형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체
2014년 10월 31일
여기에서는 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 박테리아 전사체 및 RNA 처리에서 전사 시작점을 결정하기 위한 형광 기반 프라이머 확장 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 형광 프라이머 확장 반응을 사용하여 박테리아로부터 생체 내 전사 시작점과 RNA 절단 부위를 식별하는 것입니다. 이것은 먼저 대장균 또는 S aria와 같은 박테리아를 성장시키고 RNA 분자를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, RNA는 특정 형광 프라이머와 역전사효소를 사용하여 역전사되어 CD NA 단편을 생성합니다.
그런 다음 박테리아 세포에서 DNA 또는 플라스미드를 분리하고 염기서열분석 키트를 사용하여 DNA 템플릿에서 형광 Sanger 염기서열분석 사다리를 만듭니다. 마지막으로, CDNA 단편과 염기서열분석 래더를 분리하고 자동화된 겔 염기서열분석기를 사용하여 폴리아크릴아미드 겔에서 동시에 검출하고 서로 비교합니다. 궁극적으로, 형광 프라이머 확장은 RNA 분자의 5개 프라임 말단을 하나의 염기 분해능까지 매핑하는 데 사용됩니다.
인종 또는 방사능 기반 1차 확장과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전기영동 중에 검출이 동시에 발생하기 때문에 RNA 분자의 끝에서 5개를 빠르게 식별할 수 있다는 것입니다. 감도는 적색 활동 기반 1차 확장과 유사하지만 실험실 직원이 속도 활동 방사선 안전 교육 없이도 이 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 형광 1차 확장 기술을 사용하여 독소 항독소 시스템의 RNA 구성 요소를 조사하는 데 성공했습니다.
이 절차를 시연하는 포도상구균은 제 연구실의 대학원생인 Christopher Schuster가 맡을 것입니다. 높은 수율의 RNA를 준비하고 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머를 설계한 후 먼저 열순환기를 섭씨 95도로 예열하여 프라이머 확장 반응을 수행합니다. 각 RNA 샘플에 대해 A PCR 튜브에 다음 화합물을 혼합하고 섭씨 95도에서 1분 동안 샘플을 변성시킵니다.
그런 다음 튜브를 얼음 위에 5분 동안 올려 놓고 프라이머와 RNA를 혼성화합니다. 그런 다음 PCR 기계를 섭씨 47도로 설정합니다. 그런 다음 여기에 설명된 대로 역전사 마스터 믹스를 준비합니다.
각 혼성화된 RNA 샘플에 4마이크로리터, 역전사 마스터 믹스를 추가하고 섭씨 47도에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 반응을 중지하려면 샘플을 섭씨 95도에서 2분 동안 가열합니다. 그런 다음 6마이크로리터의 형태 아미드 로딩 염료를 첨가하고 하룻밤 또는 영하 20도의 어둠 속에서 최대 2주 동안 보관합니다.
게놈 DNA 또는 플라스미드를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 약 10 - 15 마이크로그램의 게놈 DNA 12 마이크로리터 또는 100 - 500 나노그램의 플라스미드 DNA를 1 마이크로리터의 형광 표지된 프라이머 및 1 마이크로리터의 DMSO 피펫과 혼합하여 Sanger 염기서열분석 반응을 조립합니다. 각 염기서열분석 혼합물 1마이크로리터를 사전 라벨링된 별도의 PCR 튜브에 넣습니다. 그런 다음 각 튜브에 D-N-A-D-M-S-O 프라이머 믹스 3마이크로리터를 추가합니다.
PCR 기계를 다음 프로그램으로 설정하고 샘플을amp기계에 넣은 후 실행하십시오. 실행 후 샘플에 6마이크로리터의 로딩 염료를 첨가한 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. 깨끗하고 먼지가 없는 25cm 플레이트를 사용하여 즉시 또는 섭씨 영하 20도에서 장기간 사용하는 경우 후면 유리판에 0.25mm 스페이서를 놓고 유리판의 홈이 있는 끝과 레일 입구 파일럿이 모두 위를 향하도록 상단의 노치가 있는 유리판을 내립니다.
