February 23rd, 2015
자가조립 펩타이드(SAP)와 신경전구세포(NPC)를 성장 인자와 함께 사용하여 경추 척수 손상을 치료하는 것은 재생과 회복을 촉진하는 유망한 접근 방식입니다. 경추 SCI의 타박상/압박 동맥류 클립 랫 모델과 수액 주입 및 NPC 이식을 포함하는 복합 치료가 확립되었습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 쥐에서 경추 SCI의 타박상 압박 클립 모델과 SAP 주사 및 NPC 이식을 포함하는 복합 치료를 위한 프로토콜을 도입하는 것입니다. 먼저 척수 주위에 동맥류 클립을 삽입하고 1분 동안 제자리에 고정합니다. 이로 인해 양측 타박상 압박 부상이 발생합니다.
다음으로, 부상 진원지에 SAP를 주입하고, NPC는 SAP 주입 직후에 주입합니다. 성장 인자의 지속적인 전달을 위해 경막하 카테터가 있는 삼투압 펌프가 삽입됩니다. 이 절차는 손상된 척수에 NPC를 전달하는 결과를 낳습니다.
NPC의 생존과 생착은 SAP와 성장 인자를 이용한 조합 처리에 의해 뒷받침됩니다. 이 기술의 의미는 척수 재생을 촉진하는 세포 기반 COMBINATOR 요법을 연구하는 데 사용할 수 있는 임상적으로 관련된 모델을 제공하기 때문에 외상성 척수 손상 치료법으로 확장됩니다. 다음 실험 프로토콜은 캐나다 토론토에 있는 University Health Network의 동물 관리 위원회에 의해 승인되었으며, 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council of Animal Care)에서 준비한 실험 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide to the care and use of experimental animals)에 설정된 정책을 따릅니다.
모든 수술은 멸균 장비 및 용액을 사용하여 멸균 상태에서 수행되어야 하며, 기관 및 정부 지침에 따라 이 절차는 절차를 시작하기 전에 250-270g의 쥐를 사용합니다. 시술 당일 이틀 동안 식수에 항생제를 넣어 동물에게 투여합니다. 쥐를 마취실에 넣고 1 분 동안 1 대 1 산소와 아산화질소에 5 % ISO 불소를 마취를 유도 한 후 ISO 불소를 1.8에서 2.2 %로 낮추고 양연고를 눈에 바르고 발 꼬집기를 수행하여 외과적 마취를 확인합니다.
그런 다음 쥐를 가열된 쿠션에 놓고 노즈 콘이 있는 입체 프레임에 머리를 고정합니다. 경추 주위의 털을 면도한 후 포비돈 요오드를 면봉으로 닦아 피부를 소독한 후 C 2 경추 부위에서 T 2 흉추체의 두드러진 돌기까지 정중선을 절개한 후 에탄올 70%를 투여합니다. 수술용 가위를 사용하여 두개골 코들 방향으로 정중선에 있는 척추 근육의 바깥층을 직접 절단하고, 수술용 가위를 사용하여 processis, osis 및 laminate에 도달할 때까지 더 깊은 근육층을 무디게 절
개합니다.각도기를 삽입하고 유지합니다. 근육층을 연 다음 T 두 척추체의 두드러진 processis posis의 방향을 지정하고 후판 절제술의 목표 수준을 식별합니다. 그런 다음 숫자 15 메스를 사용하여 인대를 잘라 이마를 풀고 이마를 풀어줍니다.
다음으로, 뼈깎기를 사용하여 척수 측면의 층막을 절단하고 척수를 압박하지 않고 층근을 부드럽게 제거합니다. 이제 잠시 시간을 내어 새로 떠오르는 신경근을 식별하여 잘리는 것을 방지합니다. 그런 다음 고리를 사용하여 척추체의 등쪽 쪽에서 복부 경막을 풀고 클립을 위한 복도를 준비합니다.
클립의 링 스프링이 원하는 힘을 전달하도록 설정되어 있는지 확인하십시오. 클립 힘은 외상과 압박의 정도를 결정합니다. 열린 클립을 척수 주위에 삽입하고 딸깍 소리를 내며 닫아 타박상 부상을 유발합니다.
15-35g의 클립력은 척수 손상이 수행된 후 1분의 예치질 지속 시간으로 자주 사용됩니다. 클립을 제거하고 근육을 두 겹으로 닫은 다음 피부를 닫습니다. 상처가 제대로 봉합되면 마취를 멈추고 쥐가 깨어나는 동안 관찰하십시오.
동물이 흉골을 위한 충분한 의식을 회복한 후 누운 후 쥐를 깨끗한 우리에 넣습니다. 이러한 유형의 부상은 심각하기 때문에 다음과 같은 수술 후 치료를 따르는 것이 필수적입니다. 먼저 증상에 따라 3일에서 5일 동안 부프레노르핀, 멜록시캄 등의 진통제를 투여
해야 합니다.또한 피하로 탈수를 예방하십시오. 3일 동안 하루에 두 번 5-10ml의 식염수를 주입하고 5일 동안 식수에 항생제를 계속 제공합니다. 수술 후. 동물이 회복된 것처럼 보인 후에도 방광 기능의 지속적인 회복이 명백해질 때까지 하루에 2-3회 방광을 짜십시오.
수술한 동물의 신경학적 결손 및 생리적 상태에 대해 반드시 관찰하십시오. 주사는 척수 손상 후 14일 후에 시행합니다. 수술을 시작하기 전에 멸균수에 부피당 1중량의 농도로 SAP를 준비하고 Hamilton 주사기에 부착된 100마이크로미터 유리 모세관을 채웁니다.
