Name: 형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 형광 기반 프라이머 확장 기술을 사용하여 세균 전사 시작 지점과 RNA 절단 부위를 생체 내에서 정밀하게 매핑하는 방법을. 자동화된 젤 시퀀서를 활용한 이 기법은 유전자 발현 연구에 필수적인 고해상도 분석을 제공합니다.

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실험실에서 도움을 준 Anne Wochele과 자동 겔 시퀀서에 도움을 준 Vera Augsburger에게 감사드립니다. 우리는 "우선 프로그램" SPP1316 및 SPP1617 내에서 BE4038/2 및 BE4038/5 보조금을 통해 자금을 지원해 준 Deutsche Forschungsgemeinschaft에 감사드립니다.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 나타낼 수 있는 공개할 내용이 없습니다.

형광 프라이머 신장은 TSP- 또는 RNA 이차 가공 식별 어느 쪽의 RNA의 5 &#39;말단을 결정하기위한 간단하고 신속한 방법이다. 때문에 형광 프라이머의 사용, 반응이 설정 될 수 있으며, (방사성 표지 된 프라이머 경우와 달리) 추가 보안 조치없이 실행합니다. 샘플은 형광으로 검출되는 바와 같이 전기 영동 X 선 필름은 일반적으로 사용되는 방사성 방법에 비해 신속한 분석을 허용 진행되는 동안, 이들은 이미징 될 수있다. 일반적으로, 프라이머 신장 반응의 품질 등급과 프라이머의 결합 능력에 크게 의존한다. 결합 부위가 관심 영역에 너무 가깝게 선택되면, 프라이머 도말 표본 신호를 마스크 할 수있다, 결합 부위 반면 너무 멀리 (&gt; 300 염기쌍) 5 &#39;말단에서 신호 불량이 발생할 수있다. 형광 염료는 공유 결합으로 연결되어 있어야합니다합성 올리고 뉴클레오티드 중 커스텀 DNA 올리고 뉴클레오티드의 5 &#...

