Name: 의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 생리적 유동 조건에서 백혈구-내피 상호작용을 평가하는 ex vivo 미세유동 챔버 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 및 혈관생물학 연구에 활용됩니다.

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R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) 및 P30EY014104 :이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호에 따라 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 추가 지원은 매사추세츠 라이온스 안구 연구 기금 (KMC)와 (KMC에) 실명 예방 연구에서 특별 장학생 상에 의해 제공되었다.

동물의 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문 협회에 대한 연구에 따라 처리하고, 지침과 규정은 매사추세츠 눈과 귀 양호​​실 동물 관리위원회 규정. 실험 전날 : 유량 용기 용 튜브 1. 준비 <ol><li> 경정맥면을 준비하려면, 5cm 폴리에틸렌 튜브 다음 6cm 실리콘 튜브에 1cm PE10 폴리에틸렌 튜브를 연결합니다. 경동맥 측, 약 1.5 cm 떨어진 1cm 폴리에틸렌 튜브에서 6cm 실리콘 튜브 내의 T-튜브의 첨가 경정맥 측 비슷하게 준비 (도 1A, B). T 관을 삽입하기 위해, 필요하다면 미세 핀셋을 이용하여 실리콘 튜브를 넓혀. </li><li> 압력 변환기에 실리콘 튜브 10cm의 일단을 연결하는 것은 다음 경동맥 T (S)의 단부를 삽입다른 쪽 끝으로 IDE T-튜브. 사이트가 꽉 연결을 확인하고 무료 누출. 필요한 경우 튜브가 함께 맞는 곳을 통해 파라 필름의 작은 사각형 조각을 적용, 누설 (그림 1C)을 방지합니다. </li></ol> 2. 상공 회의소 코팅 <ol><li> 내피 표면 단백질 코팅을 준비 (예를 들어, P 셀렉틴, 간 부착 분자 -1 (ICAM-1), 혈관 세포 부착 단백질 -1 (VCAM-1)) 0.1 % BSA에서. 가이드 라인으로, 단백질의 1 μg의 200 μL에서 BSA는 4-5 챔버 코트에 충분하다. 내피 표면 코팅 단백질과 각 챔버 (0.04 X 0.4 X 50mm)를 주입, 25 G 바늘에 연결된 1 ML의 주사기를 사용하여. 4 ° C에서 하룻밤 15 ML 튜브에 코팅 챔버를 저장합니다. </li></ol> 실험 일 : 3. 상공 회의소 준​​비 <ol><li> 4 ° C에서 코팅 챔버를 제거하고 각 측면에 경정맥과 경동맥 튜브를 연결합니다. 접속 .. 물개조심스럽게 튜브가 챔버를 만나는 곳 이상의 파라 필름의 작은 사각형 조각을 늘려서 기능. 주사기를 사용, 0.1 % BSA (누출 검사)와 챔버와 튜브를 입력합니다. 45 분 동안 품어. </li><li> 접시의 양쪽에있는 노치를 절단하여 챔버를 보유하는 35mm 페트리 접시를 준비합니다. 홈에서 실을 안정; 다음 노치 사이트에있는 접시에 실을 부착하는 실리콘의 작은 방울을 사용합니다. 챔버는 현미경으로 조사하여 수준인지 확인합니다. 실리콘은 적어도 15 분 동안 건조시킵니다. </li><li> 헤파린 60 ml의 잠금 주사기를 입력하고 압력 변환기에 연결합니다. 