Name: 케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 T세포에서 케모카인 자극 후 세포 형태와 단백질 위치 변화를 이미징 유세포측정법으로 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 대규모 세포 집단의 통계적으로 강력한 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 크게 피에르 Bourdoncle, 토마스 길버트와 코친 이미징 시설의 루이스 Rimbault을 인정합니다. 이 작품은 INSERM, CNRS와 리그 국립 contre 르 암 (퀴프의 labellisée)에 의해 지원되었다.

T 림프구의 1. 준비 <ol><li> 10, 11 설명 된대로 기본 마우스 또는 인간 T 세포를 준비합니다. </li><li> 3 × 106 세포 / ml - (2)의 농도에서 10 % 인간 AB 혈청 완전한 RPMI 배지에서 인간 T 세포를 배양. 주 : 배양 인간 T 세포의 많은 부분의 자발 분극을 유도 할 수 소 태아 혈청 (FCS) 대신에 인간 혈청을 사용. 이 기간 동안 언제든지 5 일 추가로 과정을 - 4 문화에서 이러한 세포를 보관하십시오. </li><li> 유사한 세포 밀도로 10 % FCS가 보충 된 완전 RPMI 배지에서 마우스 T 세포를 유지한다. 10 NG / ㎖ IL7의 존재하에 37 ℃에서 즉시 또는 다음 날, O / N에서 배양 한 후 사용한다. </li><li> 완전한 RPMI 10 % FCS로 보충 된 CEM 인간 T 세포주를 배양. </li></ol> 2. 케모카인 자극 <ol><li> 10 mM의 Hepe 보충 따뜻한 HBSS 매체에 실험 조건 당 5 × 10 5 세포를 씻으의. 몇 가지 실험을 위해, 2 μg의 pmaxGFP 8 μg의 한 pcDNA3.1 + (빈 벡터 제어), 죽은 PKCζ 키나아제, 또는 N- 말단 Par6 플라스미드로 전날 차 인간 T 세포를 공동 형질. </li><li> 따뜻한 HBSS - 헤 페스 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (실험 조건 0.3 ㎖의 X 번호를 사용). </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 배포합니다. 주 : 따라서 단일 실험 조건에 대응 한 튜브를 0.3 ㎖의 HBSS - 헤 페스 매체에 5 × 105 세포를 포함 할 것이다. 일부 실험에서, 500 nM의 Latrunculin 또는 비히클 (DMSO)를 첨가하고, 케모카인 자극 전에 30 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 각 튜브에 10 NG / ㎖의 CCL19 또는 CXCL12 케모카인 (500)에 추가합니다. 참고 : 우리는 보통 10 사용 - 인간 T 세포에 대한 200 NG / ml의 케모카인을. CEM 세포는 CCL19 결합 CCR7 수용체를 발현하지 않습니다. 따라서, CEM 세포 만 CXCL12 자극에 응답 할 수있다. 500 N - 또한, 높은 케모카인 농도 ((300)를 사용하여g / ml)를 마우스 T 세포를 편광 시키. </li><li> 튜브를 수회 뒤집고 각각 일차 T 세포 또는 CEM을 8 또는 10 분 동안 37 ° C까지 수조에서이를 부화. </li><li> 각 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 PBS의 10 mM의 Hepes를 함유 따뜻한 용액 0.3 ㎖를 첨가하여 분극 처리를 중지. 튜브를 뒤집어 5 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화. </li></ol> 3. 염색과 <ol><li> 튜브 유동 세포 계측법하기 위해 마이크로 원심 튜브에서 세포를 전송합니다. