유하고 회전 플랫폼을 가지고있다. </li><li> 층류 후드에서 유리 뚜껑 플라스틱 뚜껑을 교체하고 샘플 접시 홀더에 요리를 삽입합니다. 접시의 바닥에서 외식을 제거하거나 미디어를 방해하지 인큐베이터 돌보는 내부의 샘플 접시 홀더를 놓습니다. </li></ol></li><li> 영상 루틴을 설정합니다 : <ol><li> 현미경, UV 램프 및 카메라 스위치 및 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> , 샘플을 찾아 순서대로 각각의 요리에 대한 노출 시간을, 이미징 영역을 선택 초점면과 조정합니다. 초점은 시작시 절편의보기에뿐만 아니라 따라 평면을 선택하지만, 알그래서 조직을 이동하는 방법과 시간 경과를 실행할 시간을 명심. </li><li> 형광 채널에서 선택된 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 실험의 샘플링 주파수와 길이를 설정합니다. 샘플링 주파수는 영상을 수집하는 데 걸리는 시간에 의해 제한되므로,이보기의 필드를 선택하고 Z 스택을 설정 한 후 결정되어야한다. 이 경우 샘플링 다섯 일 동안 30 분마다 일어난다. 실험 기간은 최대 14 일 수있다. </li></ol></li><li> 동영상을 생성합니다 : <ol><li> 시간 경과 기간의 끝에서 이미지 파일을 연다. 순차 수집 포인트를 열어이 경우 MetaMorph로부터 소프트웨어가 사용된다. 프레임별로 관심의 세포 인구를 표시하기위한 최적의 초점면을 선택합니다. </li><li> .avi 파일에 이러한 변환 이미지, 또는 여러 예측에 개방되고 분석 이미지 처리 소프트웨어 또는 전환 될 수있는 이미지 세트를 생성하는 몽타주로 내보낼영상 처리 소프트웨어를 사용하여 TS. </li></ol></li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다. 우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택되어야한다. 절편의 나이를 선택하는 것이 중요합니다. E12에 성장의 방향이 예측하기 때문에 우리는 초기에 E13에 시작합니다. 이 절편이 기판에 부착 하룻밤 배양하는 것이 필수적이므로, 실험 다음 날 시작하는 계획해야합니다. 실험 E15 또는 오래된 시작하는 경우, 배양 조직 평면화 등 셀 상에 쉽게 확산 시간 경과로 E13 설립되어야한다 (도 3 참조). </p&gt; 코르티 기관이 이미징 될 경우, 달팽이관은 매우 조심스럽게 해부 것이 필...

