Name: 프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 학습하세요 형광 기반 PAD4 활성 측정법을 통해 펩티딜-아르기닌을 시트룰린으로 전환하는 효소 활성을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 질병 관련 PAD4 역할 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Lehigh University Start-up Package의 지원을 받았습니다. 단백질 발현을 위한 GST-PAD4 플라스미드를 제공해 주신 Walter Fast 박사님께 감사드립니다.

1. PAD4 변환, 발현, 및 정제 <ol><li> PAD4 변환의 경우, 화학적으로 유능한 E. PAD4의 GST 융합을 포함하는 플라스미드를 pGEX 변환 다음 절차를 사용하여 단백질 발현 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. 화학적 유능한 (염화 칼슘)를 준비 E. 표준 프로토콜에 따라 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. <ol><li> 미리 제조 한 화학적 유능한 BL21 (DE3) 세포를 얼음에 50㎕의 해동 및 5 ㎖의 배양 관에 PAD4 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGEX 1 μL와 혼합한다. 부드럽게 매 2 분 흔들어 섞으면 서 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열은 40 초 동안 42 ° C의 물을 용기에 혼합물을 배치하여 셀을 충격. 즉시 세포가 복구 할 수 있도록 2 분 동안 다시 얼음에 세포 플라스미드 혼합물을 배치합니다. 혼합물에 멸균 된 LB 액체 배지 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 1 250 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 세포 충격 열을 품어시간. 피펫 (75) 암피실린 내성 한천 접시에 형질 전환 세포의 μL, 15 시간 동안 37 ° C에서 품어. 4 ℃에서 보관 판. </li></ol></li><li> PAD4 식입니다. <ol><li> 1x를 앰피 실린을 함유하는 LB 5 ml의 암피실린 한천 플레이트와 장소에서 BL21 (DE3) 세포의 콜로니 하나를 선택. 인큐베이터에 넣어 37 ℃에서 O / N를 흔들. </li><li> 1x를 암피실린 수화물을 함유하는 멸균 LB (MW 403.45 g / mol)를 1 L로 LB (스타터)의 5 ml의 전송. 37 ° C 진탕 배양기에 넣어 성장. 성장의 OD (600)를 모니터링합니다. 성장 (600) 0.3의 OD에 도달하면, 인큐베이터을 흔들어 16 ° C로 성장 이동합니다. </li><li> OD 0.6 600 0.3 밀리미터 isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238.30 g / mol)을 가진 세포를 유도 도달하면. 세포가 16 ℃에서 15 시간 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 0 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. -80 ° C에서 상등액 및 저장 펠렛을 붓고. </li></ol></li><li> PAD4 정화 <ol><li> 다시 일시의 50 mM의 NaCl (MW 58.44 g / 몰)의 버퍼에 세포를 BL21 (DE3)에서 발현 PAD4 함유 펠렛을 300 mM의의 NaH 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol)을 10 mM의 이미 다졸 (MW 68.077 g / 몰), 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / 몰)의 pH = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 초음파 처리 후, 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리. 붓고 및 상층 액을 저장합니다. 일괄 RT에서 30 분 동안 글루타치온 (GSH), 아가 로스 비드와 상청. </li><li> 중력을 통해 GST 비즈 / 열에서 상층 액을 배출합니다. 실온에서 1X PBS (인산염 완충 식염수, pH는 8.0)의 4 × 25 ml로 구슬을 씻으십시오. </li><li> 용출 PAD4 2 × 10 ml의 용출 버퍼와, 50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / mol)을 10 mM의 글루타치온 (GSH, MW 307.32 g / 몰), pH가 8.0. </li><li> 10 만 MW 컷-O를 사용하여 PAD4을 집중FF 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에. -80 ° C에서 나누어지는 1.0 ml의 마이크로 원심 튜브에 200 μL의 볼륨으로 단백질 및 저장. </li></ol></li></ol> 버퍼 2. 준비 원액 <ol><li> 염화나트륨 (NaCl을, MW 58.44 g / 몰) 칭량하고 2 M 용액을 제조 하였다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / 몰) 밖으로 달아 = 8.0 2 M 용액의 pH를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염화칼슘 이수화 물 (CaCl2를 2H 2 O, MW 147.01 g / 몰) 칭량하고 500 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP, MW 250.19 g / 몰) 칭량하고 200 mM의 용액을 조제. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 디티 오 트레이 톨 (DTT, MW 154.25 g / 몰) 밖으로 무게와 1 M 용액을 제조. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 준비트리톤 X-100의 0.5 % 용액. </li><li> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, MW 292.24 g / 몰) 칭량하고 100 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염산염 (ZRcoum, MW 621.69 g / mol)의 methylcoumarin Z- Arg- Arg- 7- amido- 4-을 달아 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mM의 용액을 조제. </li></ol> 37 ° C에서 3 PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 염화칼슘 2, 6.25 mM의 DTT (PH = 8.0)의 버퍼를 준비합니다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 혼합하고 -20 ℃에 저장° C. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 96 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물의 수 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)를 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 160 μL에 솔루션 B의 160 μL. 37 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 피펫 (40) 모든 우물에 솔루션의 μL와 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어, 피펫 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션 D. 용액 10 μL의 다른 절반. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> RT 4. PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 50 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 50 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 나 버퍼를 준비CL, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100, 8 μM의 PAD4 (pH가 = 8.0). 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 취득 및 제어 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)에 대한 우물을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 25 μL에 솔루션 B의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 모든 우물에 솔루션 C의 피펫 25 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어의 다른 절반에 pipett실온에서 10 분 동안 솔루션 D. 품어의 전자 10 μL. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 37 ° C 및 실온에서 5 PAD4 시간 코스 분석 실험 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (얼마나 많은 시점에 따라 달라집니다 우물 #)이 96 웰 플레이트 및 피펫 우물 # 금액에 솔루션 B의 160 μl를 얻습니다. </li><li> 37 ° C에서 한 96 웰 플레이트를 품어. RT에서 다른 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 삐악 삐악 울다ette 즉시 (40) 모두 96 웰 플레이트의 모든 우물에 솔루션의 μL과는 t = 0 분 우물에 솔루션 C의 10 μl를 피펫. 모든 우물이 침묵 할 때까지 특정 시점에서 솔루션 C의 10 μl를 계속 추가합니다. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 실온에서 6 PAD4 저해 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 83 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 83 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 된 C1-아미 딘 (MW 424.8 g / 몰) 칭량하고 100 μM 스톡 용액을 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100의 완충액, 8 μM의 PAD4 (하여 pH = 8.0)을 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 목솔루션 D. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 E. 될 것입니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물 (NO PAD4), 시험 우물 (+ PAD4) 및 억제 우물 (PAD4 + CL-아미 딘)을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 D의 25 μL에 솔루션 C의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 억제의 우물에 솔루션 B의 피펫 10 μL 및 RTE에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 15 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 E의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 7. 원유 세포 용 해물 분석RT에서 <ol><li> 50 mM 트리스, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / mol)을, pH를 10 ㎖의 PAD4 1 L 성장에서 재현 탁 된 세포를 세포를 수확 한 후 = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리기. 10 만 MW 차단 원심 분리기 튜브를 사용하여 4 ° C에서 4,000 rpm으로 원심 분리하여 절반 볼륨에 맑은 상층 액을 집중한다. </li><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 250 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 250 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 블랙 384 웰 플레이트 및 설계를 얻컨트롤 (NO 세포 용 해물) 및 테스트 우물 (+ 세포 용 해물)에 대한 우물을 먹었다. </li><li> 피펫 시험의 우물에 모든 우물과 세포 용 해물의 피펫 60 μL에 B 액 100 ㎕. 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 40 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 C의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol>