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 mM의 EDTA PBS 및 10 mM의 Hepes를 함유 RT 용액으로 완전히 관을 채운다. </li><li> 4 분 동안 460 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS에서 5 % FCS를 함유 RT 용액 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 멀리 빛, 소용돌이를, 각 튜브에 FITC-항 HLA-ABC의 5 μl를 추가하고, 실온에서 30 분 동안 그들을 품어. </li><li> , PBS 5 %를 FCS를 함유 한 번 세포를 씻으한 번만 PBS와 ND. </li><li> RT에서 : 다음 1 % BSA, 0.5 mM의 EDTA와 PBS에서 10 mM의 HEPES를 포함하는 용액으로 세포를 씻어 10 분 동안 품어, 500 ㎕의 1 % PFA를 추가합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 PBS는 0.2 % BSA, 0.1 % 사포닌, 0.5 mM의 EDTA 10 mM의 헤 페스 (투과성으로 버퍼)를 포함하는 용액으로 완전히 튜브를 입력합니다. </li><li> 이 매체에 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 배지를 제거하고 세포 펠릿을 해리하도록 와류 튜브 플립. </li><li> 각각의 튜브에 방지 P-ERM 항체의 100 희석, 소용돌이를하고 실온에서 30 분 동안 품어 : 및 / 또는 1 0.25 ㎍ / ㎖의 TRITC-Phalloidin의를 추가합니다. </li><li> 투과성으로 버퍼와 세포를 씻으십시오. 형광 이차 항체로 인큐베이션 필요한 경우. </li><li> 200 μl의 PBS에 세포를 재현 탁하고 마이크로 원심 튜브로 전송. 참고 : 세포는 획득을위한 준비가되어 있습니다. 튜브에 200 μL의 최대 총 부피를 유지하면서 선택적으로, 최종 1 %로 농축시켜 추가 PFA세포는 추가 처리를 위해 당일 사용되지 않아야하는 경우, 순서의 염색 농도를 유지한다. </li></ol> 4. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 장치 (특정 시약 / 장비의 표 참조)로 전환하고 제조업체의 지침에 따라 자체를 교정 할 수 있습니다. 참고 : INSPIRE 소프트웨어는 40 배 목표 (0.75 NA)로 사용되었다. IDEAS 3.0 소프트웨어는 모든보고 정량화에 사용되었다. </li><li> 미래의 실험 템플릿에 저장할 수 있습니다 획득 일련의 창을 준비합니다. RMS 그라데이션 값을 정량화 히스토그램을 그립니다. RMS 그라데이션 막대 그래프에서 선택한 &quot;초점에서&quot;인구에서, 지역의 히스토그램에서 &quot;단일 셀&quot;인구 경계를 정하다. 마이크로 원심 튜브가 기기에 삽입되면, 각 셀에 대한 게이트 레이저 파워를 조정하고 5000 T 림프구를 취득. </li><li> 부드러운 아이디어도자기, 인수 파일을 열고 각 셀에 대해 얻은 밝은 필드 이미지의 그라데이션 RMS 값의 값을 표시하는 막대 그래프 (채널 1)을 만듭니다. 57 위의 RMS에게 그라데이션 값을 나타내는 세포를 고려 RMS 그라데이션 히스토그램에 게이트를 그립니다. 참고 : RMS 구배 분석 초점면에있는 경우에만 T 림프구에서 고려 허용합니다. 우리는 (57)에 우수한 그라데이션 RMS 값을 나타내는 각각의 세포는 초점면에 있고, 정확하게 고려 될 수 있음을 경험적으로 결정했다. </li><li> 분석 / 마스크 메뉴에서, 2 픽셀의 침식 시야 이미지 M01,의 형태 마스크에서 (M01,2)을 침식라는 새로운 마스크를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 분석 / 침식 (M01,2) 마스크 계산 영역의 새로운 기능을 만들 메뉴를 갖추고 있습니다. 게이트 이전에 선택된 셀로부터,이 새로 만든 마스크를 이용하여 상기 셀 영역을 나타내는 히스토그램을 연다. 