의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적 흐름 조건에서 내피 접착 분자와 백혈구 상호 작용을 평가하기 위해 생체 외 동정맥 폐쇄 회로를 만드는 것입니다. 이는 먼저 얇은 유리 챔버를 관심 있는 내피 접착 분자로 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 폴리에틸렌과 실리콘 튜브를 챔버에 연결한 다음 수술을 통해 마우스에 연결합니다.

다음으로 경동맥에서 나온 혈액이 튜브를 통해 흐를 수 있습니다. 그리고 천연 백혈구와 코팅된 유리 챔버의 후속 상호 작용이 실시간으로 기록됩니다. 궁극적으로, 고정된 접착 분자와 상호 작용할 때 백혈구의 변위 및 롤링 속도에 대한 다양한 처리의 효과는 시간이 지남에 따라 계산될 수 있습니다.

프로 세포 분석 분석과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 생리학적 흐름 조건에서 내피 분자와 백혈구 상호 작용을 평가할 수 있다는 것입니다. 실험 전날 1cm의 PE 10 폴리에틸렌 튜브를 6cm의 실리콘 튜브에 연결한 다음 5cm의 폴리에틸렌 튜브를 연결합니다. 경동맥 쪽을 위해 동물의 경정맥 쪽에 대한 튜빙 설정을 준비하려면, 1cm 폴리에틸렌 튜빙에서 약 1.5cm 떨어진 6cm 실리콘 튜빙 내에 TTU를 추가하여 방금 설명한 대로 튜빙을 연결합니다.

다음으로, 10cm 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝을 압력 변환기에 연결하고 경동맥 쪽 T 튜브의 T 끝을 다른 쪽 끝에 삽입합니다. 연결 사이트가 단단하고 누출이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 25게이지 바늘에 연결된 1밀리리터 주사기를 사용하여 각 마이크로플로우 챔버에 새로 준비된 관심 내피 표면 코팅 단백질을 주입하고 코팅된 챔버를 섭씨 4도의 15ml 튜브에 넣고 다음 날 하룻밤 동안 보관합니다.

경정맥 및 경동맥 튜브를 마이크로플로우 챔버에 연결하려면 챔버의 각 측면에 1cm 실리콘 튜브를 연결한 다음 튜브가 챔버와 만나는 상태로 늘어난 작은 직사각형 파라마 조각으로 연결을 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 챔버와 튜브를 0.1% 소 혈청 알부민으로 채웁니다. 그런 다음 누출을 확인한 후 챔버에서 45 분 동안 배양합니다.

배양이 끝날 무렵의 실온에서 각 노치에서 작은 실리콘 방울로 페트리 접시에 마이크로플로우 챔버를 안정화합니다. 그런 다음 경정맥 및 경동맥 튜브를 챔버의 각 측면에 연결합니다. 그런 다음 실리콘이 건조되는 동안 헤파린으로 채워진 60mil 잠금 주사기를 압력 변환기에 연결하고 기포가 없을 때까지 튜브와 챔버를 통해 100 USP 등급 헤파린을 실행합니다.

마우스를 마이크로플로우 챔버에 연결하기 전에 컴퓨터, 현미경 및 적절한 압력 기록 장치를 켜십시오. 소프트웨어가 설정되면 10주에서 12주 된 마우스를 확보합니다. 복부 위치에서 가위로 목 부위를 절개한 후 갑상선을 절개하여 기관과 혈관을 노출시킵니다.

경동맥이 완전히 노출될 때까지 경동맥을 청소합니다. 미주신경이 손상되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 경동맥 아래에 접힌 봉합사 조각의 구부러진 부분을 통과시키고 구부러진 부분에서 봉합사를 자릅니다.

따라서 동맥 아래에는 두 개의 봉합사가 있습니다. 각 봉합사를 조이지 않고 매듭으로 고리를 감은 다음 같은 방법으로 왼쪽 경정맥에 대한 봉합사를 배치합니다. 경정맥 봉합사가 제자리에 놓이면 마우스 ip에 1ml의 헤파린을 주입합니다.