트랜스 듀서, 실리콘 튜브, 및 T-관 : 경동맥 다음과 같은 순서로 튜브에 압력 변환기를 연결합니다. <ol><li> 트랜스 듀서와 연결을 확보하기 위해 T-튜브에 연결된 실리콘 튜브 사이에 1cm의 PE50을 사용합니다. 가압 클램프 (도 1d)를 통해 경동맥 실리콘 튜브를 통과한다. 100USP 헤파린 죽을 실행우 기포는 튜브와 챔버가 없을 때까지. </li></ol></li></ol> 4. 소프트웨어 설정 <ol><li> 소프트웨어를 준비하려면, 컴퓨터, 현미경, 개방 실험실 장치의 전원을 켭니다. 더블 라이카 애플리케이션 스위트 (LAS) (또는 동급)을 클릭하고 비디오 저장할 폴더를 준비 : 검색을 → 획득 → 영화 → 클립의 순서를 정의 (클립 = 15, 녹화 시간 = 30 초, 그리고 간격 = 15 초) 다음 확인하기 위해 &quot;+&quot;기호를 클릭합니다. </li><li> 유동 압력이 위의 단계 4.1에 기록 폴더에 파일 이름을 LabChart (또는 동급) 파일을 열고 좌표를 기록합니다. </li></ol> 5. 수술 <ol><li> 케타민 (60 ㎎ / kg)과 자일 라진 (6 ㎎ / kg)의 조합을 사용하여 8-10 주령 마우스를 마취하여 복강 내 (IP) 주사. 깊은 진정 페달 철수 반사의 손실로 5 ~ 10 분 이내에 얻을 수 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 이소 플루 란 경우필요에 따라 얼굴 마스크를 통해 전달을들 수있다. </li><li> 마취하는 동안, 케이지에서 온난화 패드를 배치하고 체온을 유지하기 위해 37 ° C로 설정. 적절한 마취가 확인되면, 안구 건조를 방지하기 위해 바시 트라 신 연고와 복부 위치와 코트에 눈을 마우스를 놓습니다. </li><li> 그 후, 면도날을 사용하여 절개 부위에서 털을 면도하고 철저 알코올 현장 청소. </li><li> 일단 완전 마취하면 테이프 복부 위치에 마우스를 유지하는 동물을 고정. 가위로 목 영역을 노출하고 기관 및 선박 (그림 2A)를 노출하는 갑상선을 제거합니다. </li><li> 완전히 미주 신경 (그림 2B)을 손상하지 않도록주의하면서 노출 될 때까지 경동맥를 청소합니다. 봉합사의 조각을 접어 후 경동맥 아래에 봉합의 2 개는 지금 거기 그래서 굽힘 절단 경동맥 아래 벤드를 전달합니다. 루프 매듭으로 각 봉합 (를 체결하지노트). </li><li> 동일한 방식으로 (도 2D)에 봉합사를 제조 좌측 경정맥 (도 2C)을 노출시키기 위해 동일한 절차를 반복한다. </li><li> 마우스 혈관에 튜브를 연결합니다. <ol><li> 헤파린 IP 1 ㎖를 주입하여 마우스를 Heparinize. </li><li> 경동맥에 상단 봉합을 조입니다. 이 경동맥 (그림 3A)에 갈 수 낮은 선박 클램프를 놓습니다. microscissors (그림 3B)를 사용하여, 작은 절개, 동맥의 둘레의 약 1/8을 상단 봉합에 의한 동맥을 잡고 수 있도록 집게를 사용합니다. </li><li> 상부 봉합사 및 동맥 내로 만들어진 절개를 통하여 제 매듭 경동맥 튜빙 합격. 동맥 (도 3C를 여러 매듭이 단단히 밀착을 보장해야한다) 튜브 주위에 밀봉되도록 낮은 봉합을 묶어. </li><li> (경정맥 관을 삽입하기위한 용기를 동일한 절차를 반복클램프는 경정맥 측면에 대한 필요하지 않습니다 그림 3D)를. </li><li> 선박 클램프를 풀어 흐름을 테스트합니다. 