프라이머 신장도 1은 하나의 기본 해상도까지 특정 RNA 분자의 5 '말단을 결정하기 위해 분자 방법이다. 이러한 5'-RACE (cDNA의 신속한 증폭이 종료 됨) 같은 다른 방법의 장점은 빠른 처리 시간을 용이 RNA 분자의 서로 다른 길이의 혼합물을 분석 할 수있는 능력이다. 이 방법은 RNA 분자가 특정 길이의 cDNA 단편을 생성하는 특정 형광 프라이머를 사용하여 전사 반응을 반대로 실시함으로써 작동한다. 이들의 cDNA 분자 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에 전통적인 생거 시퀀싱 반응이 함께 실행 의한 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 그 형광을 검출 할 수있다. 된 cDNA 단편의 길이는 5 '말단 RNA의 맵핑을 허용 시퀀싱 사다리 비교에 의해 평가된다. 전통적으로, 프라이머 신장 반응을 함께 사용방사성 동위 원소와 X 선 필름에의 cDNA 분자들을 검출한다. 그들의 감도가 약간 낮다이라도 인해 건강 위험, 폐기물 처리 문제 및 취급의 용이성, 새로운 프로토콜은 자동화 된 시퀀서와 프라이머 신장의 검출을위한 형광을 이용한다. 형광 프라이머 (로모 손 년 이상) 장기간 안정적으로 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 무선 표지 반복 절차가 생략 될 수있다. 우리는 여기에서 설명하는 방법은 자동화 겔 시퀀서를 이용하지만, 약간의 수정과, 모세관 시퀀서는 cDNA의 분리 및 검출 3에 사용될 수있다. 겔 분석 병렬 특성은 가능한 RNA 절단 또는 프로세싱 심지어 적은 양을 검출 할 수있다. 또 다른 이점은 검출 될 수 단말 절단 또는 심지어 하나의베이스 처리로서,이 방법의 고해상도이다. RNA 절단 또는 가공, t의 검출에 관련하여프라이머 확장 ypically 두 가지 종류가 구별된다. 다른 경우에, 처리가 생체 내에서 수행하고, 생성 된 RNA 정제 반면 한 경우, 효소 처리, 정제 된 RNA 정제 효소를 사용하여 시험 관내에서 수행된다. 프라이머 신장 시험 관내에서 수행에 두 경우 RNA가 RNA의 소스에 따라, 그러나, 실시되고, 상기 방법은 시험 관내 또는 생체 내 프라이머 신장이라고 하나. 여기 제시 프로토콜에서는 때문에 사용 용이성 (정제없이 필요한 단백질)과 동시에 전사 시작점 및 처리를 결정하는 가능성 단독 생체 프라이머 신장에 초점. 그러나, 시험 관내 프라이머 확장은 동일한 방법으로 설정 원칙적으로,이 프로토콜은 시작점을 제공 할 수있다. 여기에 예시 된 방법은 그것들이 높은 의무만큼 많은 세균 종에 적용될 수있다핵산의 순도 높은 수율 준비. 우리 실험실 연구 독소 항독소 (맞대기) 시스템 4,5, 프라이머 신장 방법은 광범위하게 사용되는 필드의 규정 범위에 초점을 맞춘다. TA-시스템은 안정적이고 내생 활성 독성 단백질과 독성 6,7 중화 대부분 불안정한 단백질 또는 RNA 항독소로 구성 원핵 생물의 게놈에 존재하는 작은 유전 적 요소입니다. 독소 활성은 때때로하는 RNase 활성 8,9 의해 대부분 복제, 세포벽 합성 또는 다른 메커니즘의 억제에 의해 발휘되지만. 일반적으로, RNA 분해 효소 특이성 프라이머 신장 방법 중 하나는 다른 테스트를 수행하여 결정된다. 벽개 및 전체 길이 단편의 혼합물을 동시에 그들의 5 '끝나는 결정하기 위해 분석 될 수있는 프라이머 신장 반응,이 애플리케이션에 매우 적합하다. 시험 관내 및 생체 프라이머 확장에 믹스를 사용하여,특정 독소의 RNase 절단은, 예를 들어, 서열 특이성 10-13 결정될 수있다. <img alt="프라이머 확장, RNA 분리, cDNA 합성, Sanger 시퀀싱, 겔 전기영동 다이어그램." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 1"> . 프라이머 확장 절차 1. 개요 그림 세균 배양 실험의 필요에 따라 배양 및 처리됩니다. 총 RNA는 세포의 cDNA를 수득 대상 특정 형광 DNA 프라이머를 사용하여 역전사 반응에 DNA의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리하고 실시로부터 추출된다. 게놈 DNA 또는 플라스미드를 추출하여 이후의 cDNA 조각과 크기 비교를 위해 형광 생거 시퀀싱 반응에 사용된다. 프라이머 신장 산물은 변성 우레아 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 생거 시퀀싱 제품을 함께 실행하고 자동화 레이저 현미경으로 분석한다. 라 cDNA를 밴드와 함께 선까지입니다 시퀀싱베이스세인트 5 '의 cDNA 끝 (파란색 화살표)의 기본. Fekete 추가 정보, 등. (3) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전체 프라이머 신장 절차의 개요는도 1에서 발견 될 수있다. 요약하면, 박테리아 세포 수확, 배양, 세포 펠렛을 용해 및 RNA 추출. 정제 된 RNA이어서 역전사 템플릿으로 동작 할 수있다 DNA 분자의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리된다. 특정 형광 프라이머는 관심 영역에 교배와 이후 단일 가닥 보완 DNA (cDNA를) 결과, 전사 역, RNA에 추가됩니다. 시퀀싱 사다리 형광 프라이머를 이용하는 전통적인 생거 시퀀싱에 의해 생성 및 프라이머 신장 된 cDNA 단편의 나란히 변성 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 분리된다. 결과겔은 관심의 5 '말단의 식별을 허용 형광 밴드를 비교하여 분석된다. 전사 시작 지점 및 처리 사이트는 다음 서열 비교​​에 의해 개별적으로 평가된다.

