Name: 척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 배우세요 쥐의 척수 손상 충돌 모델에서 신경 줄기 세포 이식 기법을. PKH 26로 표지한 전구 세포를 꼬리 정맥에 주입하여 손상 부위에서 세포의 운명을 추적하고 재생 의학 연구에 활용하는 방법을 익히세요.

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저자는 FAIP(Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), "Neurogel-en-Marche" 재단(프랑스), Fondazione "La Colonna"의 경제적 지원을 인정합니다.

참고 : 모든 절차는 밀라노 대학의 심의위원회의 승인을 유럽 공동체 지침 일자 1986년 11월 (6백9분의 86 / EEC)을 준수하여 실험 동물에 대한 이탈리아의 가이드 라인을 충족했다. 이식 용 세포의 1. 준비 참고 : 5,이 실험에 대한 문화에서 9 통로 사이에 사용 신경 줄기 세포; 이식 표지되기 전에 증식 및 분화 능력에 대한 문화를 테스트합니다. (12)를 면역 세포로 분화의 정도를 결정합니다. <ol><li> 1 × 106 세포 / 150 μL (이식 마우스 1 마리당 1 × 106 세포)의 농도로 세포를 재현 탁. 세포의 과잉이 주사기 로딩을 위해 필요하기 때문에 마우스 당 최소 1.2 × 10 6 세포를 준비합니다. </li><li> 10 ML 원뿔 유리 병에서 세포를 신경 줄기 세포 매체 (13)를 사용하여 3 회 반복한다. 각에서세척 단계를 원심 분리에 의해 침전물을 셀 (500 XG 5 분간 RT). </li><li> 마지막 스핀 전에 세포를 계산합니다. </li><li> 세포 (5 분 500 XG)를 원심 분리기하고 모든 세포를 제거하지 않도록주의하면서 그러나 상층 액의 25 개 미만 μl를 떠나, 뜨는을 대기음. </li><li> 부드럽게 피펫 팅과 세포 펠렛을 재현 탁하고 희석액 C 1 ㎖를 첨가하여 2 배 세포 현탁액을 제조. </li><li> 튜브에 희석제 C 1 ㎖에 PKH26 에탄올 염료 용액의 4 μl를 추가하여 희석제 C에서 - (6 M 4 × 10)과 분산 잘 혼합 즉시 염색을하기 전에, 배 염료 솔루션을 준비합니다. </li><li> 신속 배 염료 액 1ml에 2 배 세포 현탁액 1ml를 추가하고 즉시 (ML 1.2 × 10 7 세포 / 2 × 10이 될 것이다 최종 세포 밀도 - 6 M PKH26) 피펫으로 시료를 혼합한다. </li><li> 1-5 분 동안 셀 / 염료 서스펜션을 품어. </li><li> (동일한 부피를 첨가하여 2 염색을 중지mL) 중 HBSS에 1 % BSA 용액 1 분 동안 배양한다. </li><li> 원심 분리기 세포 (500 XG 분 10) 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> HBSS 원심 분리 (5 분, 500 XG) 10ml에 재현 탁 된 세포 펠렛. </li><li> 결합되지 않은 염료의 제거를 보장하기 위해 완전 배지 10 mL로 세포 펠렛을 2 번 더 세척 하였다. </li><li> 복구 세포, 세포 생존 및 형광 강도의 평가를위한 완전 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포는 이식을 위해 필요한 경우, 세척 및 3.3 X 105 세포 / 50 μL의 농도로 멸균 된 생리 용액에서 그들을 재현 탁. </li></ol> 수술 2. 준비 <ol><li> 청소 및 소독 수술 장비. </li><li> 무균 에이전트 닦아 수술 영역을 준비합니다. IH 임팩터 장치를 설정합니다. </li><li> 마취 장비를 준비합니다 VetScav 필터, 연속 흐름 유도 상공 회의소, 산소 진 장치의 무게와 활성 가스 소제rator, 마우스에 대한 저 유량 O 2 미터. 유도 챔버 및 수술시 사용되는 마스크를 청소합니다. </li><li> 2.5 % 산소 (v / v)의 이소 플루 란 (/ 분 1 L)과 동물을 마취하고, 약물을 적용하려면 흐름 유도 후 5 분을 기다립니다. 수염이 꿈틀 경우 확인하거나 발바닥을 곤란에 응답 속도가 느린 뒷다리 철수가있는 경우. 수술하는 동안, 2.0 % 산소 (v / v)의 이소 플루 란 (/ 분 1 L)에 이소 플루 란 농도를 감소. </li></ol> 수술 및 이식을위한 마우스 3. 