용액을 사용하여 Hamilton 주사기를 입위 액자에 부착합니다. 마취 후 쥐는 정위 안경테에 머리를 고정하고 포비돈 요오드와 70% 알코올로 수술 부위를 소독합니다. 이전과 마찬가지로 다시 한 번 피부를 연 후 한 쌍의 척추 근육을 조심스럽게 절개하고 견인기를 삽입합니다.
숫자 15 메스를 사용하여 경막에서 흉터 조직을 제거하고 병변 부위를 다시 노출시킵니다. 그런 다음 날카로운 바늘 끝을 사용하여 경막을 조심스럽게 엽니다. 마지막으로, 입위 전술적으로 유리 모세혈관을 외상된 척수에 2mm 깊이로 삽입하고 SAP를 주입합니다.
SAP를 주입한 후 모세혈관을 제거하기 전에 1분 동안 주사 부위에 남아 있도록 하여 조직이 주입된 용액을 수용할 수 있도록 합니다. 그런 다음 다음 부위에서 주입을 반복합니다. 여기서 NPC는 성인 DS 붉은 쥐의 주심실 영역에서 분리되어 이전에 발표된 절차에 따라 배양되었습니다.
마이크로 주입 직전에 세포 이식을 위해 성장 배지의 NPC를 50배의 농도로 10배로 10씩 마이크로리터당 세 번째 살아있는 세포로 희석하고 Hamilton 주사기의 유리 모세관에 로드합니다. NPC는 SAP 주입 직후에 주입됩니다. 이렇게 하려면 해밀턴 주사기의 유리 모세혈관을 부상 부위에서 0.2mm 지점, 척수 등쪽 표면에서 1.5mm 아래에 삽입합니다.
2마이크로리터의 세포 현탁액을 분당 약 0.5마이크로리터의 속도로 주입합니다. 첫 번째 주입이 완료된 후 이전과 같이 모세혈관을 척수에 1분 동안 그대로 두었다가 모세혈관을 집어넣고 인접한 부위로 이동한 다음 주입 절차를 반복합니다. 1분 정도 기다린 후 이전과 같이 모세혈관을 집어넣고 부상 부위로 2mm 움직입니다.
이 위치에서 2개의 마이크로리터 주입을 두 번 수행합니다. 이 이미지는 척수 손상과 관련된 모든 주사 부위를 보여줍니다. 성장 인자 지원을 위한 경막하 미니 삼투압 펌프의 이식은 NPC 주입 직후에 수행됩니다.
먼저 이식 부위를 선택합니다. 선호되는 부위는 펌프 자체로 인한 불편함을 피하기 위해 흉복부 부위의 측면 측면입니다. 이전과 같이 해당 부위를 소독한 후 펌프를 위한 피하 홈을 준비합니다.
다음으로, 척수 손상에 인접한 상부 또는 하부 척추의 스킵 후판 절제술을 수행합니다. 여기서, 척수 손상은 C 7 T 1에서 시행되었으므로, 후판 절제술은 C 5에서 시행됩니다. 이제 펌프를 피하 오목한 곳에 삽입한 다음 카테터를 필요한 길이로 자르고 마지막으로 6.0 봉합사를 사용하여 한 쌍의 척추 근육에 고정합니다.
탈구와 관련된 움직임을 피합니다. 날카로운 바늘 끝을 사용하여 후판 절제술 아래의 경막을 엽니다. 그런 다음 카테터를 경막하 공간에 삽입하고 저항하지 않고 탯줄을 손상시키지 않고 코들 방향으로 미끄러지도록 합니다.
이제 카테터가 원활하게 작동하고 여기에 표시된 것처럼 꼬임이나 접힘이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 봉합사나 클립을 사용하여 근육을 층별로 닫은 다음 피부를 닫습니다. 상처가 제대로 봉합되면 마취를 멈추고 동물이 깨어나는 동안 관찰합니다.
동물이 흉골 누워있을 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복한 후 쥐를 깨끗한 우리에 넣습니다. 동물 모니터링 및 수술 후 진통제를 포함한 모든 수술 후 치료 절차를 따르십시오. NPC 주사 2일 전과 이식 후 7일까지, 그리고 희생할 때까지 각각 면역억제 치료를 시행합니다.
이 형광 현미경 이미지는 쥐의 외상을 입은 척수의 세로 부분을 보여줍니다. 염색은 QL six로 표지된 DPI 형광 SAP입니다. Fite는 녹색으로 나타나고 병변의 진원지에 응집되어 있습니다.
주입된 DS 적색 양성 NPC는 적색 형광으로 표시된 주부와 코들 방향으로 확산되었습니다. 눈금 막대는 5mm를 나타냅니다. 여기서 주사 전자 현미경 이미지는 조립된 SAP의 나노 섬유 스캐폴드 형성을 보여줍니다.
눈금 막대는 1마이크로미터를 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 클립 압박, SCI와 관련된 수술 절차와 이 모델에서 SAP 및 NPC를 결합한 치료의 유망한 접근 방식을 연구할 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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본 연구는 척수 손상 치료를 위해 자기조립 펩타이드(SAP)와 신경 전구 세포(NPC)를 쥐 모델에 사용하는 방법을 제시합니다. 이 복합 치료법은 찰과/압박 손상 후 재생 및 회복을 향상시키는 것을 목표로 합니다.
This cervical spinal cord injury model provides a clinically relevant platform for evaluating combinatorial regenerative therapies, addressing a critical gap in preclinical SCI research where complete transection models poorly reflect human pathology. By integrating self-assembling peptides for cavity bridging and neural precursor cell transplantation with sustained growth factor delivery, the approach supports mechanistic de-risking of cell-based combinatorial strategies. The model enables target validation and predictive confidence assessment for therapies aimed at tissue regeneration and functional recovery in cervical SCI.
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early discovery, assay standardization in screening, and mechanistic de-risking in translational research before lead identification.