참고 :에 의해 사용할 수있는 형태의 마스크디폴트는 셀의 실제 크기보다 훨씬 더 크다. 따라서,이 화소로까지 침식 더 정확하다. </li><li> 교정 구슬과 이물질 (작은 지역)과 이중선 (대형 지역)을 제외한 개별 T 세포에 게이트를 그립니다. 각 인수에서이 게이트를 조정합니다. 주 : 셀 크기에 변동이 게이트의 위치에 영향을 미칠 것이다. 마우스 T 세포가 스스로 CEM 세포보다 작은 인간 T 세포보다 작은 같이, 각 세포 유형의 면적의 크기에 비례한다. </li><li> 이전 단계에서 게이트 된 하나에 초점 세포를 감안하면, 팔로이 딘의 원시 최대 픽셀의 함수로 HLA-ABC 염색에 원시 최대 픽셀의 (채널 2, X 축)로 구성되는 점 음모를 엽니 다 염색 (채널 4, Y 축). 흠 또는 포화 형광 이벤트를 제외 게이트를 만듭니다. 원시 최대 HLA-ABC를위한 픽셀 (채널 2) 팔로이 딘 (채널 4)의 염색을 보여주는 열기 두 히스토그램. </li><li> 분석 / 마스크 메뉴, CREAT에서2 픽셀의 침식 HLA-ABC 염색 된 세포 (채널 2)의 형태 마스크에서 (M02,2)을 침식라는 개 새로운 마스크. 그런 다음, 분석 / 침식 (M02,2)에 계산 된 원형 매개 변수로 구성된 새로운 기능을 생성, 메뉴 특징. 참고 :이 매개 변수는 원에서 셀 모양의 편차를 측정합니다. 따라서, 완전한 원형 T 세포는 낮은 원형도 지수를 나타낼 것이다 편광 신장 세포 반면 높은 원형도 값을 가질 것이다. </li><li> 이어서, 이전 셀로부터 게이트 된 원형 형상의 값을보고 다른 히스토그램을 생성한다. 직접 각각의 개별 셀에 대한 원형도 값에 따라 개인 합초 세포군의 분포를 플롯이 히스토그램을 사용한다. </li><li> 비 - 자극 된 세포에 대한 히스토그램의 형상을 살펴보면, 원형 제한값까지 낮은 원형도 값에서 시작하여, 편광 된 셀을 그리 게이트 여기서 비 자극 된 세포의 대부분플롯됩니다. 게이트 인구 중 편광 세포의 비율에 대한 통계의 디스플레이를 확인합니다 (%는 정문). 참고 : 우리는 13 아래 원형 인덱스 값이 게이트를 설정했습니다. </li><li> 세포에서 액틴 염색 편광보고하기 위하여, HLA-ABC 염색 (채널 2) 및 팔로이 딘 염색을 비교 밝은 세부 비슷한 R3 값에 대한 히스토그램을 플롯 (채널 4). 주 :이 기능의 더 큰 값이 더 적 착색 개의 중첩이다. </li><li> 이전과 같은 게이팅 전략을 사용하여, 편광 액틴 염색 세포의 백분율을 나타낸다 분리 염색 비 자극 된 세포에 게이트 플롯. </li><li> 완료되면, MHC 클래스 I 및 팔로이 딘 염색에 함께 SD ± 모든 세포의 원형과 비슷한 인덱스의 평균값으로 편광 된 세포의 비율의 분포에 편석을 나타내는 세포의 비율은 corresp에 나타낸다onding 통계 패널. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

계측법, 신속하고 유익한 게이팅 전략 케모카인 자극에 의​​해 유도 된 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 촬상 흐름의 최신 기술을 사용하는 것이 제시된다. 케모카인 자극 분극 공정 동안 서로 다른 단백질의 세포 내 분포에 의해 유도 된 세포 형태의 변화 : 하나의 실험에서, 하나는 정보의 두 가지 유형을 얻을 수있다. 흥미로운 증거가 통계적 견고성과 전체 세포 집단의 작은 부분의 분석이 가능 관련된 다수의 셀을 분석 할 수있는 가능성이 제공된다. 보고 된 바와 같이,이 기술은 또한 면역 시냅스 (12)의 맥락에서 분자 재분배 이벤트를 분석하는 데 사용될 수있다. 또한, 유사한 셋업 이미 sdf1로 자극 된 T 세포에 사용되었지만 두 마커 사이의 공동 편재 정도 더 분석은 (13)이 제공되지 않았다. 비록따라서,이 기술은 많은 세포 유형에 적합 할 수 있고, 부착 세포를 직접 분석 할 수없고, 현탁액 중의 세포는 앞서 획득을 고정 할 필요가...

