마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

이 절차의 전반적인 목표는 5일 동안 30분 간격으로 형광 리포터 마우스에서 채취한 배아 달팽이관을 이미지화하는 것입니다. 이것은 형광 리포터 마우스에서 배아 13일차 달팽이관을 먼저 채취하여 수행됩니다. 다음으로, 달팽이관을 체외에서 배양합니다.

그런 다음 인공와우 엑스플랜 배양물을 인큐베이터 현미경에 넣습니다. 마지막으로, 자동 이미징 루틴이 설정되고 달팽이관 E가 이미징됩니다. 궁극적으로, 인공와우 배양에 대한 장기 타임 랩스 이미징을 사용하여 달팽이관 상피 전체의 형태발생학적 움직임뿐만 아니라 시간 경과에 따른 리포터 유전자 발현의 변화 및 느리게 작용하는 약리학적 제제의 영향을 보여줄 수 있습니다.

일정 시간 경과에 걸쳐 X 펀드 문화를 수동으로 촬영하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 시스템이 완전히 자동화되어 있다는 것입니다. 이를 통해 더 많은 시점을 수집할 수 있으며, 달팽이관 또는 세포 집합의 동일한 영역이 불규칙 조직 배양 인큐베이터에서 성장하는 동안 모든 시점에서 동일한 방향으로 이미지화되도록 합니다. 동봉된 텍스트 프로토콜에 따라 KO의 변형된 독수리 배지 또는 DMEM 및 Hank의 균형 소금 용액 또는 HBSS를 보충한 후.

층류 후드 아래에서 5 밀리리터의 unsu 보충 DMEM을 사용하여 200 마이크로 리터의 기저 멤브레인 기질 피펫 150 마이크로 리터를 35 밀리미터 직경의 유리 바닥 배양 접시의 각 10 밀리미터 웰 중앙으로 재현 탁합니다. 섭씨 35도의 CO2 인큐베이터에서 40분 동안 배양합니다. 워크스테이션과 도구를 준비하려면 층류 클린 벤치를 켜고 70% 에탄올을 사용하여 스프레이하고 집게, 숟가락 및 검은색 실리콘 코팅 접시를 담그십시오.

깨끗한 작업장에서 얼음에서 적절한 임신 배아를 채취합니다. Cold HBSS에 1% 힙이 추가되었습니다. 형광 실체 현미경을 사용하여 외부 또는 가시 기관 내에서 리포터 활동을 보이는 배아를 식별하고 시원한 광원과 미세한 겸자를 사용하여 측두골을 채취하기 위해 1% 힙이 있는 신선하고 차가운 HBSS로 이식합니다.

경추와 턱 아래를 빠르게 잘라 머리를 모으십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 배아 머리를 채취한 후 두개골을 조심스럽게 연 다음 머리 앞쪽의 뇌 부분을 제거하고 뒤쪽 두개골을 신선한 얼음이 담긴 접시에 옮깁니다. 감기. HBSS 더미는 전정계가 손상되지 않도록 주의하면서 땅콩 모양의 측두골을 조심스럽게 해부합니다.

달팽이관을 해부하려면 측두골을 얼음처럼 차가운 HBSS 더미에 담긴 검은색 실리콘 엘라스토머로 코팅된 접시에 옮깁니다. 측두골을 안정시키고 겸자를 위한 공간을 만들기 위해 비스듬한 각도로 핀을 삽입하여 뼈의 전정 영역을 고정합니다. 다음으로, 달팽이관 기저부의 바깥쪽 가장자리에 있는 연골에 집게를 한 개 삽입하고 연골에 구멍을 뚫어 달팽이관 주위의 연골을 조심스럽게 제거합니다.

상단을 가로질러 수평으로 클립하고 캡슐의 앞부분을 대각선으로 조심스럽게 들어 올립니다. 남은 연골과 관 사이에 집게의 갈래를 삽입하고 남은 연골을 부드럽게 잘라냅니다. 이제 달팽이관의 정점 표면이 노출되었습니다.

바닥에서 시작하여 관의 지붕이 달팽이관 상피와 만나는 부분을 잡고 달팽이관 관을 엽니다. 완전히 제거될 때까지 필요한 경우 지붕 트리밍을 부드럽게 떼어냅니다. 관의 내측에 남아 있는 멤브레인의 모든 부분을 잘라냅니다.

