Name: 고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 학습하세요 고해상도 주사전자현미경을 이용해 Helicobacter pylori의 Cag-T4SS 필리를 시각화하는 방법을. 철 제한 조건에서 분비 시스템 생성이 증가하며, 이는 위암 등 H. pylori 관련 질병의 병원성 메커니즘 이해에 기여합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 및 National Center for Advancing Translational Sciences의 CTSA 상 UL1TR000445의 지원을 받았습니다. 이 문서의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립중개과학발전센터(National Center for Advancing Translational Sciences) 또는 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다. 주사 전자 현미경 실험은 부분적으로 NIH 보조금 CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 및 EY08126의 지원을 받는 VUMC 세포 이미징 공유 리소스를 사용하여 수행되었습니다.

1. H. 인간의 위 상피 세포와 철 가용성 및 공동 문화의 다양한 조건에서 균 성장 <ol><li> H.를 선택 이러한 연구에 대한 파이로리 스트레인 PMSS1 그것이 그대로 CAG 병원성 아일랜드를 가지며 작동 타입 IV 분비 시스템을 표현하기 때문이다. 또한 음성 대조군으로 동질 케이지 돌연변이 (PMSSI Δ 케이지)를 사용합니다. 5 % CO 2 존재하에 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % 양 혈액 (아가 플레이트)로 보충 TSA 플레이트상에서 세균 성장. 참고 : 시약을 준비하고 재료 및 장비 표에 요약 된 자료를 조립한다. 각 시약에 대한 최종 농도는 괄호 안에 표시됩니다. </li><li> 멸균 면봉을 사용하여 판에서 박테리아를 긁고 구성 요소에서 준비 수정 브루셀라 배지에 접종 (재료 및 장비 표 참조) 콜레스테롤 보충. 37에서 하룻밤 문화를 품다분 수 (rpm)에 200 회전에서 진탕 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기를 ° C. NOTE : 콜레스테롤 인해 혈청이 복잡하다는 사실에 소 태아 혈청 대신에 사용된다; 이러한 결과에 변화가 발생 헴 (heme) 등의 영양소 철의 다양한 소스를 포함. </li><li> 세균 배양의 날, AGS 인간 위 상피 세포를 시드 (ATCC CRL-1739) 12 웰 플레이트 (웰 당 약 1 × 105 세포)의 폴리 D 라이신 처리 된 커버 슬립 상. </li><li> 다음 날, 수정 브루셀라 국물 혼자 또는 100 μM 50ml을, 200 μM의 피리 딜 (합성 철 킬레이트), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 보충 0.3의 OD600에 박테리아 문화를 희석. 200 rpm으로 진탕하면서 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 배양이 부화. </li><li> 1,000 XG에 원심 분리기 박테리아는 세포를 수집하고 난을 재 부유하기 전에 상층 액을 제거n은 신선한 수정 된 브루셀라 브로스 동량 콜레스테롤 보충. 문화 (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 8 세포 / ml)의 측정 OD600 감염 20 (MOI)의 다수의 상피 세포에 박테리아를 추가 : 1. 박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석 접시 균체를 수행한다. </li><li> H.을 품어 주사 전자 현미경 (SEM) 시료 전처리를 수행하기 전에 정적 인 상태에서 5 % CO 2 존재 하 37 ° C에서 4 시간 동안 파이로리 AGS 인간 위 상피 세포 공동 배양. </li></ol> 2. SEM H.을 시각화하는 샘플 준비 pylori의 CAG-T4SS 필리 <ol><li> H. 제거 균 및 인큐베이터와 캔트 배양 상층 액에서 AGS 공동 문화 (IL-8 ELISA에 대한 저장). 0.05 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.4)으로 가볍게 세 번 씻으십시오. , 2.0 % 파라 포름 알데히드 용액에 2.5을 실온에서 2~4시간에 대한 샘플을 수정% 글루 테르 알데히드, 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼입니다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다. </li><li> 두 연속 10 분 정착 단계에서 0.05 M 소듐 cacodylate 버퍼에 0.1 % 사 산화 오스뮴을 이용하여 차 고정을 수행한다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다. </li><li> 기본 및 보조 고정 후, 표 1에 따라 에탄올의 농도가 증가함에 따라 순차적으로 세척하여 샘플을 탈수. </li><li> 에탄올 탈수 후 액체 이산화탄소 세 순차 세척을​​ 수행한다. 1073 PSI의 31.1 ºC의 온도 및 압력에서 임계점 건조 기계를 사용 임계점이어서 건조한 샘플. </li><li> 마운트는 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 된 커버하고 적절한 접지를 달성하고 SEM 이미징 동안 충전을 방지하기 위해 샘플 가장자리에 콜로이드 실버의 얇은 선으로 페인트. </li><li> 코트 샘플과는 5nm샘플 2 차 전자 신호 및 에지 효과를 증가시키기 위해 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 금 - 팔라듐. </li></ol> 고해상도 현미경 분석 3. 