소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

이 절차의 전반적인 목표는 새로운 혈액 내피 챔버 분석을 사용하여 혈액과 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 개방 시스템 정맥 천자를 통해 건강한 지원자의 혈액을 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 내피 세포 배양 도금 슬라이드에 연결된 헤파린 표면으로 코팅된 혈액실에 혈액을 조심스럽게 층을 이룹니다.

다음으로, 이러한 혈액 내피 세포실은 혈액과 내피 세포 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 부드럽게 회전합니다. 궁극적으로, 혈액 세포와 내피 세포 간의 세포 간 상호 작용과 그에 따른 트롬빈 항트롬빈 복합체 생성은 각각 면역형광 현미경 검사와 Eliza로 평가할 수 있습니다. 동물 모델을 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 이점은 실험을 시작하기 전에 인간 모델 시스템을 사용하여 혈관 질환을 조사할 수 있다는 것입니다.

18 게이지 피하 주사 바늘을 헤파린 표면 코팅된 실리콘 튜브의 내경 2mm 조각에 연결합니다. 플라스틱 표면은 응고의 불특이적 활성화를 방지하기 위해 헤파린으로 코팅되어 있습니다. 예를 들어, 이 이미지에서는 코팅되지 않은 챔버에서 혈전이 명확하게 보입니다.

혈액 접촉 30분 후 챔버를 헤파린 표면으로 처리하면 제어되지 않은 활성화로부터 혈액을 보호하여 결과가 내피 세포 혈액 상호 작용에 기인하는지 확인합니다. 튜브를 연결한 후에만 50ml 헤파린 표면 코팅된 튜브에 개방형 시스템 정맥 천자를 통해 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 조심스럽게 수집합니다. 수집된 혈액에 분획되지 않은 헤파린을 보충하여 최종 농도인 밀리리터당 0.75IU에 도달하고 튜브를 두세 번 뒤집어 부드럽게 섞습니다.

초기 혈액 단백질 농도를 분석하기 위해 30마이크로리터의 10밀리몰 K 3 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 튜브당 1ml의 혈액을 조심스럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 헤파린 표면 코팅된 피펫 팁을 사용하여 1.5ml의 혈액을 헤파린 표면으로 코팅된 각 혈액 내피 세포실로 이동시키고, 혈액이 활성화되지 않도록 기포를 생성하지 않고 천천히 흐르도록 주의합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 내피 세포 배양 슬라이드에서 플라스틱 벽을 제거하고 내피 세포를 부드럽게 씻습니다.

PBS를 사용하면 배양물이 마르지 않도록 세포에서 세척된 물을 최대한 많이 이동시키고 세포가 혈액을 향하도록 혈액실 위에 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 추가 지지를 위해 플라스틱 슬라이드를 사용합니다. 세포 배양 슬라이드의 파손을 방지하려면 각 혈액 내피 세포실 주위에 클램프를 배치하여 슬라이드를 고정합니다.

이제 섭씨 37도의 수조에서 0.5Gs의 회전 휠로 챔버를 30분 동안 회전시킵니다. 회전 후 혈액 내피 세포실을 해체하고 PBS에서 세포 배양 슬라이드를 세척하고 세포를 얼음처럼 차가운 1% 파라알데히드에 10분 동안 고정합니다. 마지막으로, 활성화된 혈액 단백질 농도를 평가하기 위해 각 챔버에서 1ml의 혈액을 30마이크로리터의 0.34몰 K 3 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합하고 튜브를 최대 1시간 동안 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 세포를 회전시킨 후 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 영하 70도의 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 플라즈마를 보관합니다. 응고 인자의 활성화는 활성화된 인자 간의 상호 작용 확률이 증가함에 따라 정체된 혈액에서 발생할 가능성이 더 높습니다. 실제로, 기포에 의해 아무런 움직임이 없는 혈액의 양은 2.5배 더 많습니다.

1.5ml의 혈액을 사용할 때와 비교하여 1.75ml의 혈액을 챔버에 첨가하면 측정된 트롬빈 항트롬빈 값은 혈액량도 증가하면서 트롬빈 항트롬빈 형성이 증가함을 시사합니다. 흥미롭게도, ve가 두 부피의 전혈로 배양될 때, 두 그룹 간에 차이가 나타나지 않았는데, 이는 내피 세포가 백혈구 모집에 대한 TNF 알파의 효과를 연구하기 위해 응고의 활성화를 조절할 수 있음을 시사합니다. 이 실험에서, qve는 혈액 접촉 4시간 전에 TT NF 알파 밀리리터당 20나노그램으로 처리되었으며, 그 후 CD 16 양성 세포의 수를 정량화했습니다.

TNF 알파 처리로 CD 16 양성 세포의 동원은 100에서 256으로, 평방 밀리미터 및 1.5 리터의 혈액 당 16 개의 양성 세포로, 혈액의 경우 172 개에서 378 및 1.75 밀리리터로 크게 증가했습니다. 그런 다음 트롬빈 항트롬빈 복합체의 형성을 TNF 알파 처리 또는 처리되지 않은 세포와 함께 배양한 혈액의 해당 혈장 샘플에서 측정했습니다. 예상대로, TNF 알파 자극 세포는 개발 후 처리되지 않은 대조군에 비해 트롬빈 항트롬빈 복합체의 약 두 배를 유도했습니다.

이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 인간 일차 세포와 인간 전혈을 사용하여 체외 모델에서 탐구, 보완 및 응고할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.