누출이없는 경우 현미경으로 마우스를 이동하고 챔버 튜브 (수술 과정을 보여주는 부착 된 비디오 참조) 경동맥 튜브 및 경정맥을 연결합니다. </li></ol></li></ol> 6. 녹음 회전 속도 <ol><li> 마우스 순환 시스템 회로를 만들고, 챔버를 채우기 위해 경동맥 클램프를 연다. 흐름 조건이 안정되도록 피가 3 ~ 5 분 동안 순환 할 수 있습니다. 챔버는 현미경 대물 한 단부에서 다른 레벨이고 가장자리는 화면에 영상 녹화 윈도우로 평행이되도​​록 3-5 분의 대기 기간 동안, 현미경 스테이지를 조절. </li><li> 챔버를 통해 흐르는 셀이 보이도록 한 다음 접시에 10X 수침 대물 낮은 유리 물 챔버를 포함하는 수정 된 페트리 접시를 채운다.광 강도는 셀의 적절한 시청 조절 될 필요가있다. 일반적으로 낮은 강도가 더 낫다. </li><li> 트랜스 듀서는 중간 생리 흐름 압력에 상관, 꾸준한 30mm 수은을 읽도록하거나, 원하는대로 튜브에 클램프를 조정합니다. </li><li> 를 눌러 비디오 및 경정맥 끝 가까이에 완료 될 때까지 경동맥 끝쪽으로의 흐름에 대해 이동 처음 경과와 압력을 모두 기록 시작하기 위해 &quot;시작&quot;. 주의 : 다른 접착 분자를 이용한 여러 코팅 조건은 다중 챔버를 사용하여 동일한 마우스에서 연구 될 수있다. 오직 하나의 챔버는 한번에 기록된다. <ol><li> 기록이 완료되면, 혈류 정지, 입력 사이트 밸브를 닫는다. 챔버를 제거하고 다른 손에 한 손으로 미세 집게와 홈 집게를 사용하여 회로 (다른 접착 분자로 코팅 된) 새로운 실을 맞습니다. 단계에 설명 된대로 새로운 실에 대한 기록 재개6.1-6.4. </li></ol></li><li> CO에 의해 실험의 끝에서 척수 탈구 다음이 질식을 마우스를 모두 안락사. 절차는, 따라서, 마우스는 실험의 끝에 척수 전위 단자 의해 안락사된다. </li></ol> 7. 결과 해석 <ol><li> 기록 된 데이터가 ImageJ에 소프트웨어 (23)은 &quot;M TrackJ&quot;플러그인을 사용하여 분석합니다. </li><li> 파일 → 가져 오기 →의 AVI → 그레이 스케일로 변환하여 그레이 스케일로 파일을 변환합니다. </li><li> 글로벌 → 프레임 간격 (i)를 입력 재산 → → 선택 → 이미지로 프레임을 표준화. (J 비디오 이미지 윈도우의 상부 모서리에 도시)에 하나의 비디오 프레임의 개수에 의해 비디오 전체 기간 (통상 30 초)을 나누어 프레임 간격을 계산한다. </li><li> M TrackJ가 → 백혈구를 선택 트랙을 추가 → → 선택 플러그인하여 각 백혈구의 흐름을 측정→ (15)에 대한 각각의 프레임을 추적 - 20 초 → 병합. </li><li> 보기에서 모든 백혈구 단계를 반복 7.4. </li><li> 두 개의 열 복사 → M TrakJ의 모든 표시 → 선택 측정하여 백혈구의 평균 압연 속도를 결정 스프레드 시트로 추적합니다. &quot;V 의미&quot;열 픽셀 / 초 단위로 측정 백혈구 롤링입니다. 2/3로 나누어 μm의 / 초로 변환합니다. </li><li> 스프레드 시트로 압력 데이터 하이라이트 및 수출을 분석하고 다음과 같은 계산을 수행하려면 ΔP (mmHg로)와 t (다인 / cm 2) 각 실험군 간의 비교. 계산하면, 그래프에 대한 프리즘 소프트웨어로 데이터를 복사합니다. </li></ol>