이미징 매개 변수 <ol><li> 이 필드 방출 총 스캐닝 전자 현미경 (FEG-SEM)으로보기 샘플. </li><li> 5~10mm의 작동 거리에서 고진공 모드에서 이미지. </li><li> 5 kV의에 가속 전압을 설정합니다. </li><li> 2-2.5에 자리 크기를 설정합니다. </li><li> 호스트 인터페이스 병원체의 더 나은 관점을 달성하기 위해 15 내지 25도 사이의 샘플을 기울인다. </li><li> 호스트 병원체 상호 작용의 이들 영역은 필리 - 형성 박테리아 농후 한, 고배율 관찰 용 상피 세포의 가장자리에 부착 된 세균을 이미징 우선 순위. </li></ol> 4. 통계 분석은 필리 정량화를 평가하기 <ol><li> H. 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 파이로리 CAG-T4SS의 필리는 piliated 프 전시 세포의 필리 / 세포의 수뿐만 아니라 퍼센트를 정량화하기아래의 지침에 따라 표현형. </li><li> ImageJ에 소프트웨어의 열기 현미경 사진 파일. 균일 한 폭 (10 ~ 13 ㎚)과 길이 (60-150 나노 미터)와 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 형성되는 구조로 필리을 확인합니다. NOTE : pilus 구조 주요 ATP 아제 힘 타입 IV 분비 pilus 조립체를 코딩하는 유전자에 불활 항구 이러한 Δ 케이지 변이주로서 동질 균주에 WT 균주에 존재하지만, 존재하지 않는다. </li><li> &quot;분석&quot;탭을 클릭 한 다음 직선 도구를 사용하여 선 그리기에 의해 측정 도구를 보정합니다. 드롭 다운 메뉴에서 &quot;설정 규모&quot;를 선택하고 상자 표시 &quot;알려진 거리&quot;로 확대 바 값을 입력하고 적절한 설정 (㎚)로 길이의 단위를 설정합니다. &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> pilus의 길이나 폭에 걸쳐 그려 직선 도구를 사용하여 CAG-T4SS의 필리를​​ 측정하고 각 pilus를 측정하기 위해 &quot;Ctrl 키를-M&quot;을 눌러. 측정 값과의 대화 상자를 관찰합니다. 이 값을 기록하거나 복사하여 스프레드 시트 프로그램에 붙여 넣습니다. </li><li> 길이를 사용하여 폭 매개 변수는 이전에 CAG-T4SS의 프로필에 맞지 않는 24 무시 기능을 설립했다. 그런 다음 10 ~ 13 nm의 폭 및 60-150 nm의 길이 컷오프 내에있는 값에 기초 필리의 수를 정량화. </li><li> 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 두 개의 꼬리 학생의 T 시험에 의해 통계적으로 필리의 정량을 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 선택 사항 : IL-8 분비의 평가 Pilus 생산과의 상관 관계를 분석하기 <ol><li> 2.1 단계에서 상층 액을 사용하여, 키트 제조 업체의 지침 (재료 및 장비 표 참조) 당 IL-8 ELISA를 수행합니다. </li><li> IL-8 숙주 세포에 의해 분비를 분석 단독 배지에서 성장 WT PMSS1에 대해 퍼센트 IL-8 유도를 계산한다. 그래서 그래프 패드 프리즘을 사용하여 두 꼬리 학생의 T 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행ftware. </li></ol>

<ol><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori%27s+helical+shape+and+stomach+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li>
<li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li>
<li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li>
<li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li>
<li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li>
<li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li>
<li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li>
<li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).</li>
<li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li>
<li>Cover, T. L., Peek, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li>
<li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gastric+IL-1%CE%B2+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420(2013).</li>
<li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li>
<li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li>
<li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li>
<li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li>
<li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li>
<li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li>
<li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li>
<li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