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여기서, PAD4의 활성을 모니터링하는 형광 기반 분석이 성공적으로 개발되었다. 이 분석은 여러 고처리량 조건에서 믿을 수 없을 정도로 견고한 것으로 입증되었으며 전체 세포 용해물과도 호환됩니다37.
히스톤 단백질과 이를 둘러싼 DNA 가닥 사이의 친화력은 시트룰린화 시 아르기닌 측쇄의 양전하가 중화되기 때문에 느슨해집니다. 아르기닌 측쇄의 중화가 PAD4 활동을 모니터링하기 위해 유사하게 활용될 수 있다고 구상되었습니다. PAD4에 의한 아르기닌을 시트룰린으로 전환하면 트립신 매개 가수분해에 대한 감수성이 크게 감소할 것으로 예상됩니다. 트립신은 라이신과 아르기닌의 C-말단 아미드 결합을 가수분해하는 데 뚜렷한 선호도를 가지며, pH 범위 7.5에서 8.5 근처에서 최적의 활성을 보입니다. 따라서 모든 트립신 용액은 pH 7.5에서 제조되었고 모든 분석은 pH 8.0에서 수행되었습니다. 또한, 형광단 7-아미도-4-메틸쿠마린의 아르기닌 C-말단으로의 아세틸화...

