척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 척수 손상에 대한 타박상 모델을 자세히 설명한 다음 신경 줄기 세포를 이식하는 것입니다. 이는 먼저 사후 분석, 신경 전구 세포 또는 PM NPC를 바이탈 트레이서 PKH 26으로 라벨링하여 수행됩니다. 다음으로, 마우스의 등쪽 절개를 하고 척수를 노출시킵니다.

그런 다음 무한 지평선 또는 IH 임팩터 장치를 사용하여 척수에 병변을 만듭니다. 마지막으로, PKH 26으로 표지된 PM 및 PC를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 궁극적으로, 생착된 PKH 20 6:00 PM과 병변 부위의 PC의 운명을 따릅니다.

부상 모델은 척수 손상 남성을 복제합니다. 일차적인 기계적 손상 다음에는 진행성 2차 변성이 뒤따르며, 여기서 세포 및 약물 치료가 연구됩니다. 설명된 적용들은 신앙에 대한 더 깊은 통찰을 얻을 수 있는 방법론적 기초를 제공할 수 있다.

퇴행 및 염증 사건이 발생하는 동안 척수에 이식된 줄기세포의 유도. 병변을 시연하는 것은 실험실의 박사 과정 학생인 Tony Laja Longo 박사가 될 것입니다. 꼬리 주사는 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Ache가 수행하며, 텍스트 프로토콜에 설명된 기준을 충족하는 신경 줄기 세포부터 시작합니다.

Resus는 150 마이크로 리터 당 6 개의 세포에 10의 1 배의 농도로 세포를 현탁시킵니다. 파이펫을 로드하기에 충분한 세포를 갖기 위해 마우스당 6개의 세포에 대해 최소 1.2배, 10을 준비합니다. 신경 줄기 세포 배지를 사용하여 10ml 원뿔형 바이알에 세포를 세 번 세척하고 실온에서 5분 동안 500배 G로 회전시켜 세포를 펠릿화합니다.

각 세척 후, 최종 스핀 카운트 전에, 세포는 회전 후 상등액을 흡인하여 세포의 흡인을 방지하기 위해 약 25 마이크로 리터의 액체를 남깁니다. 다음으로, 세포 입천장에 1ml의 희석제 C를 첨가하여 2X 현탁액을 준비하고 부드러운 피펫팅을 사용하여 즉시 재현탁합니다. 염색하기 전에 튜브에 있는 희석제 C 1밀리리터에 PKH 26 에탄올 D 용액 4마이크로리터를 첨가하여 희석제 C에 2x 염료 용액을 준비하고 잘 혼합합니다.

빠르게 분산시키기 위해 1ml의 2 x cell 현탁액을 1ml의 2 XD 용액에 첨가하고 즉시 피펫팅으로 샘플을 혼합합니다. cell die suspension을 1-5분 동안 배양한 후 HBSS에 동일한 부피의 1%BSA 용액을 첨가하여 염색을 중지하고 1분 동안 incubation합니다. 그런 다음 500배 G에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

10ml의 완전 배지를 사용하여 세포 회수율, 세포 생존율 및 형광 강도를 평가하기 위해 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 원심분리하여 상층액을 버리고 세포 펠릿에 10ml의 HBSS를 첨가합니다. HBSS로 두 번 세척하고 멸균 생리학적 용액에 세포를 재현탁합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 수술 부위와 마우스를 준비한 후, 수술 중 저체온증을 피하기 위해 메스로 동물의 등쪽을 슬라이드 워머에 올려 놓고 겸자를 사용하여 T 7에서 T 12까지의 관심 영역을 수직 절개합니다. 다섯 번째와 여섯 번째 흉부 돌기 사이의 공간 사이에 있는 피부와 표재성 지방 패드를 실체 현미경으로 잡습니다. 혈관 아래의 과정을 T 6으로 세고 T 7로 이동합니다.