포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters &#39;셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차. 배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E13에 인공 이식편 배양에 GSK 3β의 억제제를 추가 할 때 예를 들어, 최적의 잠복기는 화합물의 강력한 효과 육일 4 관찰. 개발 달팽이관의 라이브 영상은 코르티 기관의 형태의 변화로 조사를 할 수 있습니다, 유전자 발현의 변화, 이주의 추적 증식 또는 세포를 죽어가는, 그리고 실시간 제약 에이전트의 결과 관찰 및 신호의 중단을 할 수 있습니다 경로. 지금까지 달팽이관의 영상을 살고주로 단시간 5-8 위에 코르티 기관의 화상 작은 영역에 공 초점 현미경을 사용하여 수행하지만,이 기술은 이식편 생존력으로 인해 한계가있다. 느린 발달 과정에 장기간 조작의 효과의 촬상에서는, 촬상 환경이 매우 중요하다. 일반적으로 공 촛점 라이브 영상 시스템은 현미경에 앉는 가습 플라스틱 상자를 사용한다. 열 및 습도는 대물 또는 광원으로는 힌지 결합 된 개구를 통해 상기 microscope-의 다양한 부분 주위에 갭을 통해, 상기 액세스 창을 통해, 현미경 테이블을 충족 배양 상자의 간극을 통해 빠져 나갈 수. 이 이상의 2-3 일 건강한 이식편을 유지하기위한 최적이 아니다. 우리는 표준 CO 2 인큐베이터 안에 봉인 거꾸로 현미경보다는 현미경 중심으로 인큐베이터 &#39;인큐베이터 현미경&#39;을 정의합니다. 인큐베이터 현미경 전실험의 수명 경향 오히려 2-3 일 이상 촬상보다는 샘플 최대 2 주 동안 묘화 될 수 있도록. 인큐베이터 현미경은 문화와 표준 제어 조건을 절편하기 위해 최소한의 방해로, 세포의 성장과 분화를위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 여러 날에 걸쳐 수행 될 연구에서는 인큐베이터에서 제거하고 거꾸로 형광 현미경을 수행하여 매일 영상 샘플에 의존하는 것이 일반적이다. 이 방법을 사용할 수 있지만, 인큐베이터에서 요리를 제거하면 민감한 개발 조직에 스트레스를 입 힙니다. 때문에 인큐베이터에서 제거에 온도에서 배양 매체와 변동 산도의 변화는 차선의 개발과 건강하지 못한 조직이 발생할 수 있습니다. 동일한 초점 평면에서 모든 시점에서 동일한 방향으로 동일한 영역을 이미징하는 것은 매우 어려운 것이다. 인큐베이터 내에서 자동화 된 시스템을 사용함으로써, 건강하게 유지할 수있다티슈는 더 시점에서 영상을 수집하고 동일한 영역이 매 프레임에서 캡처되도록. 최근에는 여러 개의 집적 현미경 조직 인큐베이터가 개발되어 임상 적으로 이들 9뿐만 아니라 줄기 세포 연구 및 암 (10,11)에서뿐만 아니라 유용했을. 여기에서 우리는 배아 마우스 와우 외식의 장기간의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시한다. 우리가 설정된 시점에서 다중 샘플의 이미지를 캡쳐하기위한 능력을 가진 표준 CO 2 인큐베이터 안에 자동화 현미경 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인큐베이터 안에 설정 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 샘플은 각 시점에서 다중 샘플의 이미징을 허용 회전 단상에 위치한다. 조명, 촬영, 및 연단의 회전 MetaMorph로부터 소프트웨어를 통해 운영 시스템에 의해 자동 제어된다. 운영 소프트웨어를 이용하여 촬상 루틴을 설정함으로써, 우리는 TW까지 동안 작동 실험을 설정할 수간섭을 최소한으로 줄이고 O 주. 이 예에서 우리는 특별히 큰 규모의 성장과 달팽이관의 재 배열하고, prosensory 영역을 보여 모두 시야 및 형광을 사용합니다. 이 실험에서, cochleae는. 배아 일 E13에 SOX2 EGFP 리포터 생쥐 해부한다 체외 배양이 설정됩니다 다음 오일을 통해 몇 군데.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 수정된 독수리 미디어</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>여러 브랜드가 이</td></tr><tr><td>베이스먼트 멤브레인 추출물을 제조합니다&nbsp;</td><td>코닝</td><td>354230</td><td>마트리겔. 다른 공급 업체에서 유사한 대체 제품을 구할 수 있습니다 . http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29 |세포외+매트릭스+단백질+ECM+및+부착+요인%28생명과학%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>여러 브랜드에서 제조 this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>여러 브랜드가 이것을 제조합니다 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>Hank의 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>여러 브랜드가 이것을 제조합니다. 사용 전에 다시 수정해야 합니다. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>크기 번호 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29</td></tr><tr><td>큐렛&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>크기 1 mm&nbsp; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118</td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>26001-35</td>는 <td>스테인리스 스틸이어야 합니다 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50mm 플라스틱 접시</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>여러 브랜드가 이</td></tr><tr><td>숯을</td> 제조합니다. 시<td>그마 알드리치</td><td>05105-250G</td><td>여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>184 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow/Corning&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>접시는 몇 주 전에 집에서 만듭니다.&nbsp; 실리콘 엘라스토머는 모든 공급업체에서 제공할 수 있습니다.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>접시의 치수는 이미징 시스템의 사양에 따라 결정됩니다.&nbsp; 직경 35mm, 10mm 웰, 번호 0 커버 슬립은 Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath = 1_4_15 & products_id=2</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&nbsp; Stemi 2000 모델. 여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>여러 브랜드가 유사한 품목을 제조합니다 http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>형광 실체현미경&nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>연락처 Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. 여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr> <tr><td>인큐베이터 현미경 + 이미징 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Co2 인큐베이터 내부에 밀봉 된 반전 마이크로 코프. 독점적인 Metamorpoh 이미징 소프트웨어가 있는 Vivaview FL 인큐베이터 현미경. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0</td></tr><tr><td>클린 벤치</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조 http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>여러 브랜드에서 유사한 품목을 제조합니다 http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