철 박테리아 병원균을 포함한 삶의 대부분의 형태에 필수적인 미량 영양소이다. 미생물 침입의 가능성을 제한하기위한 노력으로, 척추 호스트는 &quot;영양 면역&quot;(18)로 알려진 과정에서 영양소 철을 격리시키는. 이에 응답하여, 박테리아 병원균은 주변 환경을 감지하고 철 수집 시스템, 독소 및 독소 분비 기계 (19, 20)으로 병원성 기능 정교화 조절하는 전역 신호 분자로서 철을 사용하도록 진화했다. H. 파이로리는 철, 아연, 및 마그네슘 (22)을 성장 및 헴 (heme), 헤모글로빈, 트랜스페린 등의 대체 철 공급원을 사용할 수 있으며, 락토페린 (23) 등의 미량 영양소를 필요로한다. H.을 파이로리는 가장 성공적인 병원균처럼, 호스트 (21)로부터 영양 철을 청소할 수 있도록 독성 요인의 넓은 레퍼토리를 진화했다. 한 독성 인자와...

H. pylori 감염은 위암의 중요한 위험 인자입니다1. 그러나 질병의 결과는 다양하며 숙주 유전학, 헬리코박터 파일로리 균주의 유전적 다양성, 숙주 식단과 같은 환경적 요소와 같은 수많은 요인에 따라 달라진다11. 이전 보고에서는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염, 철분 결핍(혈중 페리틴 및 헤모글로빈 농도 감소로 측정), IL-8 분비를 포함한 전염증성 사이토카인 생성 증가 사이에 상관관계가 존재하며, 이는 궁극적으로 위질환 진행을 증가시킨다고 밝혔다12. 급성 헬리코박터 파일로리균 감염은 또한 숙주의 철분 흡수 능력을 손상시키고 궁극적으로 철의 항상성에 변화를 일으키는 저염소수증(hypochlorhydria)과 관련이 있다13. 이러한 임상 결과는 가스 틈새 내 철분 가용성이 질병 결과에 중요한 요인이 될 수 있음을 시사합니다. 실제로, 헬리코박터 파일로리균 감염에 대한 동물 모델은 적은 식이 철분 섭취가 위장 질환을 악화시킨다는 것을 입증했다14. 이 동물의 철분 수치가 감소하면 H. pylori가 박테리아 복제에 필요한 철을 얻기 위해 철 획득 반응을 유도해야 합니다. H. pylori는 숙주 세포 내의 철 이동을 교란하여 CagA 의존성 방식으로 박테리아 복제를 촉진하는 능력을 가지고 있습니다15. 흥미롭게도, cag-병원성 섬은 철 반응성 전사 인자 Fur16,17에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다. 또한 Cag+ 균주는 염증 증가 및 암과 같은 위장 질환과 관련이 있습니다1. 이러한 발견은 H. pylori가 철이 고갈된 환경에 있는 숙주 세포에서 철을 얻기 위해 Cag-T4SS 발현을 변경하여 질병 결과를 악화시키는 모델을 뒷받침합니다. 
염증과 이환율을 증가시키는 두 가지 요인은 전능신전능신전(CAG) 발현과 낮은 식이 철분 섭취입니다. 이러한 사실은 철분 가용성이 감소하면 숙주 병원체 계면에서 Cag-T4SS pili 생성이 증가하여 위질환이 악화된다는 가설을 뒷받침합니다11-14. 이 원고에 제공된 방법의 목표는 Cag-T4SS pilus biogenesis의 조절에서 미량 영양소 철의 역할을 확립하는 것입니다. 이전 연구에서는 Cag-T4SS 발현의 철 의존적 증가를 관찰하기 위해 두 가지 접근 방식을 사용했습니다. 첫째, 고철분 및 저철분 식단을 섭취한 동물의 산출 균주를 분석한 결과, 저철분 식단 산출 균주가 고철분 식단 균주보다 더 많은 Cag-T4SS pili를 생성한다는 사실이 밝혀졌다14. 둘째, 철이 풍부한 조건에서 H. pylori 7.13 균주를 시험관 내에서 성장시키면 필리 형성이 감소하는 반면 철 킬레이터가 있는 상태에서 성장한 세포는 훨씬 더 많은 필리를 생성했습니다. 
자사는 Cag-T4SS 필리 표현형의 철 의존성 조절을 지속적으로 조사해 왔으며 추가 헬리코박터 파일로리 균주인 PMSS1에 대해 수행된 다음과 같은 최적화된 프로토콜 및 대표적인 결과를 제공합니다. 이 기술 개발의 근거는 철 제한 조건에서 증가된 Cag-T4SS 활성을 Cag-T4SS 필루스 형성 증가와 연관시키는 것이었습니다. 이 기술의 광범위한 의미와 사용은 Cag-T4SS pili의 생산을 증가시키는 최적화된 배양 조건을 제공할 것입니다. 이 분석은 이 중요한 박테리아 표면 특징을 농축하여 Cag-T4SS의 조성 및 구조를 결정하려는 연구자에게 유용할 것입니다. 전계 방출 총 전자 현미경에 의한 시료 준비 및 시각화는 Cag-T4SS를 시각화하기 위한 광학 현미경 방법과 같은 대체 기술에 비해 많은 이점이 있으며 이 소기관10의 조절을 연구하는 데 관심이 있는 연구자에게 적합합니다.