케모카인 전문 위치 1에 세포를 유치 작은 수용성 단백질이다. 따라서, 그들은 조직에서 세포의 정확한 위치, 개발 및 생리에 중요한 기능에 참여하고 있습니다. 이 효과적인 면역 반응을 탑재 콘서트 행동 많은 다른 종류의 세포의 작용에 의존으로 면역 시스템은이 규칙에 예외는 아닙니다. 외부 항원이 검출 중화되기 전에 주어진 상태에서 하나의 면역 세포 유형의 특정 위치를 제어함으로써, 케모카인 장치들이 필요하다. 특히 T 림프구에서, 케모카인은 T 세포 운동성 2,3- 호의 결합시, 다양한 세포 내 신호를 유도하는, 특정한 표면 수용체 (칼슘 증가, ERK 인산화의 Rho GTP 아제 활성, 인테그린 친화 세포 골격 변화의 증가)에 결합한다. 세포 수준에서, 하나는 케모카인 유도 자극에 형태 학적 변화를 관찰 할 수있다.세포 모양에서 이러한 변화는 T 세포에서 특히 극적 : 혈류에 여행 할 때 휴식 T 세포가 구슬처럼 둥근 형태를 가지고있다. 앞에 리딩 에지​​ : 그러나, 염증 부위에 또는 림프 기관의 근방에서 케모카인의 존재를 감지 해주기 양극성 형태로 이루어진 전형적인 &quot;핸드 미러&quot;형태를 채택하는 T 세포의 모양을 변경하려고 그리고 다시 4에서 트레일 링 에지, 또는 uropod. 또한, 균체 내 성분은 마이그레이션을 유지 편광 T 세포의 두 대향하는 영역으로 분리 할 수​​있다. 예를 들면, 케모카인 자극 5 및 액틴 중합시 액틴 필라멘트 중합 증가 편광 된 T 세포 (2)의 전방에 축적한다. 한편, 이러한 피질 F 액틴 세포 골격에 세포막 링크 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM)과 가족의 인산화 된 단백질과 같은 여러 가지 단백질의 편광 uropod에 다시 문 지역화T 세포 (6). 흥미롭게도, 우리 등이 분극 처리는 T 세포의 이주를 위해 필요하다는 것을 보여 주었다. 실제로, 편광을 방해하는 어떤 치료는 세포의 운동성을 억제합니다. 예를 들어, 비정형 단백질 구성원의 활성의 억제는 C (PKC) 계열, 및 PKCζ PKCι 블록 T 세포와 수지상 세포 편광 7들의 이동성 스캔 과정 키나아제. T 세포 분극도의 Rho GTP 아제에 의해 조절된다. 우리는 최근에 기재된 Fam65b에서 RhoA 의한 단백질 활성의 조절이없이 Transwell 분석 6 마이그레이션 T 세포 형태의 변화 및 능력을 방해 것을 보여 주었다. 편광 세포 운동성위한 필수 단계로서, 케모카인은 응답의 메인 리드로 정량화 할 수있는 것이 결정적으로 중요하다. 세포 모양의 변화는 이전에 수동으로 8 측정 하였다. 그러나, 이러한 종류의 정량은 매우 시간 소모적이며, 그 보통 몇 그래서세포의 수만 고려된다. 여기서, 새로운 방법이 급속 케모카인 자극에 노출 된 T 림프구의 형상 변화의 정도를 정량화하기 위해 제시된다. 기술 계측법 촬상 유동은 케 모킨 자극 상이한 조건에서 효율적으로 편광 된 세포의 양을 정량화하는 유세포 및 현미경 (9)의 이점을 결합하는 데 사용된다 (특정 시약 / 장비의 도표 참조). 하나의 기술이 견고하게 측정 할 수있는 형태 학적 변화의 정량화에 또한, 케모카인 시그널링시 일부 단백질의 세포 내 위치 변화를 평가하는 것도 가능하다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>보체를 비활성화하기 위해 예열합니다.</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>보체를 비활성화하기 위해 예열합니다.</td></tr><tr><td>인간 T 세포 핵인자 키트</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>부분 표본은 세포에 케모카인을 첨가하기 전에 얼음에서 해동합니다.