포유 동물 단백질의 다수 무겁게 리보솜에 의한 단백질의 생합성 다음 효소의 작용에 의해 변성된다. 이러한 번역 후 변형 (PTMS)는 크게 단백질 1-3 (다른 기능 사이)의 크기, 전하, 구조 및 올리고머 상태를 변경하여 프로테옴의 기능적 다양성을 증가시킬 수있다. 그 결과, 단백질 구조의 변화는 단백질 분해, 세포 분화, 시그널링, 유전자 발현의 조절, 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 같은 생리 학적 결과로 이어질 수있다. 이러한 수정은 인간의 모든 단백질의 큰 비율에 널리 퍼져 있지만 히스톤 단백질이 공유 수정 4의 비정상적으로 높은 숫자를 받아야에 터미널이 종료됩니다. 히스톤 단백질은 게놈 DNA의 응축을 촉진 구조 단백질의 패밀리이다. 구조화되지 않은 히스톤 꼬리의 공유 수정 세리 의해 수행 및 규제, 잔류 (작가)의 공유 변형을 촉진 같은 수정 (지우개), 역 및 변경을 구별 할 수 효소의 S는 히스톤 꼬리 (독자) 5-7에 각인된다. 실제로, 공지 PTMS 대부분 메틸화, 인산화, 아세틸, sumoylation, 유비퀴틴 및 citrullination 8 포함한 히스톤이 짧은 세그먼트 내에서 관찰 할 수있다. Citrullination는 비 t의 RNA 부호화 펩 티딜 - 시트룰린 (도 1a)에 펩 티딜 - 아르기닌의 변환을 수반한다. 이 측쇄 중화에 책임 단백질, PAD의 구성원 칼슘 의존적 효소이다 모두. 9,10이 단백질 군 (p는 rginine d를 eiminase eptide)를. 현재까지, 패드 가족의 다섯 멤버는 (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 및 PAD6)를 설명 하였다. 이 가족의 각 구성원은 별개의 세포 단백질을 대상으로 나타나고 또한 유니 표시가야 조직 분포 프로필. PAD4 핵 지역화 시퀀스 (11)를 통해 핵 내에서 지역화 된 것으로 알려진이 단백질 가족의 유일한 구성원입니다. 따라서,이 히스톤의 H2A 아르기닌 잔기 (3)의 N 말단 꼬리에서 아르기닌 측쇄 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 및 H3R26) 및 H4 (H4R3) (12)를 포함하여 핵 대상 번호를 deiminate 것으로 밝혀졌다, 13. PAD 동위 효소의 각 특정 중요한 생리 기능을 가지고 있지만, PAD4 인해 병에 걸린와 건강한 세포 모두에서 인간의 프로세스의 수의 역할에 훨씬 더 많은 관심을 받고있다. 최근 PAD4가 능성 전사 네트워크 (14)의 구성원이 될 것으로 나타났다. 두 PAD4 발현 수준과 활성 마우스에서 리 프로그래밍 및 접지 상태 능성 상태 동안 상승되는 것으로 도시 하였다. 줄기 세포 유전자의 조절을 제어함으로써, PAD4 세포 리 프로그래밍 효율의 중추적 인 역할을 유지할 수있다. PAD4도에 연루되었는지에 병원균의 결합 호중구 세포 트랩의 형성은 자신의 시스템 정리를 할 수 있습니다. PAD4 의한 히스톤 단백질의 hypercitrullination 따라서 세균 감염 15,16 떨어져 병동, 트랩에 의한 세포 외 병원균의 캡슐화 용 기재로서 기능 염색질의 decondensation을 유도한다. 또한 PAD4 인간 질병의 수가 활성 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 것은 이미 PAD4의 비정상적 발현은 류마티스 관절염의 발병과 중증도와 연관되어 있음을 보여왔다, 알쯔하이머, ​​파킨슨 병 및 다발성 경화증 17. 실제로, 안티 - 시트룰린 단백질 항체의 존재는 류마티스 관절염 (18)의 가장 안전하고 확실한 진단 및 예후 바이오 마커이다. 마찬가지로, 조절 곤란 PAD4 활성은 최근 난소, 유방, 폐, 포함한 인간 암의 다수 관찰되었다D 식도암 19-22. PAD4과 암 사이의 링크는 p53 종양 억제 단백질 22, 23 ELK1 종양 유전자를 통해 또는 통해 매개되는 것으로 나타났다 이전 작업은 PAD4가 새로운 항암 치료 표적 17,24,25이 될 수 있다고 제안했다. 원리 연구의 증거로, 대장 암 세포주 HCT116에 shRNA를 통해 PAD4의 고갈은 세포 사멸과 세포주기 정지 (26)을 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 최근에 개발 돌이킬 수 PAD4 억제제 쥐 27 종양 질량의 70 % 감소되었다. 아주 현저하게, PAD4 억제는 변형되지 않은 세포를 살려주는 동안 암 세포를 선택적으로 죽이는 결과 표적 치료의 역할을 한 것으로 보입니다. PAD4의 기능을 해제하는 작은 분자의 사용은 암 세포를 대상으로 또는 기존의 암 화학 요법 (28)을 증가시키기 위해 강력하고 새로운 전략으로 증명할 수 있습니다. 불행하게도, 포십t 가역 PAD4 억제제는 아직 발견해야합니다. 공유 억제제의 수는 아르기닌 기판 27,29,30 모방 건강 및 질병 상태 모두에서 세포 PAD4의 역할을 이해하는데 실질적인 도구적일 수 클로로 / 플루오 imidine 핸들을 사용하여 개발되어왔다. 그러나, 이들 분자는 유사한 효능을 가진 활성 패드 모두 억제한다. 따라서 PAD4의 활성에 대해보고 용이 한 분석에 대한 필요성이 매우 중요하다. 현재까지 PAD4 분석법 비색 판독 31 반응으로부터 암모니아의 방출을 연결하는 설명되었지만, 형광 편광 분석법 (32) 형광 표지 chloroamidine 기질 유사체를 이용하는 글리 옥살과 시트룰린 (33) 사이의 산 - 보조 반응에 의존하고, 몇 단계 34 dequenching 형광에 PAD4 활동. 이들 중에서, 단지 공유 개질제 haloacetamidine 전략은 높은 처리량 scre와 호환되도록 입증개로 인한 플랫폼 32,35,36. 우리는 확실 PAD4의 활성을 측정 손쉬운 형광 계 분석을 설명한다. 강한 신호 대 잡음비, 분석 속도 및 측정의 견고성을 표시 분석은, 진정으로 강력하고 선택 PAD4 억제제를 발견 할 가능성이있다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><<td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (회백색 분말), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>이소프로필티아갈락톤스 (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>모든 완충염&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can은 Fisher Scieintifc에서 구매할 수 있습니다. 폭스바겐; 아크로스; 시그마-알드리치; 등.</td></tr><tr><td>프로티노 글루타티온(GSH) 아가로스&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>4 &deg에 저장; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>클로로아미딘&nbsp;</td><td>케이맨 화학&nbsp;</td><td>10599</td><td>-20 &deg에 저장; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell 플레이트(96 및 384)</td><td></td><td></td><td>Corning에서 구매; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control 마이크로플레이트 리더 소프트웨어</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td></tr></tbody></table>