<table><tbody>카제인에서 추출한 <tr><td>변형된 브루셀라 육수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펩톤(10g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>동물 조직의 펩틱 분해물(10g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물(2g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>포도당(1g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(5g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 (250X) (4 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>염화철(100 또는 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>디피리딜(200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>변형 RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 ( 100 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(2.0% 수성)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>글루테알데히드(2.5% 수성)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>카코딜산나트륨(0.05M)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드(0.1% 수성)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(절대)</td><td>시그마</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>콜로이드 실버 페인트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>SEM 샘플 스텁</td><td>전자 현미경 과학</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>써모 피셔</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 분비 평가</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 ELISA kit</td><td>R& D 시스템</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 cag 유형 iv 분비 시스템 필리

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori는 인간 인구의 절반의 인간 위 틈새에 서식하는 나선형 모양의 그람 음성 박테리아입니다1,2. 헬리코박터 파일로리균은 위암의 주요 원인이며, 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인입니다3. 위 질환의 위험 증가와 관련이 있는 독성 인자 중 하나는 H. pylori의 염색체 내 40kb 영역인 Cag-병원성 섬으로, IV형 분비 시스템과 동족 효과기 분자인 CagA4,5를 암호화합니다. Cag-T4SS는 CagA와 펩티도글리칸을 숙주 상피 세포로 전위시키는 역할을 합니다5,6. Cag-T4SS의 활성은 사이토카인 발현의 상향 조절, 전염증 경로의 활성화, 세포골격 리모델링, 발암성 세포 신호 네트워크의 유도 등 숙주 세포 생물학에 수많은 변화를 일으킵니다5-8. Cag-T4SS는 내막과 외막에 걸쳐 세포에서 세포 외 공간으로 바깥쪽으로 확장되는 하위 조립 구성 요소로 구성된 고분자 기계입니다. Cag-T4SS의 세포외 부분은 "필루스(pilus)"5로 지칭됩니다. 수많은 연구에서 Cag-T4SS pili가 숙주-병원체 계면에서 형성된다는 것이 입증되었습니다9,10. 그러나 이 중요한 세포 기관의 생물 발생을 조절하는 환경적 특징은 대체로 모호한 상태로 남아 있습니다. 최근에 우리는 철분 가용성이 낮은 조건이 Cag-T4SS 활성과 pilus 생물 발생을 증가시켰다고 보고했습니다. 여기에서는 인간 위 상피 세포와 공동 배양하기 전에 다양한 철 가용성 조건에서 H. pylori를 성장시키기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 고해상도 주사 전자 현미경 분석을 통해 철 제한 조건에서 나타나는 hyper-piliated 표현형의 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

이 보고서에서 우리는 철의 가용성을 변화의 조건이 H.을 조절하는 능력을 가지고 있음을 증명하고있다 호스트 병원체 인터페이스에서 파이로리 CAG-T4SS의 pilus의 생합성. , H. 단독 배지에서 배양하면 파일로리 3 필리 / 셀의 평균을 형성한다. 때 H. 파일로리 철에서 성장 고갈 세균 성장 (도 1)은 하위 억제이다 (합성 킬레이트 피리 딜 사용) 조건, 박테리아 생성 수많은 CAG-T4SS 필리 (~ 7 필리 / 셀) 때 인간 위암 세포와 공 배양 (그림 2). 영양소 철 외인성 소스가 존재하면 반대로, CAG-T4SS의 필리의 형성이 억제된다 (FE 샘플 1 개 미만 pilus / 셀, 1 미만 pilus / FE +의 DIP 시료 중의 세포) (도 2). 호스트 병원체 인터페이스에서 필리의 정량화 밝혀 그 철 제한, H.의 조건...