마우스 인공 와우의 explants의 장기 시간 경과 영상

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 ​​약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.

여기에서 우리는 몽타주 (그림 1)과 E13.5에 도금하는 경우 일반의 Organotypic 인공 절편이 성장하는 방법을 보여주는 동영상 (그림 2)를 보여줍니다. SOX2 리포터 마우스 prosensory 영역을 시각화하는데 사용되었다. 영화는 달팽이관이 성장과 통합 및 확장을 겪는 것으로 보여, 녹색 SOX2 도메인의 측면 지역에서 세포는 확장 주변 조직으로 분할하지 않는 것. 이 코르티 기관의 특성; E13에 미래 감각 상피 세포주기를 종료하고 이후 비확산 (13)의 영역으로 알려져있다. 다른 인공 이식편의 중간베이스 (도 3 및 4)의 연장으로서, prosensory 영역이 좁아 것을 증명 중심 초 저속 실험. 배양 세 일 후에 조직이 개성 미친를 시각화 할 수 있다는 등의 상당히 평평 것을 유의이중 형광 세포, 처음에 의한 조직 두께 광의 내부 반...

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

이 절차의 전반적인 목표는 5일 동안 30분 간격으로 형광 리포터 마우스에서 채취한 배아 달팽이관을 이미지화하는 것입니다. 이것은 형광 리포터 마우스에서 배아 13일차 달팽이관을 먼저 채취하여 수행됩니다. 다음으로, 달팽이관을 체외에서 배양합니다.그런 다음 인공와우 엑스플랜 배양물을 인큐베이터 현미경에 넣습니다. 마지막으로, 자동 이미징 루틴이 설정되고 달팽이관 E가 이미징됩니다. 궁극적으로, 인공와우 배양에 대한 장기 타임 랩스 이미징을 사용하여 달팽이관 상피 전체의 형태발생학적 움직임뿐만 아니라 시간 경과에 따른 리포터 유전자 발현의 변화 및 느리게 작용하는 약리학적 제제의 영향을 보여줄 수 있습니다.일정 시간 경과에 걸쳐 X 펀드 문화를 수동으로 촬영하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 시스템이 완전히 자동화되어 있다는 것입니다. 이를 통해 더 많은 시점을 수집할 수 있으며, 달팽이관 또는 세포 집합의 동일한 영역이 불규칙 조직 배양 인큐베이터에서 성장하는 동안 모든 시점에서 동일한 방향으로 이미지화되도록 합니다. 동봉된 텍스트 프로토콜에 따라 KO의 변형된 독수리 배지 또는 DMEM 및 Hank의 균형 소금 용액 또는 HBSS를 보충한 후.층류 후드 아래에서 5 밀리리터의 unsu 보충 DMEM을 사용하여 200 마이크로 리터의 기저 멤브레인 기질 피펫 150 마이크로 리터를 35 밀리미터 직경의 유리 바닥 배양 접시의 각 10 밀리미터 웰 중앙으로 재현 탁합니다. 섭씨 35도의 CO2 인큐베이터에서 40분 동안 배양합니다. 워크스테이션과 도구를 준비하려면 층류 클린 벤치를 켜고 70% 에탄올을 사용하여 스프레이하고 집게, 숟가락 및 검은색 실리콘 코팅 접시를 담그십시오.깨끗한 작업장에서 얼음에서 적절한 임신 배아를 채취합니다. Cold HBSS에 1% 힙이 추가되었습니다. 형광 실체 현미경을 사용하여 외부 또는 가시 기관 내에서 리포터 활동을 보이는 배아를 식별하고 시원한 광원과 미세한 겸자를 사용하여 측두골을 채취하기 위해 1% 힙이 있는 신선하고 차가운 HBSS로 이식합니다.경추와 턱 아래를 빠르게 잘라 머리를 모으십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 배아 머리를 채취한 후 두개골을 조심스럽게 연 다음 머리 앞쪽의 뇌 부분을 제거하고 뒤쪽 두개골을 신선한 얼음이 담긴 접시에 옮깁니다. 