공장에서 유체 Apoplastic의 추출을위한 침투-원심 분리 기술을 사용하여 잎 위 Phaseolus 심상 예를 들어

이 절차의 목표는 침투 원심분리 기술을 사용하여 식물 잎에서 재생 가능한 액체를 추출하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 잎을 침투 유체에 담그고 주사기 또는 진공 펌프를 사용하여 생성된 압력 차이를 사용하여 잎을 완전히 침투시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 지지 장치를 사용하여 원심분리할 잎을 준비하는 것입니다.

다음으로, 잎을 부드럽게 원심 분리하여 APO 플라스트 세척액을 얻습니다. 마지막 단계는 APO 플라스트 희석 계수를 결정하고 알라스트 세척액의 품질을 분석하는 것입니다. 궁극적으로 침투 원심분리 분석은 다양한 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 대표적인 APO 플라스트 샘플을 얻는 데 사용됩니다.

다른 기존 방법에 비해 이 기법의 주요 장점은 세포질 화합물에 대한 오염을 최소화하는 상위 플러스 샘플을 얻기 위해 다양한 잎 유형에 맞게 간단하게 최적화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 식물 생리학 및 식물 미생물 상호 작용과 같은 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, APL의 구성이 식물마다 어떻게 달라지고 다른 생리학적 조건이나 스트레스에 따라 어떻게 변화하는지 이해하는 것이 중요합니다. 첫 번째 단계로 실험복, 장갑 및 고글 규칙을 착용하여 안전 예방 조치를 취하십시오.

다음으로, 잎 샘플을 담글 수 있는 일정량의 증류수를 준비합니다. 이 경우 샘플을 수집 할 수있는 면도날을 준비하십시오.이 경우 콩 품종 부드러운 녹색의 잎. 면도날을 잎의 애완 동물에 대고 식물의 잎을 부착하십시오.

채집이 완료되면 갓 절제된 잎을 증류수에 담가 잎 표면 오염 물질을 제거합니다. 그런 다음 흡수성 티슈나 종이를 사용하여 잎이 부드럽게 건조되도록 막습니다. 침투를 진행하기 전에 잎의 무게를 측정하십시오.

이렇게 하면 나중에 침투량을 근사화하는 데 도움이 됩니다. 60ml 주사기로 침투 과정을 시작하십시오. 플런저를 제거한 상태에서 잎을 주사기에 조심스럽게 굴리거나 접습니다.

다음으로 주사기에 침투액을 채웁니다. 여기에서는 증류수가 사용되고 있습니다. 플런저를 삽입하고 주사기를 뒤집어 그 안의 공기를 배출합니다.

나중에 비교할 수 있도록 잎 색깔을 기록해 두십시오. 작은 파라 매개변수 조각을 사용하여 플런저를 40ml 표시로 이동합니다. 주사기 팁을 덮습니다.

그런 다음 플런저를 60밀리리터 표시로 당겨 음압을 생성합니다. 주사기를 뒤집어 잎 표면에서 기포를 방출합니다. 약 2초에 걸쳐 플런저를 시작 위치로 천천히 되돌립니다.

주사기 끝을 열고 공기를 배출합니다. 그런 다음 팁을 다시 덮고 플런저를 눌러 적당한 양의 양압을 생성합니다. 공기를 배출하는 음압을 계속 가하고 잎이 완전히 침투할 때까지 양압을 가합니다.

완전한 침투의 증거는 침투 부위의 어두운 색입니다. 이것이 보이면 주사기에서 잎을 제거하십시오. 흡수성 종이로 잎을 부드럽게 막아 표면 액체를 제거합니다.

그런 다음 침투 된 잎의 무게를 측정하고 대체 침투 방법은 진공 플라스크를 사용합니다. 다시 잎을 모아 증류수로 헹굽니다. 폭파하여 건조시킨 후 잎의 무게를 측정하십시오.

최소 용량이 250ml인 보조 무기 플라스크를 구하십시오. 플라스크에 잎을 넣고 증류수로 덮습니다. 그런 다음 플라스크에 스토퍼를 놓고 진공 펌프를 사이드암에 부착합니다.

압력에 도달할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 플라스크에 진공을 적용합니다. 약 650mm의 수은. 플라스크를 부드럽게 저어 압력을 낮추는 동안 잎에서 기포를 방출합니다.

그런 다음 약 10초 동안 조심스럽게 천천히 진공 청소기를 해제합니다. 진공을 적용하고, 플라스크를 교반하고, 잎이 완전히 침투할 때까지 진공을 해제하는 과정을 반복합니다. 완전한 침투의 증거는 침투 부위의 어두운 색입니다.

