Name: 검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 학습하세요 근접 연결 분석(PLA)을 이용해 초파리 애벌레 신경근육 접합부에서 단백질-단백질 상호작용을 현장에서 검출하는 방법을. 이 기술은 시냅스 조직과 기능 연구에 필수적입니다.

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우리는 플라이 주식을 제공하기위한 블루밍턴 초파리 증권 센터 감사합니다. 우리는 또한 항체를 제공하기 위해 발달 연구 하이 브리 도마 은행과 박사 린 쿨리 (예일 대학) 감사합니다. 특별한 감사는 원고에 그녀의 도움을 AhHyun 유 간다. 이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (크리거), 윌리엄과 에이다 이사벨 스틸 기금 (크리거) 및 건강 연구의 캐나다 연구소 (강화)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 몸 벽 준비 . 참고 : 이전에 브렌트 등 10 또는 라마 찬드 및 Budnik (11, 12)에 설명 된대로 (몸 벽 근육에 분포 NMJs의 연구를위한) 셋째 령 애벌레 몸 벽의 준비하지만 일부 수정을 수행했다. <ol><li> 해부 <ol><li> 표준 절차 (13)를 사용하여 5~6일 25 ° C에서 플라이 주식과 십자가를 올립니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 유리 병 또는 병에서 세번째 령 유충 크롤링을 선택합니다. </li><li> 음식 입자를 제거하기 위해 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 포함하는 작은 페트리 접시에 유충을 씻으십시오. </li><li> 실 가드 디스크에 하나의 애벌레를 놓고 얼음처럼 차가운 PBS 몇 방울에 몰입. 얼음처럼 차가운 PBS는 조작하기 쉽게 만드는 유충 기절 도움이됩니다 사용. 해부 전반에 걸쳐 준비가 항상 건조되는 것을 방지하기 위해 PBS에 빠져들되어 있는지 확인합니다. </li><li> 라의 위치를그 등쪽 두 기관 책자는 해부 현미경 (그림 2A)에서 볼 수 있습니다 너무 위로 향하게 RVA. 집게를 사용하면, minutien 핀을 파악 spiracles (그림 2B) 근처의 후방 끝 부분에 유충을 고정합니다. 다른 핀으로, 입 후크 근처 앞쪽 끝 부분에있는 표피 관통. 부드럽게 한 다음, 길이 유충을 스트레칭 (그림 2B)를 아래로 핀. </li><li> 미세 절제 가위를 사용하여 작은 구멍을 만드 핀 근처 후단을 꼬집어. 절개는 표피를 통과 할만큼 피상적해야한다. </li><li> 두 기관 책자 (그림 2C) 사이의 등쪽 정중선의 전체 길이를 따라 절단, 절개로 가위의 아래쪽 블레이드의 팁을 배치. 복부 몸 벽 근육 손상을 방지하기 위해 절단시 약간 위쪽으로 가위 블레이드를 가리 킵니다. </li><li> 약간 포스트 앞쪽에 작은 수평 절개를합니다eriorly - 위치 핀 (그림 2C). 다른 유사한 절개 약간 전방-배치 핀 (그림 2C) 후부합니다. 절개는 표피를 통과해야한다. 참고 : 유사합니다 결합 단계 1.1.7과 1.1.8에서 세 절개 " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> 완료 할 때 ", 즉, 애벌레 몸의 등 쪽의 왼손 및 오른손 플랩이 생성되어야한다. </li><li> 조심스럽게 집게와 내부 장기를 청소. PBS의 몇 가지 강력한 방울을 추가하면, 애벌레 몸에서 장기를 대체하여 쉽게 제거 할 수있게 도와 줄 것입니다. 그것은 몸 벽 근육에 손상을 원인이됩니다 애벌레 몸을 파고하지 마십시오. </li><li> 열린 애벌레 몸을 펼쳐라 아래 모서리 (그림 2D)를 핀. 피닝시 균일 텐션 사각형을 형성하도록 수평 및 수직 체벽 스트레칭 (SE전자 그림 모양에 대한 2G), 돌보는이 과정에서 몸 벽 근육이 찢어지지. </li><li> 남아있는 내부 장기 (그림 2E)를 제거 완료. </li></ol></li><li> 고정 및 투과성으로 <ol><li> 보우 인의 솔루션의 몇 방울에 고정 된 본체 벽을 담근다. 얼음에 15 분 동안 품어. 대안으로, 대안 고착성 등 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용한다; 30 분 동안 품어. </li><li> 트리톤과 인산 버퍼 식염수 (PBT)로 3 회 씻어. </li><li> 미세 핀셋으로 조심스럽게 핀을 제거하고 실리콘 화 0.65 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 그 모서리를 본체의 벽을 전송. </li><li> PLA를 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 PBT의 몸 벽을 저장합니다. 최적의 결과를 얻으려면 하루 해부의 두 내 몸 벽을 면역 염색 시작합니다. 참고 : 시약에 저장하고 신체의 모든 벽은 분석 기간 동안 동등하게 취급되도록, 다른 유전자형은 하나에 배치 할 수 있습니다튜브. 유전형 (예는도 2F 참조) 다르게 몸체 벽의 모서리를 절단함으로써 구별 될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 조직 화학 참고 :. 셋째 령 애벌레 몸 벽의 면역 염색은 이전 브렌트 등 14 라마 찬드 및 Budnik (11)에 설명 된대로 수행하지만, 일부 수정 11,14와했다. 