공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

이 절차의 목적은 배아, 중간 회전 뉴런과 GABA A 수용체를 안정적으로 발현하는 HEC 2 9 3 세포 사이에 공동 배양을 설정하여 GABAergic 시냅스 형성을 체외에서 코팅하는 분자 메커니즘을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 E 16에서 17 쥐 또는 마우스 배아까지 stri AUM을 해부하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 stri AAL 셀이 커버 슬립에 도금됩니다.

24웰 플레이트에서 GABA A 수용체를 안정적으로 발현하는 HEC 2, 9, 3 세포는 M cherry 형광 지표로 transfection됩니다. 마지막 단계에서, 형질주입된 세포는 고정 전 24시간 동안 시험관 내에서 14일 동안 중간 가시 뉴런과 공동 배양됩니다. 궁극적으로, 두 세포 하위 집합 사이의 시냅스 형성은 면역형광 및 컨포칼 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

GABAergic 시냅스가 신경 세포의 활동을 조정하고 중추 신경계의 신경 회로의 많은 기본적인 구조 및 기능적 요소를 담당하기 때문에 이 기술의 의미는 많은 신경 장애의 치료로 확장됩니다. 실험을 시작하기 전에 13mm 폴리올 라이신으로 코팅된 커버 슬립을 밤새 배양합니다. 24 웰 플레이트에서 섭씨 37도, 습도 5 % 이산화탄소는 다음날 과도한 폴리올 라이신을 흡입하고 멸균 된 물에서 2 회, 10 초 및 2 회 5 분 동안 세척하여 커버 슬립을 세척합니다.

그런 다음 실험 당일과 동일한 조건에서 라미닌에서 커버 슬립을 밤새 배양합니다. 먼저 임신한 쥐를 누운 자세로 에탄올이 소독된 해부 패드에 놓습니다. 그런 다음 핀셋으로 피부를 꼬집고 피부 근육과 복막을 통해 복부 주위를 잘라 내부 장기와 자궁을 드러냅니다.

다음으로, 자궁에서 배아 16-17일째 배아를 추출하여 식힌 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 배아를 층류 후드로 옮겨 머리를 식힌 HBSS가 있는 새로운 페트리 접시에 넣은 다음 구부러진 집게와 곧은 집게를 사용하여 각 뇌를 해부합니다. 차가운 HBSS가 들어 있는 새로운 페트리 접시에 뇌를 모으십시오.

그런 다음 각 뇌에 대해 두 개의 대뇌 반구를 분리하고 수막을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 해마의 선을 따라 자르고 피질을 벗겨내면 선조체가 드러납니다. 반구의 앞쪽에 있는 사툼이 많은 흰색 구조는 코르셋의 조직을 포함하지 않도록 지층을 매우 조심스럽게 해부하고 새 페트리 접시에 넣습니다.

냉각된 HBSS 함유 구부러진 집게를 사용하여 에이터를 매우 작은 1-2mm 조각으로 자릅니다. 그런 다음 불에 광택을 낸 파스타 피펫을 사용하여 조직을 멸균 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 조직 현탁액의 부피를 총 1 밀리리터로 줄이고 용액을 추가로 4-6 배 바이오 광택을 내고, 피펫 팁을 원래 직경의 약 30 %로 연마하여 용액이 균질하게 보일 때 용액이 균질하게 보일 때 100 마이크로 미터 나일론 스트레이너를 통해 셀 슬러리에 내장 된 멸균 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 용액을 4 배

그런 다음 플레이트를 7 번 10으로 계산 한 후 4 개의 세포의 힘으로 500 마이크로 리터의 신경 세포 배양, 24 개의 우물 조직 배양 플레이트에 중간 전력을 공급합니다. 웰을 왼쪽에서 오른쪽으로 교반한 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 14일 동안 세포를 배양합니다. 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS로 각 웰을 짧게 두 번 세척하여 6개의 웰 플레이트에서 세포를 분리합니다.

각 웰에 트립신 EDTA 용액을 첨가하고 섭씨 37도, 습도 5%의 이산화탄소를 5분 동안 배양하여 반응을 중지하고 담금질한 후 각 웰에 1ml의 세포 배양 배지를 첨가하고 내용물을 15ml 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 440배 G로 세포를 원심분리하고, supinate를 제거하고 펠릿을 500 마이크로 리터의 신경 세포 배양액에 완전히 재현탁시킵니다. 중간 종자를 계수한 후 상하로 부드럽게 피펫팅하여 뉴런을 포함하는 24웰 조직 배양판에 웰당 4개의 세포를 10회 3회 교반하고 플레이트를 교반하여 세포를 분산시킵니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 분위기에서 24시간 동안 공동 배양을 배양합니다.

이러한 이미지에서, 알파 1, 베타 2 및 감마 2 GABA AR 소단위 또는 알파 1, 베타 3 및 감마 2 GABA AR 소단위의 세포 표면 발현이 HC 2 93 세포에서 높은 수준의 공동 국소화로 관찰되었습니다. 여기. 시험관 내에서 14일 동안 HC 2 93 세포와 신경 세포 사이의 세포 간 접촉을 분석한 결과, GAD 65 양성 GABAergic 축삭 말단은 알파 1을 발현하는 HEC 2 93 세포 사이에 형성된 수많은 시냅스와 같은 접촉에 비해 대조군 HEC 2 9 3 세포와 산발적인 접촉만을 형성한다는 것을 나타냅니다. 베타 2 감마 2 GABAA 수용체. 이 실험에서는 신경전달물질 방출에 적극적으로 관여하는 소포만 antis synap toin antibody indeed view로 표지되었습니다.

대조군 HEC 2, 9, 3 세포와 매체 회전 뉴런 말단 사이의 접촉이 활성화된 경우. 이는 HEC 2 93 세포 내에서 시냅스전 GAD 65 시냅스 테인 형광과 mCherry 형광 사이의 공동 국소화(colocalization)가 부족한 것으로 설명됩니다. 대조적으로, HEC 2 93 세포에서 특이적으로 발현된 GAD 65 synap Taman과 M cherry 형광 사이의 높은 수준의 공동 국소화에 의해 밝혀진 바와 같이 HEC 2 93 세포를 발현하는 알파 1, 베타 2 감마 2 gabaa 수용체를 결합하는 매질 사이에 많은 활성 접촉이 형성되었습니다.

이러한 최종 이미지에서, GABA AR의 다른 아형을 안정적으로 발현하는 HEC 2 93 세포를 중간 가시 뉴런과 공동 배양했습니다. 분석은 1 개의 긍정적 인 GABAergic 작용이 말단과 알파 1 B 2 3 감마 2 사이에 형성된 수많은 시냅스와 같은 접촉을 보여주며 24 시간 후에 HEC 2 9 3 세포를 발현합니다. 공동 배양에서 이 기술은 분자 신경과학 분야의 연구자들이 GABAergic 시냅스 형성에 관여하는 다양한 시냅스 접착 분자의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.