프로 형광 기판 아날로그를 통해 pad4 활동의 형광 기반의 모니터링

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

번역 후 변형은 많은 단백질 기질의 곁사슬에서 공유 변이를 증가시켜 단백질 기능 상태를 변화시킬 수 있습니다. 히스톤 꼬리는 모든 인간 단백질 중에서 가장 많이 변형된 스트레치 중 하나를 나타냅니다. 펩티딜-아르기닌 데이미나제 4(PAD4)는 아르기닌 잔기를 유전적으로 암호화되지 않은 시트룰린 잔기로 전환하는 것으로 나타났습니다. 현재까지 기술된 몇 가지 분석법은 만족스러운 감도로 조작적으로 용이했습니다. 따라서, 적절한 분석법의 부족은 강력한 비공유 PAD4 억제제의 부재에 기여했을 가능성이 높습니다. 본 명세서에서는 PAD4 활성을 모니터링할 수 있는 새로운 형광 기반 분석법이 설명됩니다. pro-fluorescent substrate analog는 protease trypsin의 첨가에 따른 PAD4 효소 활성을 형광 방출에 연결하도록 설계되었습니다. 이 분석법은 고처리량 스크리닝 조건과 호환되며 강력한 신호 대 잡음비를 갖는 것으로 나타났습니다. 또한, 과발현된 PAD4를 함유하는 조세포 용해물로 분석을 수행할 수도 있습니다.