참고 : 달리 명시되지 않는 실내 온도에서 교반과 함께 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 블로킹 <ol><li> 10 분마다 PBT로 3 회 보디 벽을 씻는다. </li><li> 1 시간 동안 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 차단합니다. </li></ol></li><li> 면역 염색 <ol><li> 관심 두 단백질에 대해 마우스 및 토끼 일차 항체와 본체의 벽을 인큐베이션을 실온에서 2 시간 또는 밤새 39 ° C (1 %의 BSA에 희석). 250 토끼이 경우 1:10 마우스 항 굴림 및 1을 사용NTI-HTSM (15, 16). 하지 마우스 나 토끼에서 만들어진 마커에 대한 항체도 포함 할 수있다 - 예를 들어, 1을 사용 : 200 염소 항 - HRP는 신경 세포막을 윤곽을 그리다. </li><li> 10 분마다 PBT로 3 회 세척 할 것. </li><li> 실온에서 2 시간 또는 밤새 39 ° C (1 %의 BSA에 희석) 마커를 검출하기 위해 형광 접합 된 이차 항체와 함께 배양한다. HRP 염소 항 - 항체를 검출하기 위해 200-FITC 접합 항 - 염소 : 예 1을 사용 - PLA 신호 이후 적색 형광 가시화 된 바와 같이, 형광 물질은 다른 마커를 검출하기 위해 사용되어야한다. 때문에 빛에 민감한 시약의 사용, 이후이 시점에서 어둠 속에서 튜브를 유지. 참고 : PLA는 공 초점 현미경 아래에서 빨강 채널에서 시각 신호와, 마우스 및 토끼에서 제기 된 주요 항체 사이에 수행 할 수에 사용되는 키트는 할 수 있습니다. 원하는 경우, 다른 키트는 분석이 주역으로 수행 할 수 있도록 그 사용할 수 있습니다RY 항체는 다른 종에서 발생하고, 신호는 다른 채널에 가시화. </li></ol></li></ol> 3. 근접 내고 분석 참고 : 달리 명시되지 않는 실내 온도에서 교반과 함께 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> PLA 프로브 <ol><li> 10 분마다 PBT로 3 회 보디 벽을 씻는다. </li><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 (5 희석 1 % BSA 각 1) PLA의 프로브를 품어. 이 경우, 5-10 몸체 벽의 적당한 침지 및 혼합을 보장하기 PLA 프로브 항 - 마우스 마이너스 40 μL, PLA 프로브 항 - 토끼 PLUS 40 μL와 1 % BSA 120 μl를 사용한다. PLA 프로브 1시 25분 희석율 여전히 (이 실험 예) 적절한 신호 대 잡음 비율을 초래할 수있다. </li></ol></li><li> 결찰 <ol><li> 5 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼와 신체 벽을 씻으십시오. </li><li> 1 시간에 대한 연결 용액 (결찰 완충액 리가 아제 1시 40분 희석)과 인큐베이션t 37 ° C의. 이 경우, 본체 5-10 벽의 적절한 혼합 및 침지를 위해 리가 아제 5 μL, 5 결찰 완충액 40 μL 및 고순도의 물 155 μl를 사용한다. </li></ol></li><li> 확대 <ol><li> 2 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼와 신체 벽을 씻으십시오. </li><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 증폭 용액 (증폭 완충액 폴리머 라제 1:80 희석)으로 배양한다. 이 경우, 본체 5-10 벽의 적절한 혼합 및 침지를 위해 폴리머 라제 2.5 μL, 5 증폭 완충액 40 μL 및 고순도 157.5 μL의 물을 사용한다. </li></ol></li><li> 이미징을위한 준비 <ol><li> 10 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼 B와 몸 벽을 씻으십시오. </li><li> 1 분에 대해 한 번 0.01x 워시 버퍼 B 씻으시오. </li><li> 장착하기 전에 적어도 30 분 동안 장착 솔루션의 몇 방울의 평형, 또는 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 플랫폼 슬라이드 w에 몸 벽을 전송i 번째 자신의 손톱이 아래를 향. 행과 mountant의 하락 또는 두 내에서 같은 방향으로 몸 벽을 배치합니다. 다음 투명 매니큐어와 슬라이드를 밀봉, 공기 방울을 발생하지 않도록 준비를 돌보는 동안 22mm X 40mm coverslip에 배치합니다. </li><li> 공 초점 이미징을위한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 보고서는 PLA가 초파리 애벌레 NMJ에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 분석은 본 NMJ에서 내인성 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 목적 유생 체벽 근육 제제에 대해 수행된다. 이 기술로, 굴림 및 HTS 서로 매우 밀접, 따라서 구체적으로 시냅스 영역 (27)에서, 복합체에 존재하는 것으로 도시된다. 이 결과의 지원으로, 이전의 연구는 다음과 같은 데이터와의 연관성의 증거 제공하고있다 : 굴림과 HTS의 면역 분포 애벌레 NMJs의 시냅스 부위에 겹쳐 1), 2) 굴림과 HTS는 공동 기반으로하는 복합체를 형성 면역 전체 성인 해물 비행과 관련된 실험, 3) 굴림과 HTS는 상피와 시냅스 접합 8 모두에서 상호 작용한다. 시냅스 지역에서 PLA 신호도 굴림와 박세리, 이전에 다른 연구에서 확인 된 상호 작용 사이에 관찰하여 더 크리 디를 제공NMJ 15,20,21에서이 분석을 사용 NCE. 흥미롭게도, 박과를 Wg 사이의 PLA는 ...