플라스크에서 완전히 침투한 잎을 제거하고 흡수성 종이로 잎을 부드럽게 닦아냅니다. 표면 액체를 제거하려면 침투된 잎의 무게를 측정하여 대략적인 침투량을 결정할 수 있습니다. 잎이 완전히 침투한 후 원심분리를 준비합니다.

4인치 너비의 파라 필름 조각을 배치합니다. 파라 필름에 잎을 놓습니다. 그런 다음 5ml 피펫 팁을 사용하여 파라 필름의 잎을 말아줍니다.

플런저를 제거한 20ml 주사기 본체를 잡고 피펫 팁으로 말아 올린 잎을 삽입합니다. 절단된 잎 가장자리를 플런저 끝을 향하도록 배치합니다. 50밀리리터 폴리에틸렌 또는 폴리카보네이트 튜브를 구하여 주사기를 삽입합니다.

스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기를 사용합니다. 침투한 잎이 들어있는 튜브와 섭씨 4도, 1000G의 원심분리기를 10분 동안 로드합니다. 원심분리 후 잎을 검사하여 대부분의 침투액이 배출되었는지 확인합니다.

원심분리기 튜브에는 이제 회수된 APO 플라스트 세척액이 포함되어 있으며, 회수된 알라스트 세척액을 새로운 1.5밀리리터 튜브에 피펫팅하여 계속합니다. APO 플라스트 세척액 샘플을 원심분리기에 넣고 15, 000G에서 5분 동안 회전시켜 세포나 미립자 물질을 제거합니다. 원심분리 후, supinate를 새 튜브에 피펫으로 넣습니다.

섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있을 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. APO 플랫 세척액의 품질을 평가하는 한 가지 방법은 APO 플랫 희석 계수를 계산하는 것입니다. 이렇게하려면 두 부피의 침투 유체 증류수를 준비하십시오.이 경우 각각 여러 침투를 한 부피로 수행하기에 충분합니다.

인디고 카민 분말을 최종 농도인 50마이크로몰에 추가합니다. 다른 것에 아무것도 추가하지 마십시오. 96웰 마이크로플레이트를 구하여 3개의 웰에 200마이크로리터의 침투 용액을 채웁니다.

인디고 카민을 사용하여 다른 3개를 200마이크로리터의 순수한 침투 용액으로 채우고 리더의 마이크로플레이트를 기반으로 하여 각 유체의 흡광도를 측정합니다. 610나노미터에서 인디고 카민이 있는 유체의 평균 흡광도에서 그렇지 않은 유체의 평균 흡수량을 뺀 값은 침투물의 수정된 흡광도를 제공합니다. 다음으로, 각 침투 용액에 대해 잎 침투 프로토콜을 세 번 복제합니다.

잎 샘플을 물에 담그십시오. 인디고 카민 침투 용액을 사용할 때 음압과 양압을 가하고, 침투 후 증류수로 잎을 헹구어 잎 표면에 남아 있는 인디고 카민을 제거합니다. 원심분리를 사용하여 마지막 세척액을 회수합니다.

마지막 세척액을 회수한 후 마이크로플레이트의 웰에 있는 플레이트 리더로 돌아갑니다. 인디고 카민 프리 추출의 각 200 마이크로 리터와 또한 각 인디고 카민 알라스트 세척 유체 추출의 200 마이크로 리터를 배치. 610나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정하여 보정된 흡광도를 얻습니다.

각 숫자 집합의 평균을 구하고 차이를 취합니다. 침투 물질의 보정된 흡광도와 재생 가능 세척 유체의 보정된 흡광도를 사용하여 APL 희석 계수를 측정하고 재생 가능 유체의 농도 또는 활성을 추정합니다. 임플란터는 마지막 세척액의 농도 또는 활성 값에 fasi vulgaris 품종에서 추출한 마지막 세척액을 희석 계수로 곱합니다.

이 가스 크로마토그래피 질량 스펙트럼 유기산을 생산하기 위해 부드러운 녹색이 사용되었습니다. 단당류(simple sugars)와 아미노산(amino acids)은 식별 가능한 대사 산물의 대부분을 차지합니다. 다음은 SDS 페이지, fasi vulgarus alast 세척 유체 잎 추출물의 Kumasi 얼룩 젤의 비교입니다.

추출은 세포질 오염의 양이 다릅니다. 이것은 석고 효소 루비스의 다른 양으로 관찰됩니다. 이 절차를 수행할 때 조직 손상이나 세포질 오염을 일으키지 않도록 최소한 가능한 한 부드럽게 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

단백질 또는 대사 산물 질량 분석법과 같은 다른 방법은 재생 가능 유체의 조성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행 할 수 있습니다. 재생 불량성 세척액은 또한 식물 조직에 서식하는 미생물에 대한 재생 불량성 화학 물질의 영향을 연구하기 위한 총 매체로 사용할 수 있습니다.