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저자(LM, HS 및 KMC)는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

백혈구 보충 프로세스는 염증 반응에서 중요한 단계이다; 이것은 그들이 그들의 작동 자 기능을 발휘할 수있는 표적 조직쪽으로 순환계에서 백혈구의 이동을 수반한다. 백혈구 보충은 죽상 경화성 플라크, 심근 경색, 허혈 / 재관류 및 이식 수술 일뿐만 아니라, 여러 CNS 관련 신경 염증성 질환 같은 염증성 10-12,20,24,25 다양한 조건에서 적분된다. 백혈구 보충 스팬은 autoperfused 마이크로 플로우 챔버는 조사자 백혈구 이주 역학을 연구 할 수있는 능력을 허용하는 필수 불가결 한 도구를 제공하는 질병 상태의 다양성을 고려. 지난 수십 년간, 시험 관내 검정법 다양한 백혈구 세포 유착 (26)의 동역학을 연구하기 위해 개발되었다. 불행히도, 이러한 모든 분석의 추출을 필요혈액에서 백혈구, 기계 활성화를 소개합니다. 생체 내 환경에 근접하게, 적응은 전혈 시료를 수집하고 혈역학 유동 조건 (16, 17)를 제어하도록 하였다. 여기서는 마우스 순환 시스템으로 코팅 챔버를 연결하여 필드 이전 발전을 연장한다. 우리는 생리적 범위로 혈액의 흐름을 조절하고 백혈구 롤링의 역학을 연구 할 수 있습니다. 코팅 챔버는 우리에게 특정 접착 분자와 백혈구의 상호 작용을 연구 할 수있는 기능을 제공합니다. 시스템이 살아있는 마우스에 의해 조작 수단으로서 기능하기 때문에,보다 밀접 우리 면역 마우스 모델의 다양한 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 연구 할 수 있도록, 자연 환경을 모방. 또한,이 시스템은 우리가 제공되는 다중 유전자 마우스 모델을 활용할 수있다. 시스템이 완전히 생체 환경을 복제하지 않지만, 그것은보고 특정을 연구하는 플랫폼을 제공한다생리적 조건에서 백혈구의 C 원소, 이전에 가능하지 않았다 묘기. 이 걸음 더 가까이 더 생리적 환경에 우리를 데려 간다하더라도 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 우리가 실 코팅으로 제한됩니다 백혈구 상호 작용의 특정 요소를 평가하는 유일한 수 있도록 완전히 혈관의 복잡한 3D 매트릭스를 복제하지 않습니다. 게다가,주의 깊게 프로토콜에서 언급 된 모든 단계에 따라 마우스의 순환하는 폐쇄 시스템을 확인해야한다. 기포의 도입은 크게 실험의 재현성 및 정확성에 영향을 미칠 것이다. 우리는 백혈구 롤링 역학을 평가 Autoperfused 마이크로 플로우 챔버의 사용을 설명하지만 절차는 다양한 질환을 연구 수사관 개인화 될 가능성이있다. 예를 들어, 암 세포는 백혈구 공유 공통 인테그린 많은 표현함으로써 전이. 나머지 공부g 더 가깝게 우리의 지식에 도움이 될 수있는 생체 내 환경을 모방 설정 및 특정 암 세포 침입의 가능성이 자연 예측에서의 롤링 역학. 하나의 가능한 접근법은 GFP를 발현하는 암세포의 롤링 역학을 추적하는 유량 용기 분석과 함께, 예컨대 27과 GFP 암세포에 대해 라벨링 기술을 결합 할 수있다. 그것은이 절차가 유전자 변형 마우스 및 질병 모델과 함께 다른 실험실에서 사용하기 위해 수정 방식을 볼 수 흥미로운 일이 될 것이다 물질의 다양한 챔버를 코팅과 같은 마우스에 여러 개의 챔버를 연결의 유연성을 감안할 때. 우리가 여기에서 설명하는 기술은 오직 연구자의 창의성에 의해 제한된다 훨씬 광범위한 응용 가능성에 감동.