큰 초파리 디스크 (굴림)은 세포막의 특정 사이트에서 큰 단백질 복합체의 조립을 조율 도움이 단백질 비계의 막 관련 구 아닐 키나제 가족의 보존 회원입니다. 종양 억제 단백질, 굴림은 상피 apicobasal 극성 1,2,3를 결정하는 중요한 역할로 원래 확인했다. 굴림 또한 유생 4시 글루타메이트 운동 신경의 신경 근육 접합 (NMJ)에서 중요한 발판 모듈 역할을한다. DLG는 애벌레 NMJ에서 다양한 역할을 수행하고, 그 pleiotropism 여러 단백질 5,6와 연결하는 능력에 의존한다. 하나는 이러한 단백질은 후진타오 - 리 타이 샤오 (HTS), 주로 7 골격 액틴 스펙 트린을 조절하는 역할에 관해서 설명 된 포유류 adducins에 상동입니다. 이것은 이전과 굴림 HTS 시험관에 기초하여 서로 착체를 형성 할 수 있음을 보여왔다 </EM&gt; 전체 성인 플라이 해물 (8)을 포함하는 공동 면역 침전 실험. 이러한 결과의 단점 중 하나는, 그러나, 그들이 어디에이 복잡한 형태를 나타내지 않는다는 것이다. 면역 조직 화학 염색의 사용으로, 굴림과 HTS의 분포는 애벌레 NMJs의 시냅스 막에 겹쳐 관찰되지만,이 지역 8 복잡한에? 최근에 보여 여기에서 더 자세히 설명, 근접 내고 분석 (PLA)는 애벌레 NMJ 27 구체적으로 굴림과 HTS 사이의 현장 연관을 찾기 위해 사용됩니다. PLA는 주로 9 동일계 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 세포 및 조직 배양에 사용되는 비교적 새로운 기술이다. 이 분석에서, 관심의 단백질에 대해 두 일차 항체 종 특이 이차 항체의 쌍의 검출 올리고 뉴클레오타이드에 접합되는 프로브를 PLA, 명명 (도 1A, B). 두 단백질의 경우S는 첨부 PLA 프로브 사이의 거리가 두 개의 추가 커넥터 올리고 뉴클레오티드 (도 1C)의 하이브리드 화를 통해 가교 될 수있다 (수십 나노 미터 내의 IE) 서로 근접하게된다. 이 형태에서, 올리고 뉴클레오티드 커넥터의 자유 단부가 서로 접촉 할 정도로 가까운 및 닫힌 원형 DNA 분자가 라이 게이션 동일계에서 (도 1D)에 형성 될 수있다. 원형 DNA 분자는 PLA 프로브 (그림 1E)에 결합 올리고 뉴클레오티드 중 하나에 의해 준비가 끝났다 현장에서 롤링 원 증폭을위한 템플릿 역할을합니다. 그 결과 증폭, concatemeric DNA 제품 내에서 시퀀스는 다음 형광 표지, 보완 올리고 뉴클레오티드 프로브 (그림 1 층)로 시각화 할 수 있습니다. 증폭 된 DNA는 PLA 프로브 중 하나, 단백질 - 단백질 상호 작용 withi의 세포 내 위치 파악에 부착되는 방식 때문에NA 조직을 용이하게 확인 될 수있다. 여러 가지 방법이 일반적으로, 이러한 공동 면역 침전 등의 체외 기술을 포함하여 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 (-풀다운 분석 및 효모 두 하이브리드 심사, 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 및 생체 분자 형광 보완 등의 생체 기술에 사용됩니다 BiFC). 시험 관내 기법 함정 상호 내생 발생되는 경우에, 상기 생체 기술 내인성 대응의 기본 동작을 반영하지 않을 융합 단백질의 인공 표현을 수반하면서 이들이 식별하지 않는다는 것이다. PLA의 하나의 주요 장점은 FR에 비교되는 신호를 생성하는 데 필요한의 근사 정도, 조직 내에서 서로 가까운 위치에 있고 가능성 착체를 형성 내인성 단백질 인터랙의 세포 내 위치 파악을 결정하는 능력이ET와 BiFC. PLA 인해 항체 인식 및 DNA 증폭의 결합에 높은 특이성과 민감도와의 상호 작용을 검출 할 수있다. 따라서, 분석은 상호 작용의 정확한 위치를 드러내 puncta의 형태의 이산, 밝은 신호를 생성 할 수있다. 또한, 부족하게 보이는 항원을 검출 할 수있다. 마지막으로, PLA는 수행 할 수있는 비교적 간단한 기술 없으며,이를 완료하는 데 표준 면역 절차보다 더 오래 걸립니다. 따라서, PLA는 종종 긴 준비 시간과 광범위한 문제 해결 퍼진 다른 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 통해 기술적 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 PLA가 반응계 내에서 내인성 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 목적 초파리 애벌레 NMJ 어떻게 적용될 수 있는지를 보여준다. 여기에, PLA는 굴림과 HTS가 실제로 NMJs의 시냅스 부위에 복잡한에 존재하는 것으로 표시됩니다 애벌레 몸 벽 근육 준비에 수행. PLA는 이전에 애벌레 NMJ을 연구하는 데 사용되지 않은, 초파리의 조직이 분석을 사용한 출판 논문의 단지 소수는 현재이 있습니다. 그것은 초파리 사회에 PLA의 추가 노출이 다른, 더 일반적으로 사용되는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 보완하기 위해 추가 도구로 그 사용이 증가 될 것으로 기대된다.