감기. HBSS 더미는 전정계가 손상되지 않도록 주의하면서 땅콩 모양의 측두골을 조심스럽게 해부합니다.달팽이관을 해부하려면 측두골을 얼음처럼 차가운 HBSS 더미에 담긴 검은색 실리콘 엘라스토머로 코팅된 접시에 옮깁니다. 측두골을 안정시키고 겸자를 위한 공간을 만들기 위해 비스듬한 각도로 핀을 삽입하여 뼈의 전정 영역을 고정합니다. 다음으로, 달팽이관 기저부의 바깥쪽 가장자리에 있는 연골에 집게를 한 개 삽입하고 연골에 구멍을 뚫어 달팽이관 주위의 연골을 조심스럽게 제거합니다.상단을 가로질러 수평으로 클립하고 캡슐의 앞부분을 대각선으로 조심스럽게 들어 올립니다. 남은 연골과 관 사이에 집게의 갈래를 삽입하고 남은 연골을 부드럽게 잘라냅니다. 이제 달팽이관의 정점 표면이 노출되었습니다.바닥에서 시작하여 관의 지붕이 달팽이관 상피와 만나는 부분을 잡고 달팽이관 관을 엽니다. 완전히 제거될 때까지 필요한 경우 지붕 트리밍을 부드럽게 떼어냅니다. 관의 내측에 남아 있는 멤브레인의 모든 부분을 잘라냅니다.그런 다음 과도한 중간엽 조직의 관을 청소하고 전정계에서 관을 분리하여 임플란트를 배양합니다. 기판으로 코팅된 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 하나의 발광 표면을 놓습니다. 조심스럽게 액체를 빼내고 2분 동안 그대로 두십시오.그런 다음 드롭와이즈. 150마이크로리터의 보충된 DMEM을 X 엑스플란에 추가하고, 기판에 침전될 수 있도록 DMEM을 방해하지 않도록 주의합니다. 유리 바닥 접시를 직경 12cm 깊이의 페트리 접시에 소독수가 담긴 작은 접시와 함께 넣어 습도를 유지합니다.배양물을 섭씨 35도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣어 엑스플랜이 기질에 부착되고 평평하게 하여 라이브 이미징을 수행할 수 있도록 합니다. 샘플을 선택한 후 형광 실체 현미경을 사용하여 이식된 각 달팽이관의 상태를 평가하고, 덕트가 손상되지 않고 기저부에서 정점까지 유리에 부착된 이식물만 선택합니다. 인큐베이터를 섭씨 35도로 설정하고 5%CO2를 배양합니다.달팽이관 조직은 배양물에서 보충된 DMEM을 부드럽게 흡인하고 최소 500마이크로리터의 새로운 배지로 대체합니다. 엑스플란이 느슨하게 부착된 경우, 접시 가장자리 주위에 매체 고리를 피펫으로 만듭니다. 이 여분의 액체는 매트릭스에 계속 부착되는 동안 엑스플란을 방해하지 않고 소형 가습 챔버를 만듭니다.이 예제의 현미경에는 층류 후드 아래에 8개의 35mm 샘플 접시를 고정하는 회전 플랫폼이 있습니다. 플라스틱 뚜껑을 유리 뚜껑으로 교체하고 접시를 s에 삽입하십시오.amp르 식기 홀더. 실험 과정에서 매체를 교체해야 하는 경우.엑스플랜을 방해하지 않으려면 접시가 현미경에 피팅된 상태로 있는 동안 뚜껑을 열 수 있는 힌지 접시 덮개를 사용하고, 접시 홀더를 인큐베이터 현미경 내부에 놓고 접시 바닥에서 접시를 빼내거나 매체를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이미징 루틴을 설정하려면 현미경 UV 램프와 카메라를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 찾은 각 샘플에 대해 시작 시 엑스플랜의 시야뿐만 아니라 실행 과정에서 조직이 어떻게 이동하는지도 염두에 두고 초점과 노출의 이미징 영역 평면을 선택합니다.형광 채널에서 선택한 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 그런 다음 실험에 대한 샘플링의 빈도와 길이를 설정합니다. 