염증은 손상에 대한 신체의 보편적 인 반응이다 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템 기능에 중요한 단계입니다. 부상 및 / 또는 염증성 자극에 응답하여, 특정 내피 세포 부착 분자를 상향 조절; 이것은 주로 후 모세관 세정맥에, 미세 혈관 내피 세포를 통해 혈관 외 유출을 백혈구에 이르게. 이 과정은 내피 세포에 혈류의 자유 흐르는 백혈구의 테 더링으로 시작합니다. 안정 압연 및 다시 윤회와 세포 독성 제의 분비로 연결 백혈구의 밀착성이가 1,2 테 더링 따릅니다. 셀렉틴은 계단식 3-5의 초기 단계를 매개하는 것으로 알려져있다; 인테그린은 회사의 부착과 윤회 1,6-8의 이후 단계에 대한 책임이 있습니다. 증거의 성장 몸은 허혈 재관류 손상 동물 모델에서 백혈구와 내피 세포 부착 분자가 중요한 역할을 제안합니다천식, 건선, 다발성 경화증, 및 연령 관련 황반 변성증 9-12. 이러한 조건 하에서, 염증 반응은 건강한 조직의 파괴의 결과, 자신의 몸을 공격하는 오 분사된다. (예를 들면 비 스테로이드 성 항염증제, 코르티코 스테로이드 또는 다른 화학 요법 제와 같은) 기존의 항염증제는 장기 사용 (13)으로 심각한 부작용의 위험을 수행한다. 따라서, 비 - 독성을 유지하면서 14 궁극적으로 목적하는 항 염증 효과가 대상이 될 수있는 질병 특정한 분자를 식별하는 능력을 가진 적절한 도구를 가지고 큰 관심사이다. 이러한 정적 백혈구 유착 검정 시험 관내 방법으로서 기존 빠르면 1976 15로 하였다. 병류 챔버는 제 1 유동 조건에서 백혈구의 내피 상호 작용을 연구하기 위해 1987 년에 시험 관내에서 사용 하였다. 이들 실험에서, 구호 물자를 자극N 정맥혈에서 다형 핵 백혈구 (백혈구)는 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)의 단층을 통해 관류 하였다. 혈역학 유동 조건에 대해 제어하기 위해 하버드 장치 주사기 펌프 (16)를 사용 하였다. 대안 적으로, 인공 백혈구 분리를 피하기 위해, 전혈 고정화 부착 분자 (17)로 코팅 된 유리 용기와 조합하여 사용 하였다. 백혈구 자극을 방지하고 기계적으로 대략적인 생리적 조건에서 부착 분자와의 상호 작용을 연구하기 위해, 생체 autoperfused, extracorporal은, 동정맥 회로 (16)를 개발 하였다. 이 회로에서 혈액 단일 또는 공동 고정화 부착 분자로 코팅 된 유리 마이크로 플로우 챔버 내에 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 가능하게 마취 살아있는 마우스의 우측 총 경동맥과 좌측 외부 경정맥 사이에 흐른다. 이 정기적 복용하기에 가장 큰 장점m은 염증 경로가 직접 또는 간접적으로 조작하는 유전자 조작 된 마우스를 사용하는 능력이다. 또한, 유동 조건 하에서, 외부의 자유 활성 염증, 백혈구 부착 분자의 격리 기여를 정확하게 할 수있는 능력이있다. 유동 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 애플리케이션은 동맥 또는 정맥 시스템 18-22를 모방하는 전단력의 실험 변동 폭넓게 제공한다. 여기에서 우리는 훌륭한 세부 사항에 생체 autoperfused 마이크로 플로우 챔버 분석의 준비와 성능에 관한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로 유리 챔버 0.4 x 0.04 x 50mm</td><td>VitroCom</td><td>2540-050</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE 60</td><td>Fisher Scientific</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 002</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15A</td><td></td></tr><tr><td>Y 튜브</td><td>값 플라스틱</td><td>Y210-6</td><td></td></tr><tr><td>T 튜브</td><td>값 플라스틱</td><td>T410-6</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 젤</td><td>철물점 - Home Depo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>코닝</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>파라 필름</td><td>페치 니 플라스틱 포장</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>튜브 홀더</td><td>FST</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>클램프 애플리케이터</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>혈관 클램프</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합사</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-1215-6/0</td><td></td></tr><tr><td>25 x 1 G 바늘</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 x 1/2 G 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 100 USP 단위/ml</td><td>병원 약국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 vivo autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

백혈구 - 내피 상호 작용은 급성 및 만성 염증의 초기에 중요한 이벤트이며, 조절 곤란하면, 영구 병리학 적 손상으로 이어지는 조직 손상을 중재 할 수 있습니다. 기존의 종래 분석법은 혈액으로부터 백혈구 추출 후 백혈구 부착 분자의 분석을 허용한다. 이는 말초 혈액 백혈구 (말초 혈액 림프구)가 차례로 연구 결과에 영향을 미치는 말초 혈액 림프구를 자극 할 수있는 분석을위한 준비를하기 전에 몇 가지 단계를 받아야하는 혈액이 필요합니다. autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은, 그러나, 과학자들은 코팅 챔버를 조작하는 자유를하면서 라이브 마우스의 전신 흐름을 사용하여 기능 조절 장애 초기 백혈구를 연구 할 수 있습니다. 질병 모델을 통해, 백혈구 부착 분자의 기능적 발현을 평가할 수있다 고정화 내피 세포 부착 분자 생체 코팅 유리 마이크로 챔버 정량화. 이 모델에서 혈액 흐름챔버 내의 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 허용 우측 총 경동맥과 마취 살아있는 마우스의 왼쪽 외부 경정맥 사이. 실시간 분석 실험은 생체 내에 현미경의 도움뿐만 아니라 하버드 장치 압력 장치에 의해 달성된다. 유리 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 어플리케이션의 사이에 유사한 생리 학적 실험 유량 조건을 허용한다. 백혈구 롤링 속도는 주요 결과이며, 건강 오픈 액세스 소프트웨어 ImageJ에 국립 연구소를 사용하여 측정한다. 요약하면, autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은 백혈구를 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 최적의 생리 학적 환경을 제공하고 염증을 연구 할 때 연구자는 정확한 결론을 도출 할 수 있습니다.