<table><tbody><tr><td>집게(파인 #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합합니다. 30분으로 설정합니다. 금형에 붓습니다(예: 12웰 세포 배양 플레이트 사용). 적어도 24 시간 동안 치료하십시오. 해부할 때 60 x 15mm 페트리 접시 뚜껑의 뚜껑을 부착하십시오.</td></tr><tr><td>Minutien 핀(0.0125&nbsp; mm 팁 직경)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection Scissors (ultra fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Platform Slides</td><td></td><td></td><td>접착제 두 개의 22 x 22 mm2 커버슬립을 투명한 네일 폴리시가 있는 현미경 슬라이드에 놓아, < 시료 장착을 위한 20mm 간격.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>스톡은 GFP 밸런서를 통해 재조정되어 GFP 신호의 부재를 기반으로 동형접합 돌연변이를 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1x PBS (인산염 완충 식염수) : 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7.0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin의 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (파라포름알데히드) : 4x PBS의 1% PFA</td><td></td><td></td><td>PFA(아나케미아 사이언스 - 66194-300). 솔루션을 만드는 방법에 대한 지침은 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006을 참조하십시오.</td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>1x PBT (트리톤이 함유된 인산염 완충 식염수): 0.01% 트리톤</td><td></td><td></td><td>트리톤 X-100이 포함된 1x PBS (시그마-알드리치 - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (소 혈청 알부민): 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001)에 1% BSA. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>mouse anti-Dlg (Discs large)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>1% BSA에서 1:10 희석으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>토끼 안티 HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Dr. Lynn Cooley (Yale University) 제공. 1% BSA에서 1:250 희석으로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>토끼 항박(p21-활성화 키나아제)제공:</td><td></td><td></td> <td>Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). 1% BSA에 1:500 희석하여 사용하십시오.</td></tr><tr><td>마우스 anti-Wg (Wingless)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>1% BSA에서 1:5 희석으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>염소 anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>1% BSA에 1:200 희석하여 사용하십시오.</td></tr><tr><td>FITC-conjugated 당나귀 안티 염소</td><td>잭슨&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>1% BSA에 1:200 희석하여 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA 프로브 안티-마우스 MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA 프로브 안티-래빗 PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 현장 검출 시약 레드</td><td>Sigma-Aldrich DUO92008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 세척 버퍼 A: 0.01&nbsp; M 트리스, 0.15&nbsp; M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x 세척 버퍼 B: 0.2&nbsp; M 트리스, 0.1&nbsp; M NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x 세척 버퍼 B: 2&nbsp; mM 트리스, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td>를 <td>사용한 Duolink In Situ Mounting Medium</td></tr></tbody></table>