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>부분 표본은 세포에 케모카인을 첨가하기 전에 얼음에서 해동합니다.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>부분 표본은 세포에 케모카인을 첨가하기 전에 얼음에서 해동합니다. 이 케모카인은 마우스 T 세포에도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>전자 현미경 과학</td><td>157-8-100</td><td>이것은 물에 8 % PFA 용액입니다. PBS에서 4% PFA 용액을 얻기 위해 2x PBS와 부피 간 혼합</td></tr>.<tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC 항체</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>클론 B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>암니스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

세포는 과정이라고 편광 자신의 원형을 잃고으로 많은 단백질의 세포 내 현지화를 변경하여 자극을 케모카인에 응답합니다. 고전 이미징 기술은 이러한 현상을 연구하는데 사용되어왔다. 그러나 이러한 형태 및 세포의 수만 염색 공동 지역화 시간 소모적 정량화 하였다 많은​​ 세포의 수동 요구를 취득. 여기서, 신속하고 강력한 방법은 사이토의 것과 현미경의 장점을 결합한 기술 계측법 촬상 흐름을 이용하여 상기 셀 수천 이루어진 샘플들에 이러한 현상을 연구하기 위해 설명된다. MHC 클래스 I 분자와 사상 액틴 용 CCL19 염색 자극 T 림프구를 사용하여, 게이팅 전략 동시에 형상 변화의 정도 및 CCL19 시그널링에 의해 영향 마커의 공동 국산화 정도를 측정하기 위해 제공된다. 또한,이 게이팅 전략은 observ 우리를 허용전자 CXCL12 자극 후 편광 T 세포 (전면) 사상 액틴과 (후면) 인산화 Ezrin-Radixin-Moesin (포스 ERM) 단백질의 분리. Par6 / 비정형 PKC 신호 전달 경로의 돌연변이 발현 억제제 및 약리학 적으로 액틴 중합 억제제 등이 기술은 두 개의 서로 다른 편광 소자에 차단 효과를 관찰하는데 유용 하였다. 따라서, 증거는이 기술은 단백질의 형태 학적 변화 및 ​​재분배 모두를 분석하는 유용한 것을 알 수있다.

여기에서 선택된 첫 번째 예 CCL19 자극 인간 차 T 림프구의 용도에 관한 것이다. 그러나 동일한 전략은 기본 마우스 T 세포, T 세포 라인 또는 케모카인 자극에 응답하여 임의의 다른 세포 유형과 함께 사용될 수있다. 여기에 제시된 게이팅 전략 포커스 이벤트 후, 단일 세포를 선택하는 일련의 윈도우를 포함한다. (그림 1) 또는 CCL19 자극 (그림 2) T 림프구 휴식의 MHC 클래스 I HLA-ABC와 사상 굴지 : 마지막으로 형광 강도의 범위는 두 개의 마커 여기에 예를 들어옵니다. 첫째, 원형 인덱스는 미처리 (도 1) 또는 CCL19 자극 (도 2) T 림프구로 측정된다. 휴식 세포가 높은 진원도 인덱스의 값이 큰 단일 피크를 가지고 있다는 사실은 대부분의 세포가 반올림에 가까운 있음을 나타냅니다. 그러나, CCL19 자극는 O 외관을 유도...

케모카인 신호전달은 세포 형태의 현저한 변화와 세포 내 단백질의 몇 가지 중요한 재분포를 이끌어냅니다. 여기에서는 이러한 이벤트를 연구하기 위한 빠르고 상세한 프로토콜이 제공됩니다.