처음에, 그것은 ZRcoum는 96- 웰 플레이트 형식으로 PAD4의 활성에보고 할 수 있음을 입증 하였다. 웰은 상기 기판과 함께 ZRcoum PAD4의 존재 / 부재 하에서 배양 하였다. 15분의 475 nm의 필터 (도 2A) - 37 ° C에서 45 분의 인큐베이션 기간 후, 형광 40분의 340로 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 형광 레벨은 ZRcoum (또는 시트룰린 ZRcoum) 내의 형광 낮게 유지 잠긴 상태로 남아 있었다. 용액에 과량의 트립신 / EDTA를 첨가하면, 형광 물질은 ZRcoum로부터 해방 있었지만 PAD4의 존재 하에서 거의 변하지 않았다. EDTA의 첨가로 인해 필수적인 칼슘 이온을 킬레이트 화하는 능력에 PAD4 반응의 중단을 지원하기위한 것이다. 이들 데이터로부터, 형광 출력의 5.2 배의 감소 PAD4의 ...

PAD4는 펩티딜-아르기닌을 펩티딜-시트룰린으로 전환하는 효소입니다. PAD4의 조절 장애는 여러 인간 질병과 관련이 있습니다. 용이하고 처리량이 많은 호환 가능한 형광 기반 PAD4 분석에 대해 설명합니다.