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg)는 막과 관련된 guanylate kinase family의 보존 구성원이며 Drosophila의 유충 신경근 접합부 (NMJ)에서 주요 골격 단백질 역할을합니다. 이전 연구에서는 유충 NMJ에서 Dlg의 시냅스후 분포가 포유류 유류의 상동체인 Hu-li tai shao(Hts)의 분포와 겹친다는 것을 보여주었습니다. 또한, Dlg와 Hts는 전체 성체 파리 용해물을 포함하는 공동 면역침전 실험을 기반으로 서로 복합체를 형성하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 이러한 실험의 특성으로 인해 이 복합체가 유충 발달 중 NMJ에 특이적으로 존재하는지 여부는 알 수 없었습니다.
Proximity Ligation Assay(PLA)는 현장에서 단백질-단백질 상호 작용을 감지할 수 있는 세포 및 조직 배양에 주로 사용되는 최근에 개발된 기술입니다. 이 분석에서 샘플은 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 관심 있는 두 단백질에 대한 1차 항체와 함께 배양됩니다. 그런 다음 1차 항체는 PLA 프로브라고 하는 특별히 설계된 올리고뉴클레오티드 접합 2차 항체 쌍으로 검출되며, 이 항체는 두 프로브가 서로 근접하게 결합된 경우에만 신호를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 복합체에 있는 단백질을 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 PLA를 사용하여 초파리 유충 NMJ에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 유충 체벽 근육 준비에 대해 수행되어 Dlg와 Hts 사이의 복합체가 NMJ의 시냅스후 영역에 실제로 존재한다는 것을 보여줍니다.

야생 형의 제 3 령 애벌레 NMJs에서 굴림은 주로 유형의 종말보다 굴림 면역 수준이 형 IB의 종말에서 더 두드러 인 상태, I 형 글루타메이트 종말의 시냅스 막에서 발견된다 (그림 3A) 4. HTS는 근육에 걸쳐 존재하지만 HTS 면역 수준이 두 유형 I 종말 동일 표시와 시냅스 부위에 집중하고, 또한 (그림 3A ') 8,17 시냅스 발견된다. 굴림과 HTS의 분포가 크게 시냅스 영역 (그림 3A '') 8시에 중복 있습니다. 굴림과 HTS는 NMJ에서 복잡한에 존재하는지 확인하려면, PLA는 두 단백질 사이에 애벌레 몸 벽 근육 준비에 실시 하였다. 이 분석, N 말단 및 토끼 항 HTSM 항체에서 제 PDZ 도메인을 검출하는 마우스 항 통해 Dlg 항체즉, C 말단 MARCKS 상동 도메인 (15, 16)를...