그런 다음 마우스의 복부 쪽 아래에 약간의 베어링을 놓아 척추의 곡률을 높이고 그로프 집게를 사용하여 척추를 막아 고정합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 얇은 판의 등쪽 표면이 메스 끝에 닿을 때까지 척추 수준에서 척추 수준에서 T 7에서 T 10까지 척추 근육의 파라를 양측으로 자릅니다. 그런 다음 메스를 사용하여 척추 수준에서 T 7에서 T 10까지의 접합부를 체크하고 얇은 판의 등쪽 표면이 T 8과 T 9 사이의 작은 돌출부 사이의 공간에 있는 메스 끝 정지와 접촉할 때까지 확인합니다.

그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 T 8과 T 9, T 9와 T 10 사이의 조직을 자릅니다. 이제 rongeur를 사용하여 T nine 프로세스를 제거하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 근육층을 조심스럽게 긁어내어 접합부를 노출시킵니다.

뼈가 드러날 때까지 계속합니다. 집게를 사용하여 얇은 판에서 근육을 제거하고 척추 사이에 작은 공간을 엽니다. 그런 다음 뼈 아래에 마이크로 가위를 부드럽게 삽입합니다.

양쪽의 얇은 판을 자르고 집게를 사용하여 제거하여 탯줄을 노출시킵니다. 론 주르를 사용하여 남아 있는 비어 있거나 들쭉날쭉한 뼈 조각을 제거합니다. 그런 다음 T nine 등쪽 돌기의 위쪽 절반을 제거합니다.

IH 임팩터 장치 프로토콜을 따른 후, 본문의 지침에 따라 4개의 OH 흡수성 봉합사를 사용하여 제거된 얇은 판 부위의 노출된 척수를 먼저 덮어 절개 부위를 봉합합니다. 밑에 있는 근육이 끼이지 않도록 주의합니다. 2개 또는 3개의 반사 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.

허리 아래쪽에 2ml의 식염수를 피하로 주입하고 마우스를 가열 패드의 예열 케이지에 넣어 회복합니다. 세포의 꼬리 정맥 주입을 수행합니다. 시험관에 세포를 재현탁시키고 0.3ml 주사기에 75마이크로리터를 장전하여 세포 현탁액에 기포가 없는지 확인합니다.

세포 침전을 방지하려면 주사기를 수평 위치에 두십시오. 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 마우스를 구속기로 부드럽게 당겨 좁은 파란색 선으로 나타나는 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다.

알코올 면봉을 사용하여 꼬리를 청소하고 정맥이 보이면 왼손의 중지와 엄지 손가락 사이의 꼬리 정맥을 잡습니다. 본 영상에서 보여준 T9 타박상은 뒷다리 기능의 일과적 상실을 일으켰으며, 부상 후 30분, 6시간, 18시간 후에 꼬리 정맥에 3회 주사하여 5번째 세포 또는 PBS를 10회 주입하였다. 여기에서 볼 수 있듯이, 2-3주 이내에 PBS는 부상을 입었고, 마우스는 개선되었으며, 뒷다리 기능은 PM.NPCs로 처리된 마우스의 기저 마우스 척도 또는 BMS의 3점에 도달했지만, 여기에서 볼 수 있듯이 대부분의 생착된 PM NPC는 PKH 26으로 표지되어 병변 형성 클러스터의 가장자리에 축적되었습니다.

투여 직후, 이식된 세포는 병변 가장자리를 따라 이동했고 더 확산된 방식으로 뉴런으로 분화했습니다. 병변 및 이식 후 30 일에, pm NPC의 세포체는 크기가 증가하고 대부분의 세포에서, 수지상 같은 과정은 명백하고 특정 항체에 의해 완전히 면역 염색되었습니다.이 프로 절차를 얻는 동안, 더 높은 힘이 더 심한 부상으로 인해 동물의 사망률을 증가시킬 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 병변 발생 패러다임의 패러다임을 사용하고, 그 다음에는 보다 재현 가능한 회복 과정을 사용할 것을 제안합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 무한 지평선 임팩터를 사용하여 마우스의 외상성 척수 손상에 대한 재현 가능한 실험 모델을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.