<table><tbody><tr><td>AMV 역전사효소(20-25 U/&micro; l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>Ambion (생명 기술)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 기기&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>형광 표지된 프라이머</td><td>Biomers n</td><td>/a</td><td>5' DY-681 수정 " 평범한" DNA 올리고뉴클레오티드. LICOR IRDye 700/800과 같은 호환 가능한 염료는 IDTdna와 같은 다른 공급업체에서도 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 시퀀서, ImagIR 데이터 수집 소프트웨어</td><td>포함, Li-Cor</td><td></td><td>제품 단종</td></tr>, <tr><td>NanoDrop 2000</td>, <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini preparation kit</td>, <td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrate</td>, <td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNA 저장 버퍼</td><td>Ambion (life technologies)</td> <td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>대안: " 산 페놀 : 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125 : 24 : 1)" Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull에서; RNase Inhibitor</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase 형광 표지 프라이머 주기 염기서열분석 키트(7-deaza-dGTP</td><td>포함) GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>생명 기술</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>지르코니아/실리카 비드 0.1mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 rnases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

형광 계 프라이머 신장 (FPE)는 전사 시작점 또는 RNA 분자의 프로세싱 사이트를 결정하기 위해 분자 방법이다. 이것은 특정 형광 표지 된 프라이머 및 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 변성하여 수득 된 cDNA 단편의 후속 분석을 이용하여 관심있는 RNA의 역전사에 의해 달성된다. 동시에, 전통적인 생거 시퀀싱 반응은 자신의 정확한 해당 기지의 cDNA 단편의 단부를 매핑 겔상에서 실행된다. 제품은 복제되어야 복수 후보 서열 5&#39;-RACE (cDNA를 엔드 신속한 증폭), 대조적으로, 프라이머 신장에 의해 생성 된 cDNA 단편의 대부분은 동시에 하나 겔 실행에서 검출 할 수있다. 또한, (결과를 최종 분석에 역전사에서) 모든 절차는 하나의 작업 일에 완료 할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이머를 사용함으로써, 유해 방사성 동위 원소의 사용은 표지 된 시약을회피 할 수 있고, 제품은 전기 영동 과정에서 검출 될 수 있기 때문에 처리 시간이 감소된다. 다음의 프로토콜에서는 확실하고 신속 S.에서 (예를 들어, 독소 항독소 시스템 구성 요소) 시작점 및 RNA 프로세싱 사이트 전사을 추론의 RNA의 5 &#39;말단을 검출하는 생체 내 형광 프라이머 신장 방법을 서술 구균, E. 대장균 및 기타 세균.

도 6에 도시 된 바와 같이, 프라이머 신장 반응 관심 사체의 전사 시작 포인트를 결정하는데 사용될 수 있고 (통상적으로 -10 -35 원소로 식별 됨) 프로모터 영역을 추론 할 수 있습니다. 최상위 (가장 긴)의 cDNA 단편의 mRNA의 5 '말단을 나타내며, 따라서 시퀀싱 사다리에 비해 용이하게 매핑 될 수있다. <img alt="ompA 전사 시작, mRNA 절단; 겔 전기영동, 유전자 발현 분석 다이어그램." src="/files/ftp_upload/52134/52134fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 6"> 프라이머 확장 반응의 그림 6. 대표 결과. 왼쪽에서 E. 전체 생체 프라이머 신장 겔 다양한 플라스미드와 대장균이 표시됩니다. 관심의 개별 영역이 확대됩니다. 상단 <...

여기에서는 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 박테리아 전사체 및 RNA 처리에서 전사 시작점을 결정하기 위한 형광 기반 프라이머 확장 방법을 설명합니다.