주사 후 경동맥의 상부 봉합사를 조이고 동맥의 노출된 부분에 가능한 한 낮게 혈관 클램프를 놓습니다. 집게를 사용하여 상부 봉합사로 동맥을 잡은 다음 가는 마이크로 가위를 사용하여 상부 봉합사에 가까운 동맥 둘레의 약 8분의 1을 작게 절개합니다. 이제 동맥의 절개 부위를 튜브 홀더를 이용하여 경동맥 튜브를 삽입하고 하부 봉합사를 통해 경동맥 튜브를 통과시킵니다.

그런 다음 아래쪽 봉합사를 묶고 위쪽 봉합사를 묶습니다. 따라서 동맥은 튜브 주위를 밀봉하여 단단히 밀봉되도록 여러 매듭을 만듭니다. 경정맥 튜브에 대해 동일한 절차를 반복한 후 혈관 클램프를 뺀 후 경동맥 튜브의 혈관 클램프를 임시로 열어 흐름을 테스트합니다.

누출이 없으면 마우스를 현미경으로 이동하고 경동맥 및 경정맥 튜브를 마이크로플로우 챔버 튜브에 연결하여 마이크로플로우 챔버를 통한 백혈구의 롤링 속도를 기록합니다. 경동맥 클램프를 완전히 풀어 챔버를 채웁니다. 혈액이 3분에서 5분 동안 순환할 수 있도록 하여 혈류 상태가 안정되도록 합니다.

그 동안 챔버가 현미경 대물렌즈와 수평이 되고 가장자리가 화면의 비디오 녹화 창과 평행이 되도록 현미경 스테이지를 조정합니다. 다음으로, 실온의 물로 페트리 접시를 만든 다음 챔버를 통해 흐르는 세포가 보이도록 10배 침수 대물렌즈를 접시에 낮추고, 중간 생리학적 유압을 시뮬레이션하기 위해 적절하게 광도를 조정하고, 변환기가 30mm의 수은을 안정적으로 읽을 수 있도록 튜브의 클램프를 조정합니다. 그런 다음 시작을 눌러 백혈구 이동과 압력의 기록을 모두 시작하며, 첫 번째 타임 랩스는 챔버의 경정맥 끝 부근에서 진행되고 완료될 때까지 경동맥 말단을 향한 흐름에 역행합니다.

기록이 완료되면 주입 부위의 밸브를 닫아 혈류를 멈추고 원하는 경우 챔버를 다른 접착 분자로 코팅된 새 챔버로 교체합니다. 각 녹음 동안, 챔버 내에서는 상호작용하는 백혈구만이 분명하다. 예를 들어, 이러한 각 이미지에서 흰색 화살표는 관심 있는 접착 분자에 의해 포착되어 다른 자유 유동 세포 사이에서 챔버를 따라 굴러가는 개별 백혈구를 나타냅니다.

혈류 내에서 챔버 외부의 공통 인공물은 모든 이미지에서 큰 어두운 구체와 함께 볼 수 있으며, 이는 관찰자가 고정된 지점과 관련된 백혈구 움직임을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그래프는 데이터의 최종 플롯을 보여줍니다. 첫 번째 실험적 처리는 좌측으로의 이동으로 명백한 구름 속도가 감소하는 것을 관찰하였고, 두 번째 실험적 처리는 대조군 구름 속도와 비교하여 오른쪽으로 이동으로 나타나는 속도를 증가시키는 것이 관찰되었으며, 둘 다 이 절차와 함께

백혈구 및 vivo x Viva를 라벨링하는 것과 같은 다른 방법은 특정 백혈구 아형 질환 진행의 기여와 같은 다른 질문에 추가로 답변하는 데 사용할 수 있습니다.