여기에서는 Cag Type IV 분비 시스템(Cag-T4SS)으로 알려진 발암성 박테리아 소기관을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Cag-T4SS가 다양한 철 가용성 조건에 반응하여 H. pylori의 표면에서 차등적으로 생성된다는 것을 발견했습니다.

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

이 절차는 철분 제한 조건에서 1차 배양 h pylori의 조건에서 발생하는 CAG 유형 4 분비 시스템 pii의 과잉 생산을 시각화합니다. 두 번째 단계는 h 파일로리균을 위 상피 세포와 함께 배양하는 것입니다. 다음으로, 주사 전자 현미경을 위한 공동 배양 샘플을 처리합니다.궁극적으로 고해상도 주사 전자 현미경은 철 제한 조건에서 CAG 유형 4 분비 시스템 파이 아이 생산이 증가했음을 보여주는 데 사용됩니다. 이 원고의 기법은 CAG 4형 분비 시스템이 음성 질병 결과의 위험 증가와 관련이 있기 때문에 위암과 같은 파일로리 관련 질병에 중요합니다. 따라서이 중요한 박테리아 표면의 조절에 대한 더 나은 이해가 가능합니다.소기관은 새로운 화학요법 표적을 밝힐 수 있습니다.그리고 형광 현미경과 같은 기존 방법에 비해 고해상도 주사 전자 현미경의 장점은 개별 4형 분비약 I을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 전자 현미경 방법을 처음 접하는 개인은 절차, 특히 신중한 타이밍과 혈액에 대한 섬세한 손이 필요하기 때문에 습식 화학에 문제가 있습니다. 한천 접시가 자랍니다.H Pylori PM, S one 박테리아 및 기능하는 4형 분비 시스템이 없는 동종 CAG e 돌연변이. 배양균과 콜레스테롤이 보충된 변형된 엘라 육수를 접종하여 하룻밤 사이에 자라도록 합니다. 다음으로, GS 인간 위 상피 세포를 다양한 철 가용성 조건을 위해 12개의 웰 플레이트에 있는 폴리리신 처리된 커버 슬립에 파종합니다.h pylori를 변형된 브루 육수에서 광학 밀도 600 0.3으로 단독으로 희석합니다. 100 마이크로 어금니의 염화철, 200 마이크로 몰의 합성 철 킬레이터 디퍼 또는 200 마이크로 마이크로의 디퍼와 200 마이크로 어금니의 염화철 배양을 포함하는 매체. 이제 4시간 동안의 샘플로 박테리아를 1000Gs로 원심분리하고 Resus는 콜레스테롤이 보충된 동일한 부피의 신선한 변형 브루 육수에 펠릿을 현탁시킵니다.박테리아 밀도를 측정합니다. 다음으로, 상피 세포를 20 대 1의 감염 배수로 h pylori로 감염시킵니다. 연속 희석을 수행하고 박테리아 세포를 혈액 한천 플레이트에 플레이트합니다.박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 공동 배양액을 세포 배양 인큐베이터에 4시간 동안 넣습니다. h pylori I 및 GS 공동 배양에서 상층액을 디캔팅합니다. 0.05 몰 나트륨 코팅액으로 부착 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다.그런 다음 실온에서 2-4시간 동안 샘플을 고정합니다. 다음으로, 0.05 molar sodium ca coate buffer로 샘플을 세 번 세척합니다. 2차 고정의 경우, 0.05 몰 나트륨 ca 코테이트 완충액에 0.1% 오스뮴 테트록사이드를 두 번의 순차적인 10분 고정 단계로 추가합니다.그런 다음 세 번 세척한 후 증가된 농도의 에탄올로 샘플을 탈수합니다. 샘플을 임계점 건조기에 넣은 다음 챔버를 액체 이산화탄소로 채웁니다. 에탄올이 챔버에서 퍼지되고 챔버는 다시 액체 이산화탄소로 채워집니다.그런 다음 샘플을 섭씨 31.1도의 임계점으로 가져갈 수 있으며 이제 1073PSI는 덮개 슬립을 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 장착하고 접지를 위해 샘플 가장자리에 얇은 콜로이드 은선을 칠합니다. SEM 이미징 중에 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 샘플을 5나노미터의 금 팔라듐으로 코팅하여 샘플 2차 전자 신호 및 가장자리 효과를 높입니다. 