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 프라이머 확장 반응을 사용하여 박테리아로부터 생체 내 전사 시작점과 RNA 절단 부위를 식별하는 것입니다. 이것은 먼저 대장균 또는 S aria와 같은 박테리아를 성장시키고 RNA 분자를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, RNA는 특정 형광 프라이머와 역전사효소를 사용하여 역전사되어 CD NA 단편을 생성합니다.그런 다음 박테리아 세포에서 DNA 또는 플라스미드를 분리하고 염기서열분석 키트를 사용하여 DNA 템플릿에서 형광 Sanger 염기서열분석 사다리를 만듭니다. 마지막으로, CDNA 단편과 염기서열분석 래더를 분리하고 자동화된 겔 염기서열분석기를 사용하여 폴리아크릴아미드 겔에서 동시에 검출하고 서로 비교합니다. 궁극적으로, 형광 프라이머 확장은 RNA 분자의 5개 프라임 말단을 하나의 염기 분해능까지 매핑하는 데 사용됩니다.인종 또는 방사능 기반 1차 확장과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전기영동 중에 검출이 동시에 발생하기 때문에 RNA 분자의 끝에서 5개를 빠르게 식별할 수 있다는 것입니다. 감도는 적색 활동 기반 1차 확장과 유사하지만 실험실 직원이 속도 활동 방사선 안전 교육 없이도 이 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 형광 1차 확장 기술을 사용하여 독소 항독소 시스템의 RNA 구성 요소를 조사하는 데 성공했습니다.이 절차를 시연하는 포도상구균은 제 연구실의 대학원생인 Christopher Schuster가 맡을 것입니다. 높은 수율의 RNA를 준비하고 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머를 설계한 후 먼저 열순환기를 섭씨 95도로 예열하여 프라이머 확장 반응을 수행합니다. 각 RNA 샘플에 대해 A PCR 튜브에 다음 화합물을 혼합하고 섭씨 95도에서 1분 동안 샘플을 변성시킵니다.그런 다음 튜브를 얼음 위에 5분 동안 올려 놓고 프라이머와 RNA를 혼성화합니다. 그런 다음 PCR 기계를 섭씨 47도로 설정합니다. 그런 다음 여기에 설명된 대로 역전사 마스터 믹스를 준비합니다.각 혼성화된 RNA 샘플에 4마이크로리터, 역전사 마스터 믹스를 추가하고 섭씨 47도에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 반응을 중지하려면 샘플을 섭씨 95도에서 2분 동안 가열합니다. 그런 다음 6마이크로리터의 형태 아미드 로딩 염료를 첨가하고 하룻밤 또는 영하 20도의 어둠 속에서 최대 2주 동안 보관합니다.게놈 DNA 또는 플라스미드를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 약 10 - 15 마이크로그램의 게놈 DNA 12 마이크로리터 또는 100 - 500 나노그램의 플라스미드 DNA를 1 마이크로리터의 형광 표지된 프라이머 및 1 마이크로리터의 DMSO 피펫과 혼합하여 Sanger 염기서열분석 반응을 조립합니다. 각 염기서열분석 혼합물 1마이크로리터를 사전 라벨링된 별도의 PCR 튜브에 넣습니다. 그런 다음 각 튜브에 D-N-A-D-M-S-O 프라이머 믹스 3마이크로리터를 추가합니다.PCR 기계를 다음 프로그램으로 설정하고 샘플을amp기계에 넣은 후 실행하십시오. 실행 후 샘플에 6마이크로리터의 로딩 염료를 첨가한 다음 얼음 위에 올려 놓습니다. 깨끗하고 먼지가 없는 25cm 플레이트를 사용하여 즉시 또는 섭씨 영하 20도에서 장기간 사용하는 경우 후면 유리판에 0.25mm 스페이서를 놓고 유리판의 홈이 있는 끝과 레일 입구 파일럿이 모두 위를 향하도록 상단의 노치가 있는 유리판을 내립니다.유리판의 양쪽에 젤 레일을 부착하고 손잡이를 가볍게 조여 젤을 캐스팅합니다. 여기에 나열된 화합물을 비커와 교반 막대에 결합하고 자석 교반 플레이트에 놓습니다. PS를 추가하고 팀을 이룬 직후 50ml 주사기를 사용하여 아크릴아마이드 용액을 취하고 팁에 0.45나노미터 필터를 놓습니다.