각 기록 만 상호 작용 백혈구 동안 챔버에 분명하다. 대표적인 실험의 결과는도 4에서 볼 수있다. 흰색 화살표 관심 분자 접착에 의해 캡처하고, 혈류 내의 다른 자유 유동 챔버들 사이를 따라 굴러 개별 백혈구 가리. 챔버 외부의 일반적인 이슈는 모든 이미지에 큰 어두운 분야로 볼 수있다. 어두운 분야에서는 독자가 고정 점과 관련하여, 백혈구 이동을 이해할 도움. 22 초의 기간에 걸쳐 발전 백혈구는 관련 분야에서 볼 수있다. 동 도면에 그래프 TX1 압연 속도 (좌측 시프트)을 감소시키고 TX2는 대조군에 비해 속도 (우측 시프트)을 증가 최종 데이터 그래프를 보여준다. 0 "/&gt; 그림 1 : 유량 용기 용 튜브의 준비. (A) 도구 실리콘은 002, Y 튜브, T 관, 35mm 페트리 접시, 미세 집게, 미세 가위 튜브, 튜브 및 챔버 어셈블리 (마이크로 유리 챔버 0.4 × 0.04 × 50 mm의 폴리에틸렌 튜브 PE10, 폴리에틸렌 튜브 PE60에 필요한, 튜브 홀더, 혈관 클램프 7-0 실크 봉합사. 코팅 챔버를 통해 마우스 혈액의 흐름을 다시 향하게하는 경동맥과 경정맥 튜빙 (B)의 제조. (C) 압력 변환기에 경동맥 연결 튜브. (D) 혈액의 흐름의 속도를 조정할 수있는 클램프를 통해 트랜스 듀서에서 튜브를 전달합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700"> 그림 2.. 경동맥과 경정맥을 노출하기 (A)을 조심스럽게 황색 점선 ((B) 기관을 노출 넥 영역을 잘라 봉합 부분이 용기의 아래에 전달 될 ​​수 있도록 우측 경동맥 청소 라인) 경동맥을 설명합니다. 봉합사의 조각 (노란 점선 라인은 경정맥을 설명) 선박에서 통과 될 수 있도록 (C)이 왼쪽 경정맥를 청소합니다. (D) 느슨하게 상부 및 하부 지역에서 봉합을 묶어 정렬 경동맥과 경정맥 (화살표 용기의 상부 및 하부 영역을 표시)의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700"> 그림 3 : 튜브를 연결하기 t하기그는 동맥 및 경정맥을 경동맥. (A) 경동맥에 위 매듭을 조여와 하부 매듭 아래의 클램프를 배치합니다. (B)를 microscissors를 사용하여 경동맥에 작은 절개를, 약 1/8 둘레 (점선 노란색 원은 절개를 나타낸다). ( C)는 경동맥에 튜브를 삽입하고 두 개 이상의 봉합 (녹색 점선 튜브와 노란색 점선 경동맥을 보여줍니다) 고정합니다. (D)을 마찬가지로 녹색 점선은 튜브와를 보여줍니다 (경정맥에 튜브를 삽입 노란색 점선 경정맥). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700"> 그림 4 : 흐름 참을 통해 압 백혈구의 대표적인 시간 코스BER (스케일 바 = 100 ㎛) (흰색 화살촉 롤링 백혈구 지적이). 그래프는 그래프 프로그램으로 보낸 후에 대표적인 결과를 보여줍니다 (TX1과 TX2는 실험 치료 그룹이며, CTR은 대조군)입니다. TX2는 속도 롤링 백혈구의 증가를 반영 우측 시프트 리드하면서 TX1은 속도 및 미처리 군 (CTR)와 비교하여 그래프의 좌측 시프트 압연 백혈구의 감소로 이어지는 느리게 백혈구하는 치료를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">를 클릭하세요 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a>