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

다음 실험의 전반적인 목표는 초파리 유충 NMJ에서 내인성 단백질 단백질 상호 작용의 세포 내 국소화를 감지하는 것입니다. 이는 PLA 프로브라고 하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 접합 2차 항체를 사용하여 면역형광을 수행함으로써 달성되며, 이 항체는 관심 있는 두 단백질에 대한 1차 항체에 결합합니다. 다음으로, PLA 프로브 사이의 갭은 두 커넥터 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 통해 메워집니다.두 단백질이 서로 근접하고 폐쇄된 원형 DNA 분자가 in situ ligation을 형성한 경우에만 폐쇄된 원형 DNA 분자 내의 서열을 증폭하기 위해 in situ rolling circle 증폭이 수행되며, 이는 이후에 상보적인 형광 표지된 oligonucleotide로 검출됩니다. 따라서 각 증폭 산물에서 생성된 결과 형광 신호는 컨포칼 현미경을 사용하여 볼 때 뚜렷한 밝은 점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 따라서 E, 2, 하이브리드 침전 및 위협과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 PLA가 조직 내에서 서로 근접하게 국소화되어 복합체를 형성할 가능성이 있는 내인성 단백질의 세포 내 국소화를 감지할 수 있다는 것입니다.이 방법은 유충과 mj에서 특이적으로 발생하는 단백질-단백질 상호 작용 네트워크에 대한 통찰력을 제공합니다. 다른 jolo 시스템에도 적용할 수 있습니다. 배아와 상상 디스크의 상피 조직을 제안합니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 두 기술자인 hel yu와 Ha king이 맡을 것입니다. 섭씨 25도에서 5-6일 동안 초파리 배양을 배양한 후, 가는 집게를 사용하여 유리병이나 병에서 기어다니는 세 번째 instar 유충을 골라 유충을 씻습니다. PBS가 들어 있는 작은 페트리 접시에 옮깁니다.그런 다음 씻은 유충 중 하나를 S 시가 디스크에 넣고 얼음처럼 차가운 PBS 몇 방울에 담그면 조작이 쉬워집니다. 해부 현미경으로 두 개의 기관 궤도가 보이도록 등쪽이 위를 향하도록 유충을 배치합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 므누신 핀을 잡고 다른 핀으로 유충을 나선 근처의 뒤쪽 끝에 고정하고 다른 핀으로 입 고리 근처의 앞쪽 끝에 있는 큐티클을 뚫고 유충을 세로로 부드럽게 늘린 후 핀으로 고정합니다.다음으로, 미세 해부를 사용하여 가위로 핀 근처의 뒤쪽 끝을 꼬집어 작은 구멍을 만들고 절개 부위는 큐티클을 통과할 수 있을 만큼 충분히 피상적이어야 합니다. 그런 다음 가위의 아래쪽 날 끝을 절개 부위에 놓고 가위 날을 약간 위로 향하게 하여 아래 근육이 손상되지 않도록 두 기관 기관 사이의 등쪽 정중선 전체를 따라 자릅니다. 이제 큐티클을 통해 후방에 배치된 핀보다 약간 앞쪽에 작은 수평 절개를 만듭니다.그런 다음 앞쪽에 배치된 핀의 약간 뒤쪽에 또 다른 유사한 절개를 만듭니다. 유충 몸에 PBS를 몇 방울 강하게 떨어뜨린 후 집게를 사용하여 내부 장기를 조심스럽게 청소합니다. 유충의 몸을 찌르면 몸에 손상을 줄 수 있으므로 피하십시오.벽 근육은 유충 몸을 펼치고 모서리를 고정하기 위해 신체 벽을 수평 및 수직으로 늘려 균일한 장력의 직사각형을 형성합니다. 조직을 고정하는 과정에서 체벽 근육이 찢어지지 않도록 주의합니다. 고정된 체벽을 boan 용액 몇 방울에 담그고 고정 후 15분 동안 얼음 위에서 배양합니다.PBT를 사용하여 조직을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 시약을 절약하고 분석 중에 모든 체벽이 동일하게 처리되도록 합니다. 각 유전자형의 모서리를 다르게 잘라 구별하십시오.그리고 미세한 집게로 핀을 제거한 후 동일한 실리콘 처리된 0.65밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 모두 넣습니다. 조직에 침투하려면 PBT를 사용하여 체벽을 각각 10분씩 3회씩 세척합니다. 최종 세척을 제거한 후 1% BSA를 첨가하여 샘플을 차단하고 1시간 동안 배양합니다.면역염색 다음으로, 체벽은 관심 단백질인 두 단백질에 대해 마우스와 토끼의 1차 항체를 추가하고 2시간 동안 배양합니다. 이 경우 1%BSA에서 1-10 마우스 anti DLG와 1-250 rabbit anti HTS가 사용됩니다. 마커에 대한 항체는 배양 후에 추가할 수도 있습니다.PBT를 사용하여 체벽을 각각 10분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 1%BSA의 마커에 대해 fluoro 4 표지된 2차 항체를 추가하고 다음 날 아침 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 배양합니다. PBT를 사용하여 체벽을 각각 10분씩 3회 세척합니다.