그런 다음 과도한 중간엽 조직의 관을 청소하고 전정계에서 관을 분리하여 임플란트를 배양합니다. 기판으로 코팅된 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 하나의 발광 표면을 놓습니다. 조심스럽게 액체를 빼내고 2분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 드롭와이즈. 150마이크로리터의 보충된 DMEM을 X 엑스플란에 추가하고, 기판에 침전될 수 있도록 DMEM을 방해하지 않도록 주의합니다. 유리 바닥 접시를 직경 12cm 깊이의 페트리 접시에 소독수가 담긴 작은 접시와 함께 넣어 습도를 유지합니다.

배양물을 섭씨 35도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣어 엑스플랜이 기질에 부착되고 평평하게 하여 라이브 이미징을 수행할 수 있도록 합니다. 샘플을 선택한 후 형광 실체 현미경을 사용하여 이식된 각 달팽이관의 상태를 평가하고, 덕트가 손상되지 않고 기저부에서 정점까지 유리에 부착된 이식물만 선택합니다. 인큐베이터를 섭씨 35도로 설정하고 5%CO2를 배양합니다.

달팽이관 조직은 배양물에서 보충된 DMEM을 부드럽게 흡인하고 최소 500마이크로리터의 새로운 배지로 대체합니다. 엑스플란이 느슨하게 부착된 경우, 접시 가장자리 주위에 매체 고리를 피펫으로 만듭니다. 이 여분의 액체는 매트릭스에 계속 부착되는 동안 엑스플란을 방해하지 않고 소형 가습 챔버를 만듭니다.

이 예제의 현미경에는 층류 후드 아래에 8개의 35mm 샘플 접시를 고정하는 회전 플랫폼이 있습니다. 플라스틱 뚜껑을 유리 뚜껑으로 교체하고 접시를 s에 삽입하십시오.amp르 식기 홀더. 실험 과정에서 매체를 교체해야 하는 경우.

엑스플랜을 방해하지 않으려면 접시가 현미경에 피팅된 상태로 있는 동안 뚜껑을 열 수 있는 힌지 접시 덮개를 사용하고, 접시 홀더를 인큐베이터 현미경 내부에 놓고 접시 바닥에서 접시를 빼내거나 매체를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이미징 루틴을 설정하려면 현미경 UV 램프와 카메라를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 찾은 각 샘플에 대해 시작 시 엑스플랜의 시야뿐만 아니라 실행 과정에서 조직이 어떻게 이동하는지도 염두에 두고 초점과 노출의 이미징 영역 평면을 선택합니다.

형광 채널에서 선택한 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 그런 다음 실험에 대한 샘플링의 빈도와 길이를 설정합니다. 이는 타임랩스 기간이 끝날 때 동영상을 생성하기 위해 이미지를 수집하는 데 걸리는 시간으로 제한됩니다.

METAMORPH와 같은 소프트웨어를 사용하여 샘플 프레임의 이미지 파일을 엽니다. 관심 있는 세포 집단을 표시하기 위한 최상의 초점면을 선택합니다. 마지막으로, 이미지를 도트 VI 파일로 변환하거나 몽타주로 내보내 이미지 처리 소프트웨어에서 열고 분석하거나 다른 형식으로 변환할 수 있는 이미지 세트를 생성합니다.

여기에 표시된 것은 플레이팅하면 유기형 달팽이관 익스플플랜이 어떻게 성장하는지 보여주는 영화입니다. E 13.5에서는 SOX 2 리포터 마우스를 사용하여 비감각 영역의 세포가 분열하고 이동할 때 녹색으로 보이는 프로 감각 영역을 시각화했습니다. 녹색의 비증식성 감각 영역은 조직 재배열과 수렴 확장 운동을 겪습니다.

다른 달팽이관 엑스플랜의 중간 기저부를 중심으로 한 두 번째 타임 랩스 실험은 장점을 확장함에 따라 이를 보여줍니다. 감각 영역은 배양에서 처음 접어들 때 좁아집니다. 조직 두께는 발현 영역을 식별할 수 있지만 개별 세포는 식별할 수 없습니다.

그러나 배양 3일 후 조직이 상당히 평평해져 이 절차에 따라 개별 형광 세포를 시각화할 수 있습니다. 분자 수준에서 유전자 발현의 변화를 평가하기 위해 면역형광 염색 또는 단백질 및 RNA 추출과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 달팽이관을 절개하고 배양하는 방법과 인큐베이터 현미경을 사용하여 며칠 동안 전체 엑스플랜에서 라이브 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.