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적 흐름 조건에서 내피 접착 분자와 백혈구 상호 작용을 평가하기 위해 생체 외 동정맥 폐쇄 회로를 만드는 것입니다. 이는 먼저 얇은 유리 챔버를 관심 있는 내피 접착 분자로 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 폴리에틸렌과 실리콘 튜브를 챔버에 연결한 다음 수술을 통해 마우스에 연결합니다.다음으로 경동맥에서 나온 혈액이 튜브를 통해 흐를 수 있습니다. 그리고 천연 백혈구와 코팅된 유리 챔버의 후속 상호 작용이 실시간으로 기록됩니다. 궁극적으로, 고정된 접착 분자와 상호 작용할 때 백혈구의 변위 및 롤링 속도에 대한 다양한 처리의 효과는 시간이 지남에 따라 계산될 수 있습니다.프로 세포 분석 분석과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 생리학적 흐름 조건에서 내피 분자와 백혈구 상호 작용을 평가할 수 있다는 것입니다. 실험 전날 1cm의 PE 10 폴리에틸렌 튜브를 6cm의 실리콘 튜브에 연결한 다음 5cm의 폴리에틸렌 튜브를 연결합니다. 경동맥 쪽을 위해 동물의 경정맥 쪽에 대한 튜빙 설정을 준비하려면, 1cm 폴리에틸렌 튜빙에서 약 1.5cm 떨어진 6cm 실리콘 튜빙 내에 TTU를 추가하여 방금 설명한 대로 튜빙을 연결합니다.다음으로, 10cm 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝을 압력 변환기에 연결하고 경동맥 쪽 T 튜브의 T 끝을 다른 쪽 끝에 삽입합니다. 연결 사이트가 단단하고 누출이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 25게이지 바늘에 연결된 1밀리리터 주사기를 사용하여 각 마이크로플로우 챔버에 새로 준비된 관심 내피 표면 코팅 단백질을 주입하고 코팅된 챔버를 섭씨 4도의 15ml 튜브에 넣고 다음 날 하룻밤 동안 보관합니다.경정맥 및 경동맥 튜브를 마이크로플로우 챔버에 연결하려면 챔버의 각 측면에 1cm 실리콘 튜브를 연결한 다음 튜브가 챔버와 만나는 상태로 늘어난 작은 직사각형 파라마 조각으로 연결을 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 챔버와 튜브를 0.1% 소 혈청 알부민으로 채웁니다. 그런 다음 누출을 확인한 후 챔버에서 45 분 동안 배양합니다.배양이 끝날 무렵의 실온에서 각 노치에서 작은 실리콘 방울로 페트리 접시에 마이크로플로우 챔버를 안정화합니다. 그런 다음 경정맥 및 경동맥 튜브를 챔버의 각 측면에 연결합니다. 그런 다음 실리콘이 건조되는 동안 헤파린으로 채워진 60mil 잠금 주사기를 압력 변환기에 연결하고 기포가 없을 때까지 튜브와 챔버를 통해 100 USP 등급 헤파린을 실행합니다.마우스를 마이크로플로우 챔버에 연결하기 전에 컴퓨터, 현미경 및 적절한 압력 기록 장치를 켜십시오. 소프트웨어가 설정되면 10주에서 12주 된 마우스를 확보합니다. 복부 위치에서 가위로 목 부위를 절개한 후 갑상선을 절개하여 기관과 혈관을 노출시킵니다.경동맥이 완전히 노출될 때까지 경동맥을 청소합니다. 미주신경이 손상되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 경동맥 아래에 접힌 봉합사 조각의 구부러진 부분을 통과시키고 구부러진 부분에서 봉합사를 자릅니다.따라서 동맥 아래에는 두 개의 봉합사가 있습니다. 각 봉합사를 조이지 않고 매듭으로 고리를 감은 다음 같은 방법으로 왼쪽 경정맥에 대한 봉합사를 배치합니다. 