최소 200마이크로리터에서 1-5회 희석으로 분석을 시작합니다. PLA 프로브, 안티 마우스 마이너스 및 PLA 프로브 안티 토끼 플러스의 총 부피는 체벽에 1 % BSA를 더한 후 섭씨 37 도에서 2 시간 동안 배양하여 세척 완충액 A를 사용하여 리가제 용액에서 리가아제의 1-40 희석으로 각각 5 분 동안 체벽을 2 회 세척합니다. 배양 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세척 완충액 A를 사용하여 체벽을 각각 2분씩 두 번 세척한 후 증폭 용액에 1에서 80 희석된 중합효소를 첨가합니다.이미징을 위해 샘플을 준비하기 위해 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼 B를 사용하여 각각 10분씩 두 번씩 신체 벽을 세척합니다. 그런 다음 세척 버퍼 B를 100배 희석하여 1분 동안 최종 세척을 수행합니다.미세한 집게를 사용하여 최소 30분 동안 몇 방울의 장착 용액으로 신체 벽을 평형을 이룹니다. 몸막의 간격을 좁히고 몸체 벽을 플랫폼 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 한 방울 또는 두 방울의 장착 용액 내에서 동일한 방향으로 행으로 배치하십시오.기포가 발생하지 않도록 주의하면서 준비물 위에 22mm x 40mm 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 투명 매니큐어를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다. 컨포칼 이미징이 준비될 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.여기 야생형 유충 njs에서 볼 수 있듯이, DLG는 주로 1형 글루타메이터성 부톤의 시냅스후 막에서 발견되며, 1형 S bs HTS보다 1형 B형에서 수치가 더 뚜렷하게 나타나지만, 시냅스후 막에 집중되어 있으며, 두 유형 1 부톤에서 동일한 수치를 가지고 있습니다. DLG와 HTS는 DLG와 HTS가 복합체에 존재하는지 확인하기 위해 시냅스후 영역에서 크게 겹칩니다. N-M-J-P-L-A에서는 여기에서 볼 수 있듯이 항 DLG 및 항 HTS 항체를 사용하여 수행했습니다. 두 단백질 사이의 PLA 신호는 야생형 NMJ에서 특이적으로 관찰되며, 신호는 대부분 HRP로 표시된 시냅스전 막에 원주적으로 국한됩니다.따라서 DLG와 HTS는 매우 근접해 있으며 시냅스 후 영역에서 복합체를 형성할 가능성이 높습니다. 그 결과는 결핍된 HTS 돌연변이와 관련된 음성 대조군으로 특이적입니다. HTS 면역반응성은 관찰 가능한 PLA 신호가 없음을 보여주며, bns의 고배율 보기는 DLG와 HTS 면역반응이 시냅스후 막에서 심하게 겹치는 것을 보여줍니다.대조적으로, 두 단백질 사이의 PLA는 개별 PUNCTA를 초래하여 전체 DLG 및 HTS 단백질의 하위 집합만 일단 마스터되면 복합체에 있음을 나타냅니다. 이 기술은 완료하는 데 표준 면역조직화학 절차보다 더 오래 걸리지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유충 NMJ에서 발생하는 내인성 단백질 단백질 상호 작용의 세포 내 국소화를 감지하기 위해 PLA가 어떻게 사용되는지 잘 이해하게 될 것입니다.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 우리는 뼈 Morphogenetic의 단백질 (BMP) 고정 세포에 신호를 시각화하는 항체의 조합과 근접 내고 분석 (괞찮아)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 BMP4 자극을 아래에 효과기 - 단지를 활성화 내생 BMP의 핵 축적에 따라 자신의 수준 시간이 지남에를 정할 수있었습니다.

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

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Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

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소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

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Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

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초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

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검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

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