고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

이 절차는 철분 제한 조건에서 1차 배양 h pylori의 조건에서 발생하는 CAG 유형 4 분비 시스템 pii의 과잉 생산을 시각화합니다. 두 번째 단계는 h 파일로리균을 위 상피 세포와 함께 배양하는 것입니다. 다음으로, 주사 전자 현미경을 위한 공동 배양 샘플을 처리합니다.

궁극적으로 고해상도 주사 전자 현미경은 철 제한 조건에서 CAG 유형 4 분비 시스템 파이 아이 생산이 증가했음을 보여주는 데 사용됩니다. 이 원고의 기법은 CAG 4형 분비 시스템이 음성 질병 결과의 위험 증가와 관련이 있기 때문에 위암과 같은 파일로리 관련 질병에 중요합니다. 따라서이 중요한 박테리아 표면의 조절에 대한 더 나은 이해가 가능합니다.

소기관은 새로운 화학요법 표적을 밝힐 수 있습니다.그리고 형광 현미경과 같은 기존 방법에 비해 고해상도 주사 전자 현미경의 장점은 개별 4형 분비약 I을 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 전자 현미경 방법을 처음 접하는 개인은 절차, 특히 신중한 타이밍과 혈액에 대한 섬세한 손이 필요하기 때문에 습식 화학에 문제가 있습니다. 한천 접시가 자랍니다.

H Pylori PM, S one 박테리아 및 기능하는 4형 분비 시스템이 없는 동종 CAG e 돌연변이. 배양균과 콜레스테롤이 보충된 변형된 엘라 육수를 접종하여 하룻밤 사이에 자라도록 합니다. 다음으로, GS 인간 위 상피 세포를 다양한 철 가용성 조건을 위해 12개의 웰 플레이트에 있는 폴리리신 처리된 커버 슬립에 파종합니다.

h pylori를 변형된 브루 육수에서 광학 밀도 600 0.3으로 단독으로 희석합니다. 100 마이크로 어금니의 염화철, 200 마이크로 몰의 합성 철 킬레이터 디퍼 또는 200 마이크로 마이크로의 디퍼와 200 마이크로 어금니의 염화철 배양을 포함하는 매체. 이제 4시간 동안의 샘플로 박테리아를 1000Gs로 원심분리하고 Resus는 콜레스테롤이 보충된 동일한 부피의 신선한 변형 브루 육수에 펠릿을 현탁시킵니다.

박테리아 밀도를 측정합니다. 다음으로, 상피 세포를 20 대 1의 감염 배수로 h pylori로 감염시킵니다. 연속 희석을 수행하고 박테리아 세포를 혈액 한천 플레이트에 플레이트합니다.

박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 공동 배양액을 세포 배양 인큐베이터에 4시간 동안 넣습니다. h pylori I 및 GS 공동 배양에서 상층액을 디캔팅합니다. 0.05 몰 나트륨 코팅액으로 부착 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다.

그런 다음 실온에서 2-4시간 동안 샘플을 고정합니다. 다음으로, 0.05 molar sodium ca coate buffer로 샘플을 세 번 세척합니다. 2차 고정의 경우, 0.05 몰 나트륨 ca 코테이트 완충액에 0.1% 오스뮴 테트록사이드를 두 번의 순차적인 10분 고정 단계로 추가합니다.

그런 다음 세 번 세척한 후 증가된 농도의 에탄올로 샘플을 탈수합니다. 샘플을 임계점 건조기에 넣은 다음 챔버를 액체 이산화탄소로 채웁니다. 에탄올이 챔버에서 퍼지되고 챔버는 다시 액체 이산화탄소로 채워집니다.

그런 다음 샘플을 섭씨 31.1도의 임계점으로 가져갈 수 있으며 이제 1073PSI는 덮개 슬립을 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 장착하고 접지를 위해 샘플 가장자리에 얇은 콜로이드 은선을 칠합니다. SEM 이미징 중에 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 샘플을 5나노미터의 금 팔라듐으로 코팅하여 샘플 2차 전자 신호 및 가장자리 효과를 높입니다. 전계 방출 건 주사 전자 현미경 이미지로 5-10mm의 작동 거리에서 고진공 모드로 샘플을 검사합니다.

가속 전압을 5kV로 설정합니다. 그런 다음 스폿 크기를 2로 설정하여 2.5로 설정합니다. 이제 샘플을 15도에서 25도 사이로 기울여 고배율 보기를 위해 숙주 병원체 인터페이스를 더 잘 볼 수 있습니다.

숙주 병원체 상호 작용이 풍부한 PI 생명 온난화 박테리아를 위해 상피 세포의 가장자리에 부착된 박테리아의 이미징을 우선시합니다. 이미지 J 소프트웨어에서 현미경 사진 파일을 엽니다. 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 10-13나노미터의 균일한 너비와 60-150나노미터의 길이를 가진 구조가 형성됨에 따라 pi li를 식별합니다.

직선 도구로 선을 그린 다음 드롭다운 메뉴에서 분석 탭을 클릭하여 측정 도구를 보정합니다. scale 설정을 선택하고 known distance 아래에 배율 막대 값을 입력하고 길이 단위를 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.

이제 직선 도구를 사용하여 조종사의 길이 또는 너비를 그린 다음 컨트롤 M을 눌러 각 조종사를 측정하고 측정값을 스프레드시트 프로그램에 기록합니다. 이전에 설정된 길이 및 너비 매개변수를 사용하여 CAG 유형 4 분비 시스템의 프로필에 맞지 않는 기능을 무시합니다. 그런 다음 양측 학생 T-검정을 사용하여 PI LI를 통계적으로 분석한 범위 내에 있는 값을 기반으로 PI I의 수를 정량화합니다.

이 실험에서, h pylori는 성장을 크게 억제하지 않는 농도에서 합성 킬레이터 딥 패리탈을 사용하여 철이 고갈된 조건에서 배양되었습니다. 이 박테리아는 인간 위 세포와 공동 배양할 때 수많은 CAG 4형 분비 시스템 PII를 생성했습니다. 반대로, 영양소 철분의 외인성 공급원이 존재하면 CAG 4형 분비 시스템 PII의 형성이 억제됩니다.

숙주 병원체 계면에서 PII를 정량화한 결과, 철이 제한되는 조건에서 h pylori는 CAG 유형 4 분비 시스템 PI eye에서 2배 증가를 보이며, 배지에서만 성장한 세포에 비해 pileated cell의 비율이 11% 증가함을 보여줍니다. 흥미롭게도, 숙주 IL 8 분비에 의해 측정된 CAG 유형 4 분비 시스템 활성은 철 제한 조건에서 강화되고 과도한 철 가용성 조건에서 억제되지만, PI LI 차원은 모든 철 가용성 조건에서 일관되게 유지됩니다. CAG 4형 분비 시스템의 관여와 일치하게, 철분 가용성은 CAG e 돌연변이의 발달 후 표면에서 PI LI의 생체 발생을 변화시키지 않습니다.

이 SEM 기술은 CAG 유형 4 분비 시스템 분야의 연구자들이 단백질 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. CAG 유형 4 분비 시스템 베개에 관해서는. 최근에는 효과기 단백질인 CAG a가 4형 분비약의 끝에 국한되어 있다는 사실이 밝혀졌습니다.