유리판의 양쪽에 젤 레일을 부착하고 손잡이를 가볍게 조여 젤을 캐스팅합니다. 여기에 나열된 화합물을 비커와 교반 막대에 결합하고 자석 교반 플레이트에 놓습니다. PS를 추가하고 팀을 이룬 직후 50ml 주사기를 사용하여 아크릴아마이드 용액을 취하고 팁에 0.45나노미터 필터를 놓습니다.
끼워넣은 플레이트를 10-20도 각도로 놓고 주사기 팁을 한쪽에서 다른 쪽으로 계속 이동하면서 유리판 사이에 젤 용액을 천천히 분배합니다. 젤 용액이 유리판의 하단 끝과 만나면 분배를 중지하십시오. 버블 훅을 사용하여 형성되었을 수 있는 거품을 제거합니다.
그런 다음 노치가 있는 끝의 유리판 사이에 젤 포켓 스페이서를 밀어 넣고 젤 용액에 담그고 주판을 부착하여 고정하고 상부 레일 나사를 가볍게 조이고 젤이 1-2시간 동안 굳도록 합니다. 주조 플레이트와 포켓 스페이서를 제거하기 전에 증류수 탈이온수를 사용하여 소금 주머니와 젤 잔여물을 청소하여 젤을 실행합니다. 버퍼 탱크 홀더를 전면 유리판의 젤 레일에 밀어 넣고 손잡이를 조입니다.
자동 젤 이미저의 하단 젤 탱크에 젤을 가열판에 놓고 레일 엔트리 파일럿을 장치 브래킷에 밀어 넣어 고정합니다. 하나의 XTBE 완충액을 사용하여 상부 및 하부 겔 완충액을 채웁니다. 그런 다음 하단 버퍼 챔버를 닫고 전원 코드를 사용하여 상단 버퍼 챔버를 전원에 연결합니다.
젤 주머니에 소금이 있으면 버퍼를 사용하여 주머니에 반복적으로 피펫팅하여 청소하십시오. 그런 다음 상단 버퍼 뚜껑을 사용하여 상단 버퍼 탱크 챔버를 닫습니다. 이미저와 컴퓨터를 켜고 텍스트 프로토콜에 따라 기본 이미지 IR 데이터 수집 소프트웨어를 시작한 후 여기에 나열된 설정을 사용하여 스캐너 제어를 설정합니다.
다음으로, 전압 켜기를 선택하고 enter를 눌러 빈 젤을 20분 동안 미리 실행합니다. 그 동안 PCR 기계를 사용하여 염기서열분석 사다리와 프라이머 확장 제품을 섭씨 90도까지 2분 동안 가열합니다.얼음에서 냉각하기 전에 전기영동을 중지하고 자동화된 겔 시퀀서를 열고 상부 버퍼 탱크 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 유리판 사이와 상어 이빨과 함께 상어 이빨 빗을 삽입합니다.
겔 피펫을 1-2 마이크로 리터의 프라이머 확장 제품 또는 염기서열분석 사다리 반응을 각 젤 포켓에 약간 뚫습니다. 빈 주머니에 사용할 수 있습니다. 로딩 염료를 사용하여 채우십시오.일관되지 않은 작동 동작을 방지하고 버퍼 탱크와 겔 시퀀서의 도어를 닫으십시오.
그런 다음 레이저에 대해 전압 켜기를 선택하고 스캔 상태를 켜고 Enter 키를 눌러 전기 영동을 시작합니다. 관심 영역이 레이저를 통과하면 다음과 같이 전기영동을 중지합니다. 프라이머 확장 반응은 관심 전사체의 전사 시작점 또는 TSP를 결정하는 데 사용할 수 있으며 프로모터 영역을 추론하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 예에서 MPE mRNA의 TSP는 이전에 발표된 데이터와 일치하는 G로 식별되었습니다. 마이너스 35 및 마이너스 10 프로모터 요소는 T-T-G-T-A-A 및 T-A-G-A-C-T로 추론되었으며, 이러한 모티프는 mRNA 절단 산물을 식별하기 위해 프라이머 확장을 사용하여 각 합의 서열의 염기와만 다릅니다. RNA Ybi SEC two에 의한 START co에 가까운 절단의 RNA 매핑은 RNA가 존재하지 않거나 비활성 상태일 때 RNA 활성의 결과로 시작 co에 가깝게 프라이머 확장 생성물이 형성되지 않을 때 여기에 표시됩니다.