이는 타임랩스 기간이 끝날 때 동영상을 생성하기 위해 이미지를 수집하는 데 걸리는 시간으로 제한됩니다.METAMORPH와 같은 소프트웨어를 사용하여 샘플 프레임의 이미지 파일을 엽니다. 관심 있는 세포 집단을 표시하기 위한 최상의 초점면을 선택합니다. 마지막으로, 이미지를 도트 VI 파일로 변환하거나 몽타주로 내보내 이미지 처리 소프트웨어에서 열고 분석하거나 다른 형식으로 변환할 수 있는 이미지 세트를 생성합니다.여기에 표시된 것은 플레이팅하면 유기형 달팽이관 익스플플랜이 어떻게 성장하는지 보여주는 영화입니다. E 13.5에서는 SOX 2 리포터 마우스를 사용하여 비감각 영역의 세포가 분열하고 이동할 때 녹색으로 보이는 프로 감각 영역을 시각화했습니다. 녹색의 비증식성 감각 영역은 조직 재배열과 수렴 확장 운동을 겪습니다.다른 달팽이관 엑스플랜의 중간 기저부를 중심으로 한 두 번째 타임 랩스 실험은 장점을 확장함에 따라 이를 보여줍니다. 감각 영역은 배양에서 처음 접어들 때 좁아집니다. 조직 두께는 발현 영역을 식별할 수 있지만 개별 세포는 식별할 수 없습니다.그러나 배양 3일 후 조직이 상당히 평평해져 이 절차에 따라 개별 형광 세포를 시각화할 수 있습니다. 분자 수준에서 유전자 발현의 변화를 평가하기 위해 면역형광 염색 또는 단백질 및 RNA 추출과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 달팽이관을 절개하고 배양하는 방법과 인큐베이터 현미경을 사용하여 며칠 동안 전체 엑스플랜에서 라이브 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 내이에서 나선신경절 외식부위를 분리하고 다전극 어레이에서 코르티 기관과 함께 배양하는 과정을 보여줍니다. 나선신경절(spiral ganglia)은 조심스럽게 추출되어 더 작은 조직 절편 또는 외식부로 절편화됩니다. 이러한 외식은 다전극 어레이의 활성 영역에서 배양되어 신경 세포 프로세스 성장을 촉진합니다.

Culturing Murine Spiral Ganglion Neuron Explants on Multielectrode Arrays(다전극 어레이에 대한 쥐 나선형 신경절 뉴런 배양

출처: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. 유전적으로 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노 관련 바이러스 라벨링을 사용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 살아있는 쥐 망막 외식식물에서 수지상 역학을 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 망막을 안정화하고, 별이 터진 무축삭 중간뉴런을 시각화하기 위해 에피형광 이미징을 수행하고, 무축삭 수지상 형태의 변화를 모니터링하기 위해 타임랩스 3D 이미지를 캡처하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.

마우스 달팽이관의 특정 주파수 영역에서 리본 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

배우세요 형광 리포터 마우스의 태아 내이 explant를 5일간 30분 간격으로 장기 시간 경과 영상 촬영하는 방법을. 이 기법은 형태 발생 운동과 유전자 발현 변화를 관찰하여 청각 발달 및 난청 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

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