끼워넣은 플레이트를 10-20도 각도로 놓고 주사기 팁을 한쪽에서 다른 쪽으로 계속 이동하면서 유리판 사이에 젤 용액을 천천히 분배합니다. 젤 용액이 유리판의 하단 끝과 만나면 분배를 중지하십시오. 버블 훅을 사용하여 형성되었을 수 있는 거품을 제거합니다.그런 다음 노치가 있는 끝의 유리판 사이에 젤 포켓 스페이서를 밀어 넣고 젤 용액에 담그고 주판을 부착하여 고정하고 상부 레일 나사를 가볍게 조이고 젤이 1-2시간 동안 굳도록 합니다. 주조 플레이트와 포켓 스페이서를 제거하기 전에 증류수 탈이온수를 사용하여 소금 주머니와 젤 잔여물을 청소하여 젤을 실행합니다. 버퍼 탱크 홀더를 전면 유리판의 젤 레일에 밀어 넣고 손잡이를 조입니다.자동 젤 이미저의 하단 젤 탱크에 젤을 가열판에 놓고 레일 엔트리 파일럿을 장치 브래킷에 밀어 넣어 고정합니다. 하나의 XTBE 완충액을 사용하여 상부 및 하부 겔 완충액을 채웁니다. 그런 다음 하단 버퍼 챔버를 닫고 전원 코드를 사용하여 상단 버퍼 챔버를 전원에 연결합니다.젤 주머니에 소금이 있으면 버퍼를 사용하여 주머니에 반복적으로 피펫팅하여 청소하십시오. 그런 다음 상단 버퍼 뚜껑을 사용하여 상단 버퍼 탱크 챔버를 닫습니다. 이미저와 컴퓨터를 켜고 텍스트 프로토콜에 따라 기본 이미지 IR 데이터 수집 소프트웨어를 시작한 후 여기에 나열된 설정을 사용하여 스캐너 제어를 설정합니다.다음으로, 전압 켜기를 선택하고 enter를 눌러 빈 젤을 20분 동안 미리 실행합니다. 그 동안 PCR 기계를 사용하여 염기서열분석 사다리와 프라이머 확장 제품을 섭씨 90도까지 2분 동안 가열합니다.얼음에서 냉각하기 전에 전기영동을 중지하고 자동화된 겔 시퀀서를 열고 상부 버퍼 탱크 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 유리판 사이와 상어 이빨과 함께 상어 이빨 빗을 삽입합니다.겔 피펫을 1-2 마이크로 리터의 프라이머 확장 제품 또는 염기서열분석 사다리 반응을 각 젤 포켓에 약간 뚫습니다. 빈 주머니에 사용할 수 있습니다. 로딩 염료를 사용하여 채우십시오.일관되지 않은 작동 동작을 방지하고 버퍼 탱크와 겔 시퀀서의 도어를 닫으십시오.그런 다음 레이저에 대해 전압 켜기를 선택하고 스캔 상태를 켜고 Enter 키를 눌러 전기 영동을 시작합니다. 관심 영역이 레이저를 통과하면 다음과 같이 전기영동을 중지합니다. 프라이머 확장 반응은 관심 전사체의 전사 시작점 또는 TSP를 결정하는 데 사용할 수 있으며 프로모터 영역을 추론하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 예에서 MPE mRNA의 TSP는 이전에 발표된 데이터와 일치하는 G로 식별되었습니다. 마이너스 35 및 마이너스 10 프로모터 요소는 T-T-G-T-A-A 및 T-A-G-A-C-T로 추론되었으며, 이러한 모티프는 mRNA 절단 산물을 식별하기 위해 프라이머 확장을 사용하여 각 합의 서열의 염기와만 다릅니다. RNA Ybi SEC two에 의한 START co에 가까운 절단의 RNA 매핑은 RNA가 존재하지 않거나 비활성 상태일 때 RNA 활성의 결과로 시작 co에 가깝게 프라이머 확장 생성물이 형성되지 않을 때 여기에 표시됩니다.그러나 이 그림의 시작 코트 바로 하류에 나타나는 두 개의 강한 띠는 개별 띠의 식별을 방해하는 역전사 반응에서 과도한 RNA로 인해 실패한 프라이머 확장 실험을 보여줍니다. 이는 주형 RNA의 총량이 관심 RNA의 풍부함에 맞게 조정되어야 함을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 약간의 연습을 통해 형광 프라이머와 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 전사 시작점과 RNA 절단 부위를 밝히는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 방법은 빠르고 쉽게 수행할 수 있습니다. 실험에 행운을 빕니다.

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