경정맥 봉합사가 제자리에 놓이면 마우스 ip에 1ml의 헤파린을 주입합니다.주사 후 경동맥의 상부 봉합사를 조이고 동맥의 노출된 부분에 가능한 한 낮게 혈관 클램프를 놓습니다. 집게를 사용하여 상부 봉합사로 동맥을 잡은 다음 가는 마이크로 가위를 사용하여 상부 봉합사에 가까운 동맥 둘레의 약 8분의 1을 작게 절개합니다. 이제 동맥의 절개 부위를 튜브 홀더를 이용하여 경동맥 튜브를 삽입하고 하부 봉합사를 통해 경동맥 튜브를 통과시킵니다.그런 다음 아래쪽 봉합사를 묶고 위쪽 봉합사를 묶습니다. 따라서 동맥은 튜브 주위를 밀봉하여 단단히 밀봉되도록 여러 매듭을 만듭니다. 경정맥 튜브에 대해 동일한 절차를 반복한 후 혈관 클램프를 뺀 후 경동맥 튜브의 혈관 클램프를 임시로 열어 흐름을 테스트합니다.누출이 없으면 마우스를 현미경으로 이동하고 경동맥 및 경정맥 튜브를 마이크로플로우 챔버 튜브에 연결하여 마이크로플로우 챔버를 통한 백혈구의 롤링 속도를 기록합니다. 경동맥 클램프를 완전히 풀어 챔버를 채웁니다. 혈액이 3분에서 5분 동안 순환할 수 있도록 하여 혈류 상태가 안정되도록 합니다.그 동안 챔버가 현미경 대물렌즈와 수평이 되고 가장자리가 화면의 비디오 녹화 창과 평행이 되도록 현미경 스테이지를 조정합니다. 다음으로, 실온의 물로 페트리 접시를 만든 다음 챔버를 통해 흐르는 세포가 보이도록 10배 침수 대물렌즈를 접시에 낮추고, 중간 생리학적 유압을 시뮬레이션하기 위해 적절하게 광도를 조정하고, 변환기가 30mm의 수은을 안정적으로 읽을 수 있도록 튜브의 클램프를 조정합니다. 그런 다음 시작을 눌러 백혈구 이동과 압력의 기록을 모두 시작하며, 첫 번째 타임 랩스는 챔버의 경정맥 끝 부근에서 진행되고 완료될 때까지 경동맥 말단을 향한 흐름에 역행합니다.기록이 완료되면 주입 부위의 밸브를 닫아 혈류를 멈추고 원하는 경우 챔버를 다른 접착 분자로 코팅된 새 챔버로 교체합니다. 각 녹음 동안, 챔버 내에서는 상호작용하는 백혈구만이 분명하다. 예를 들어, 이러한 각 이미지에서 흰색 화살표는 관심 있는 접착 분자에 의해 포착되어 다른 자유 유동 세포 사이에서 챔버를 따라 굴러가는 개별 백혈구를 나타냅니다.혈류 내에서 챔버 외부의 공통 인공물은 모든 이미지에서 큰 어두운 구체와 함께 볼 수 있으며, 이는 관찰자가 고정된 지점과 관련된 백혈구 움직임을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그래프는 데이터의 최종 플롯을 보여줍니다. 첫 번째 실험적 처리는 좌측으로의 이동으로 명백한 구름 속도가 감소하는 것을 관찰하였고, 두 번째 실험적 처리는 대조군 구름 속도와 비교하여 오른쪽으로 이동으로 나타나는 속도를 증가시키는 것이 관찰되었으며, 둘 다 이 절차와 함께 관찰되었습니다.백혈구 및 vivo x Viva를 라벨링하는 것과 같은 다른 방법은 특정 백혈구 아형 질환 진행의 기여와 같은 다른 질문에 추가로 답변하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

배우세요 생리적 유동 조건에서 백혈구-내피 상호작용을 평가하는 ex vivo 미세유동 챔버 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 및 혈관생물학 연구에 활용됩니다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

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