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

다음 실험의 전반적인 목표는 형광을 사용하여 재현하기 쉬운 분석에서 패드 4의 활성 수준에 대한 정량적 정보를 얻는 것입니다. 이것은 디자인 기판 아날로그 ZR Co.로 패드 4를 배양함으로써 달성됩니다.단백질은 실온 또는 섭씨 37도에서 배양되어 아르기닌 유도체를 Citraline 생성물로 전환하여 기질의 공유 변형을 허용합니다. 다음으로 형광 신호 차이를 생성하기 위해 트립신을 용액에 추가합니다.결과는 형광 기질 교수를 포함하는 용액에 활성 패드 4를 추가하면 트립신에 대한 감수성이 감소하여 형광 신호 noles가 낮아짐에 따라 공유 변화가 발생함을 보여줍니다. 휘발성 암모니아 부산물의 방출을 관찰하는 것과 같은 기존 기술에 비해 우리 기술의 주요 장점은 형광을 사용하여 기판의 변형을 모니터링한다는 것입니다.이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 Mary Saki와 Jonathan Fiera가 될 것입니다 : 패드 4를 사용하여 패드 4G ST 융합을 포함하는 pgx 플라스미드를 화학적으로 유능한 대장균 세포로 변환하여 패드 4 단백질 발현을 위해 얼음 위의 모든 세포를 만듭니다. 둘째, 5ml 배양관에 pad four 유전자를 함유한 PGX 플라스미드 1마이크로리터와 세 번째 세포를 혼합합니다. 혼합물을 얼음에 10분 동안 배양하고 2분마다 부드럽게 흔듭니다.그런 다음 각각 섭씨 42도에서 40초 동안 세포에 충격을 가합니다. 레이스 직후 세포 플라스미드 혼합물을 얼음 위에서 2분 동안 다시 가열하여 세포가 회복할 수 있도록 합니다. 이제 1ml의 멸균 LB를 추가하고 세포를 1분 더 식힌 상태로 유지하십시오.다음으로, 세포를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 후 250RPM으로 진탕하고 형질전환된 세포 75마이크로리터를 암피실린 내성 한천 플레이트에 피펫팅하고 섭씨 37도에서 15시간 동안 플레이트를 배양합니다. 이 접시는 섭씨 4도에서 보관하십시오.형질전환 세포 군체를 암피실린을 함유한 5ml의 LB로 이동합니다. 튜브를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 밤새 흔듭니다. 다음 날.5밀리리터 스타터 배양물을 1개의 암피실린 트라이를 포함하는 1리터의 STO L LB로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 자라는 세포의 OD 600을 모니터링합니다. 흡광도가 0.3에 도달하면.플라스크를 섭씨 16도의 방으로 옮기고 계속 흔듭니다. 성장의 OD를 계속 모니터링하십시오. 문화권의 OD가 0.6에 도달하면.0.3 밀리몰 이소프로필 THAG GTO로 세포를 유도합니다. 세포가 섭씨 16도에서 15시간 동안 흔들리도록 합니다. IPTG로 유도를 시작하기 전에 성장 온도가 섭씨 16도인지 확인하는 것이 중요합니다.다음 날은 섭씨 0도에서 20분 동안 4, 000G에서 원심분리하여 세포를 제공하거나 SUP 대리인을 제거하고 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 보관하여 패드를 수집합니다. 4개의 단백질이 EOL 페놀, 메틸 수엔 플루오라이드 및 dihi 3 에톨을 함유한 완충액에 형질전환 세포 펠렛을 재현탁합니다. 다음으로 초음파 처리 후 섭씨 4도에서 15 분 동안 초음파 처리를 사용하여 세포를 원심 분리하고 20 분 동안 20 분 동안 000 번 G와 섭씨 0도에서 용해물을 분쇄합니다.supinate를 모아 섭씨 4도에서 30분 동안 glutathione aeros beads로 배양합니다. 흐름을 통해 수집 한 후 중력을 통해 GST 비드에서 supinate를 배출합니다. 섭씨 4도에서 25ml의 PBS로 비드를 4회 세척합니다.그런 다음 100K 분자량 차단 원심분리 튜브를 사용하여 10ml의 엘루시안 완충액 완충액 농축액 패드 4를 사용하여 비드에서 패드 4 단백질을 용리합니다. 마지막으로, Eloqua는 정제 된 4 개의 단백질을 섭씨 영하 80도에서 보관하기 위해 200 마이크로 리터 부피로 추출합니다. 이 절차를 위해 ZR co 표지 용액 A의 83 마이크로 몰 작업 용액을 준비하고 용액 E를 준비하는 C.In 용액 B, D 및 패드 4 용액 용액을 준비하고 TRIPSIN이 용해 될 때까지 혼합해야합니다.384 웰 플레이트를 얻고 메모장, 4개의 제어 웰, 테스트 웰 및 패드 4와 클로로 아마딘에 대한 억제 웰을 지정합니다. 그런 다음 각 테스트 웰에 25마이크로리터의 용액 C를 추가하고 각 대조군에 25마이크로리터의 D를 추가합니다. 접시를 실온에서 20분 동안 잘 배양합니다.20분 후 억제 웰에 10마이크로리터의 용액 B를 추가하고 20분 더 기다립니다. 다음으로, 15마이크로리터의 용액 A를 모든 웰에 추가합니다. 그런 다음 45분 동안 기다립니다.45분 후 모든 웰에 10마이크로리터의 용액 E를 추가하고 형광 측정을 수행하기 전에 10분 더 기다립니다. 마지막으로 다중 모드 리더를 사용하여 방출 데이터를 수집합니다. Zar CO를 패드 4 없이 45분 동안 패드 4 유무에 관계없이 배양하고, 트립신을 무료로 첨가하고, 형광 및 형광 수치가 증가하며, 패드 4 zar의 존재가 변형되고 트립신이 형광을 방출하지 않아 형광을 감소시킨다.이 분석은 실온에서 고처리량 스크리닝 절차를 수용하기 위해 실온의 고밀도 웰 플레이트에서 테스트되었습니다. 신호는 섭씨 37도에서 얻은 신호와 비교하여 거의 변하지 않았습니다. 반응은 실온에서 더 천천히 진행되었습니다.45분 이내에 완료되었습니다. 그런 다음 반응 완충액 내 PED four의 안정성을 15시간 동안 고처리량 스크리닝에 중요한 높은 안정성으로 테스트했습니다. 효소 활성 손실은 검출되지 않았습니다.클로로 아마딘을 사용한 PLA 4의 억제는 이러한 실온 테스트 조건에서 예상되는 경향을 보여줍니다. PAD four zku assay의 견고성에 도전하기 위해 GST pad four를 발현하는 대장균 세포의 조세포 용해물을 테스트하는 데 사용되었습니다. 정제된 GST 패드와 동일한 조건에서 테스트했을 때 예상대로 4개의 형광이 관찰되었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 PROF 형광 기질을 사용하여 이 쉽고 신뢰할 수 있는 형광 기반 분석을 사용하여 활성 패드 4를 발현하고 그 활성을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

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pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

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단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

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학습하세요 형광 기반 PAD4 활성 측정법을 통해 펩티딜-아르기닌을 시트룰린으로 전환하는 효소 활성을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 질병 관련 PAD4 역할 연구에 활용됩니다.

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