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

다음 절차의 목표는 특정 자극에 대한 반응으로 많은 수의 세포에서 관심 있는 특정 단백질의 세포 형태 및 세포 내 국소화의 변화를 빠르고 자동으로 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 관심 화학요법 종류로 T 세포를 자극함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 세포를 형광 표지한 다음 이미징 유세포 분석으로 분석합니다.마지막 단계에서는 형태학적으로 편광된 림프구의 수와 형광 마커의 편석량을 선택한 마스크에 따라 각 염색에 대한 픽셀의 위치와 강도를 기반으로 평가할 수 있습니다. 궁극적으로, 이 이미징 유세포 분석 기술은 케모카인 자극 후 림프구의 형태학적 변화뿐만 아니라 편광된 세포 내 관심 단백질의 위치를 빠르고 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 가장 큰 장점은 많은 수의 세포를 반복적으로 처리하고 자동으로 분석할 수 있어 형태학적 변화와 단백질 분포에 대한 통계적으로 강력한 분석을 확보할 수 있다는 것입니다.케모카인 자극 T 림프구에서, T 세포의 보슈 종류 자극은 10 밀리몰 HEP 원심 분리기가 보충 된 따뜻한 HBSS에서 실험 조건 당 5 개의 세포를 5 회 중앙 G.At 세척하는 것으로 시작하여 supinate를 제거하고 튜브 당 0.3 밀리리터의 따뜻한 HBSS he 조각에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 케모카인 밀리리터당 10-500나노그램을 첨가한 다음 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다.섭씨 37도의 수조에서 세포를 배양합니다. 8-10분 후 0.3ml의 따뜻한 2%파라알데히드에 10밀리몰을 보충하여 편광을 멈춥니다. 그는 완두콩을 먹는다.그런 다음 튜브를 더 많이 뒤집어 혼합하고 섭씨 37도에서 5분 더 배양하여 면역 형광 분석을 위해 세포를 염색합니다. 다음으로, 자극된 T 세포를 해당 유세포 분석 튜브로 전달합니다. 튜브에 염색 완충액을 완전히 채웁니다.그런 다음 세포를 스핀다운하고 PBS에 있는 5% 태아 송아지 혈청 100마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 각 튜브에 5마이크로리터의 ZI N-T-H-L-A-A-B-C를 추가합니다. 그것들을 소용돌이치고 배양이 끝날 때 어둠 속에서 실온의 30분 동안 세포를 배양합니다.세포를 두 번 세척한 다음 500마이크로리터의 1%파라 포름알데히드에서 배양합니다. 10분 후, 더 많은 염색 완충액으로 세포를 세척한 다음 투과 완충액으로 튜브를 완전히 채웁니다. 투과 완충액에서 세포를 두 번 세척한 후 튜브를 남겨 supinate를 제거한 다음 와류를 일으켜 세포 펠릿을 해리했습니다.이제 샘플을 밀리리터당 25마이크로그램의 영점으로 염색하고, 등심은 trixi로 염색하고, 와류로 염색하고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 기간이 끝나면 투과 완충액에서 세포를 세척합니다. 다시 말하지만, 소생.펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 현탁시킨 다음 세포를 개별 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 케모카인 자극 후 편광된 T 세포의 비율을 측정합니다. 먼저 이미징 유세포 분석기를 켜고 제조업체의 지침에 따라 자체적으로 보정하도록 합니다. RMS 그래디언트에서 선택된 인포커스 모집단에서 RMS 그래디언트 값을 정량화하는 히스토그램을 그립니다.히스토그램은 일단 마이크로 분리기 관이 기계에 삽입되면, 지역의 히스토그램에 단 하나 세포 인구를 묘사하고, 개인적인 세포에 레이저 힘 보행을 조정하고 5의 000의 T 림프구를 취득한다. 아이디어 분석 소프트웨어에서. 획득한 파일을 연 다음 각 개별 세포에 대해 얻은 명시야 이미지에 대한 기울기 RMS 값을 보여주는 히스토그램을 만들고 세포에 게이트를 그려 RMS 기울기 값이 57 이상인 것을 나타냅니다.