그러나 이 그림의 시작 코트 바로 하류에 나타나는 두 개의 강한 띠는 개별 띠의 식별을 방해하는 역전사 반응에서 과도한 RNA로 인해 실패한 프라이머 확장 실험을 보여줍니다. 이는 주형 RNA의 총량이 관심 RNA의 풍부함에 맞게 조정되어야 함을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 약간의 연습을 통해 형광 프라이머와 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 전사 시작점과 RNA 절단 부위를 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 방법은 빠르고 쉽게 수행할 수 있습니다. 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 기사는 세균 전사체에서 전사 시작점과 RNA 분해 부위를 생체 내에서 식별하기 위한 형광 기반 프라이머 확장 방법을 설명합니다. 이 방법은 검출 및 분석을 위해 자동화된 겔 시퀀서를 활용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 분자 생물학
- 유전학
배경
- 전사 시작점을 이해하는 것은 유전자 발현 연구에 매우 중요합니다.
- 형광 프라이머는 RNA 분자의 검출을 향상시킵니다.
- 자동화된 겔 시퀀싱은 RNA 분석의 효율성을 향상시킵니다.
- 이 방법은 다양한 세균 종에 적용 가능합니다.
연구 목적
- RNA 분자의 5' 말단을 고해상도로 매핑합니다.
- 생체 내 RNA 처리 이벤트를 식별합니다.
- 세균 전사 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
사용된 방법
- 세균 배양의 성장(예: E. coli, S. aria).
- 세균 세포에서 RNA 분자의 분리.
- 특정 형광 프라이머를 사용한 역전사.
- 형광 Sanger 시퀀싱 래더 생성.
주요 결과
- 전사 시작점의 성공적인 매핑.
- RNA 분해 부위의 식별.
- 자동화된 시퀀싱을 사용한 고해상도 검출의 시연.
- 다양한 세균 종에 걸친 방법의 검증.
결론
- 형광 기반 프라이머 확장 방법은 세균 전사체 연구에 효과적입니다.
- 이 접근법은 생체 내 RNA 처리에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 이 방법은 분자 생물학의 다양한 응용에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate mapping of transcriptional start sites and RNA cleavage events enables mechanistic de-risking in target validation for antibacterial drug discovery. This fluorescence-based primer extension technique provides base-resolution data to support lead identification and predictive confidence in early-stage programs. The method’s speed and safety profile facilitate integration into discovery workflows requiring rapid hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses and clarification of promoter architecture in bacterial targets.
- Operational Value: Provides functional validation of RNA processing events, reducing mechanistic ambiguity in toxin-antitoxin system studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering high-resolution mapping of RNA ends to inform target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cDNA fragment data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening campaigns via simultaneous detection during electrophoresis.
- Scalability: Facilitates platform reuse through rapid one-day workflow compatible with automated gel sequencers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase RNA mapping to preclinical continuity by identifying processing sites relevant to virulence or stress response pathways.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable detection of cleavage sites in vivo.
- Predictive Value: Enhances translational biomarker alignment by defining exact RNA termini for follow-up functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within early discovery to support hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports transcriptional start site mapping and RNA cleavage analysis to clarify gene expression mechanisms in bacterial models.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs via fluorescent cDNA fragment separation for comparative condition analysis.
- Analytics: Enables simultaneous detection of extension products and sequencing ladders to improve data confidence and reduce technical variance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining RNA processing events that may influence target suitability for antibacterial development.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for RNA end mapping across multiple bacterial species in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through base-resolution mapping of transcriptional starts and RNA processing sites.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via fluorescent detection and automated gel sequencing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence data on RNA ends for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including RNA isolation, primer design, and reverse transcription.
- Dependent on access to automated gel sequencers and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for primer design, RNA quantification, and gel running conditions.
- Involves adaptation considerations for varying RNA abundance and secondary structure across different bacterial models.
- Practical limitations include the need to optimize RNA input amounts to prevent signal saturation and ensure band resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:59
Primer Extension and Sanger Sequencing
4:26
Assembly of Gel Casting Chamber and Gel Casting
6:15
Running and Visualizing the Primer Extension Gel
8:41
Results: Transcriptional Start Point and RNase Cleavage Site Determination Using Fluorescent Primer Extension
10:20
Conclusion