전계 방출 건 주사 전자 현미경 이미지로 5-10mm의 작동 거리에서 고진공 모드로 샘플을 검사합니다.가속 전압을 5kV로 설정합니다. 그런 다음 스폿 크기를 2로 설정하여 2.5로 설정합니다. 이제 샘플을 15도에서 25도 사이로 기울여 고배율 보기를 위해 숙주 병원체 인터페이스를 더 잘 볼 수 있습니다.숙주 병원체 상호 작용이 풍부한 PI 생명 온난화 박테리아를 위해 상피 세포의 가장자리에 부착된 박테리아의 이미징을 우선시합니다. 이미지 J 소프트웨어에서 현미경 사진 파일을 엽니다. 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 10-13나노미터의 균일한 너비와 60-150나노미터의 길이를 가진 구조가 형성됨에 따라 pi li를 식별합니다.직선 도구로 선을 그린 다음 드롭다운 메뉴에서 분석 탭을 클릭하여 측정 도구를 보정합니다. scale 설정을 선택하고 known distance 아래에 배율 막대 값을 입력하고 길이 단위를 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.이제 직선 도구를 사용하여 조종사의 길이 또는 너비를 그린 다음 컨트롤 M을 눌러 각 조종사를 측정하고 측정값을 스프레드시트 프로그램에 기록합니다. 이전에 설정된 길이 및 너비 매개변수를 사용하여 CAG 유형 4 분비 시스템의 프로필에 맞지 않는 기능을 무시합니다. 그런 다음 양측 학생 T-검정을 사용하여 PI LI를 통계적으로 분석한 범위 내에 있는 값을 기반으로 PI I의 수를 정량화합니다.이 실험에서, h pylori는 성장을 크게 억제하지 않는 농도에서 합성 킬레이터 딥 패리탈을 사용하여 철이 고갈된 조건에서 배양되었습니다. 이 박테리아는 인간 위 세포와 공동 배양할 때 수많은 CAG 4형 분비 시스템 PII를 생성했습니다. 반대로, 영양소 철분의 외인성 공급원이 존재하면 CAG 4형 분비 시스템 PII의 형성이 억제됩니다.숙주 병원체 계면에서 PII를 정량화한 결과, 철이 제한되는 조건에서 h pylori는 CAG 유형 4 분비 시스템 PI eye에서 2배 증가를 보이며, 배지에서만 성장한 세포에 비해 pileated cell의 비율이 11% 증가함을 보여줍니다. 흥미롭게도, 숙주 IL 8 분비에 의해 측정된 CAG 유형 4 분비 시스템 활성은 철 제한 조건에서 강화되고 과도한 철 가용성 조건에서 억제되지만, PI LI 차원은 모든 철 가용성 조건에서 일관되게 유지됩니다. CAG 4형 분비 시스템의 관여와 일치하게, 철분 가용성은 CAG e 돌연변이의 발달 후 표면에서 PI LI의 생체 발생을 변화시키지 않습니다.이 SEM 기술은 CAG 유형 4 분비 시스템 분야의 연구자들이 단백질 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. CAG 유형 4 분비 시스템 베개에 관해서는. 최근에는 효과기 단백질인 CAG a가 4형 분비약의 끝에 국한되어 있다는 사실이 밝혀졌습니다.

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수...

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

이 기사는 관심 단백질과 E. coli의 다른 인자 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 부위 특이적 광교차결합과 함께 펄스 추적 무선 라벨링을 사용하는 방법을 설명합니다. 기존의 화학적 가교 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포에서 정렬된 조립 경로의 고해상도 "스냅샷"을 생성합니다.

부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

학습하세요 고해상도 주사전자현미경을 이용해 Helicobacter pylori의 Cag-T4SS 필리를 시각화하는 방법을. 철 제한 조건에서 분비 시스템 생성이 증가하며, 이는 위암 등 H. pylori 관련 질병의 병원성 메커니즘 이해에 기여합니다.

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

더 많은 동영상 탐색