분석 메뉴에서 2개의 픽셀로 침식된 명시야 이미지 M zero one의 형태학 마스크에서 erode M1 two라는 새 마스크를 만듭니다. 그런 다음 분석 기능 메뉴에서 이전 게이트에서 생성된 셀의 침식 M1 두 마스크에서 계산된 영역의 새 기능을 만듭니다. 세포의 면적을 보여주는 히스토그램을 엽니다.이 새로 생성된 마스크를 사용하여 작은 영역의 보정 비드와 파편과 넓은 영역의 이중선을 제외한 개별 T 세포에 게이트를 그립니다.그런 다음 분석 마스크 메뉴에서 Phin 염색의 원시 최대 픽셀의 함수로 H-L-A-A-A-B-C 염색에 대한 원시 최대로 구성된 봇을 2 개의 픽셀로 침식 된 H-L-A-A-B-C 염색 세포의 형태학 마스크에서 2 개의 침식 M이라는 새로운 마스크로 만듭니다. 그런 다음 분석 피쳐 메뉴에서 침식 M two two에서 계산된 원형도 매개변수로 구성된 새 피쳐를 생성합니다.그런 다음 다른 히스토그램을 만들어 이전에 제어된 셀의 원형도 기능 값을 보고합니다. 그런 다음 자극되지 않은 세포에 대한 히스토그램의 모양을 살펴보면, 편광된 세포에 대한 RO 마노는 가장 낮은 원형도 값에서 시작하여 대부분의 자극되지 않은 세포가 세포 내 액틴 염색의 분극을 평가하기 위해 플롯되는 원형도 한계 값까지 원형도 한계 값까지 볼 수 있습니다. 또한 밝은 세부 유사성을 위한 히스토그램, H-L-A-A-B-C와 염색 시 FOID를 비교하기 위한 R 3 값.그런 다음 방금 시연한 것과 동일한 게이팅 전략을 사용하고, non co localized segregated staining을 위해 자극되지 않은 세포에 GA를 추가합니다. 통계 패널은 여기에서 편광 액틴 염색이 있는 T 세포의 백분율을 보여줍니다. 비편광 또는 편광 세포의 게이트에 속하는 CCL 19 자극 T 림프구의 예가 표시됩니다.두 하위 집단 간의 형태 차이를 명확하게 관찰할 수 있습니다. 방금 시연된 게이팅 전략은 CCL 19가 존재하지 않는 경우 편광 게이트에 속하는 세포의 비율을 표시하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예상대로, 케모카인 자극이 편광된 T 세포의 비율을 증가시킨다는 것은 분명합니다.두 조건 모두에서 얻은 전체 세포 집단의 평균 원형도 지수도 표시할 수 있습니다. 실제로, CCL 19 자극은 이 지수의 하락을 이끌어냅니다. 그러나 세포의 절반만 편광되어 있기 때문에 CCL 19 자극에서 관찰된 평균 순환성 지수의 변화는 작습니다.이 실험에서, T 세포는 극성 복합체 par 6의 우성 음성 돌연변이에 대한 플라스미드 인코딩과 함께 GFP로 간이 절제되었습니다. PKC 제타. nont 형질주입된 세포에 대한 히스토그램은 전체 세포 집단의 작은 부분에서 작은 부분이 형질주입되었음을 나타내는 관련 GFP 양성 T 세포에 대한 특정 게이팅을 허용했습니다.그런 다음 이러한 형질주입된 세포의 형태학적 분극 정도를 GFP 양성 세포의 순환도 지수와 T 세포에 대한 추가 보행만 측정하여 정량화했습니다. 낮은 순환성 값을 나타내는 것은 취해진 각 조건에서 편광된 세포의 백분율을 추정하기 위해 만들어졌습니다. 이러한 데이터는 신호 경로에 대한 par six PK CZ의 기능 중단이 CCL 19 및 c Xcl 12 케모카인에 의해 유도되는 T 세포 분극을 억제한다는 것을 보여줍니다.이전 연구 결과와 일치합니다. 이 절차를 시도하는 동안 림프구의 강력하고 신뢰할 수 있는 형태학적 분극을 보장하기 위해 insolution kin stimulation 단계와 다음 고정 전반에 걸쳐 항상 섭씨 37도에서 작업하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

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배우세요 T세포에서 케모카인 자극 후 세포 형태와 단백질 위치 변화를 이미징 유세포측정법으로 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 대규모 세포 집단의 통계적으로 강력한 분석을 가능하게 합니다.

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

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