준비 <ol><li> 표준 조건에서의 실험 (22 ± 2 ° C, 습도 65 %, 그리고 오전 8시부터 오후 8시까지 사이에 인공 조명) 전에 최소 3 일 동안 성인 남성 CD1 마우스 (25 ~ 30 g)을 유지합니다. 참고 : 봉합으로 수술 준비에서 전체 절차는 약 40 분 소요됩니다. <ol><li> 동물을 식별하기 위해 방수 색 잉크에 의해 꼬리를 표시합니다. </li></ol></li><li> ELECTR를 사용하여IC 깎기는 요추 영역에 대한 T2 수준에서, 목에서 마우스의 등 머리를 잘라합니다. </li><li> 요오드 용액 및 에탄올 (멸균 70 %)로 제조 된 영역을 소독. </li><li> (200)의 서브 피부 (SC) 주입 μL 겐타 마이신 (멸균 생리 식염수에 1 ㎎ / ㎖)와 동물을 취급합니다. </li><li> 부 프레 노르 핀을 탈수를 방지하고 주입하는 두 동물의 눈 안과 윤활제를 적용 (피하, 0.03 ㎎ / ㎏)은 통증을 경감 할 수 있도록하고있다. </li></ol> 4. 후궁 절제술 <ol><li> 수술 중 저체온증의 문제를 방지하기 위해 슬라이드 따뜻한에 마우스를 놓습니다. 등쪽면을 위로하여 동물을 배치합니다. </li><li> T7에서 T12에 관심 영역에 걸쳐 메스와 수직 절개를합니다. </li><li> (일반적으로 흉부 등의 프로세스 번째 5 번째와 6 사이의 공간에 있음) 표준 집게를 사용하여 피부 표면의 지방 패드를 잡습니다. </li><li> T6와 같은 용기하에 프로세스 개수다음 T7로 이동합니다. </li><li> 척추의 만곡을 증가 마우스의 복부 측면에서 작은 베어링을 놓습니다. Graefe 씨 집게로를 차단하여 척수를 고정. </li><li> 라미 접촉 메스 팁의 지느러미 표면까지 메스를 사용하여 T7과 T10 척추 수준에서 양측 척추 주위 근육을 잘라. </li><li> T10까지 T7에서 접합을 체크하기 위해 메스를 사용합니다. T8 및 T9 가시 돌기 사이의 공간에 중지합니다. 마이크로 가위 T8-T9과 T9-T10 사이의 조직을 잘라. <ol><li> T9 프로세스를 제거 Rongeur를 사용합니다. 신중 마이크로 가위 근육층 모으기하여 접합을 노출. 뼈가 노출 될 때까지 계속합니다. </li></ol></li><li> 얇은 판에서 근육을 제거하고 척추 사이의 작은 공간을 열기 위해 집게를 사용합니다. 조심스럽게 뼈 아래에있는 마이크로 가위를 삽입 양쪽에 얇은 판을 잘라 집게로이 부분을 제거합니다. </li><li> F와 라미 제거orceps는 코드를 노출합니다. 뒤에 어떤 무료 또는 톱니 뼈 조각이 남지 않도록해야합니다; Rongeur으로 제거합니다. </li><li> 절개 근처에있는 것입니다 골막뿐만 아니라 뼈 조각이나 근육을 제거하기 위해 작은 팁 집게를 사용합니다. </li><li> T9 지느러미 과정의 위쪽 절반을 제거하고 IH 임팩터 장치 프로토콜로 진행합니다. </li></ol> 5. IH 임팩터 장치 프로토콜 (타박상) <ol><li> IH 장치의 임팩터 안정화 플랫폼의 중앙에 마우스를 놓는다. </li><li> 두 공동 위치 무기에 의해 안정화 플랫폼과 연결된 두 치아 집게로 동물 (흉추에 대한 왼쪽 팔, 경추에 대한 오른팔)을 차단합니다. </li><li> 주동이의 추체 (T8)의 측면 가장자리를 파악하는 주동이의 팔을 사용합니다. </li><li> T10 척추체를 파악하는 것이 동일한 방식으로 아암을 조작 꼬리. </li><li> 끝을 장치의 안정화 플랫폼을 놓고 낮은 (직경 0.75mm)을 터치하지 않고 가능한 한 코드에 가깝게. </li><li> 영향을 시작하기 전에 끝을 세 완전한 회전을 올립니다. </li><li> 100mm / sec로 60 kdyn의 힘을 제공하기 위해 설정 충격기와 타박상을 수행합니다. </li></ol> 6. 봉합 및 사후 관리 <ol><li> 4/0 흡수성 봉합사와 절개를 봉합. 제거 박판의 노출 부위에서 척수를 표지; 작은 바늘을 이용하여 절단 말단에서 조직을 봉합. 바로 위 척수 노출의 사이트에서 두 개의 바늘을 넣습니다. </li><li> 기본 근육을 곤란하게하지 않고 두 개 또는 세 개의 반사 클립을 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 허리에 주입 된 식염수의 피하에 2 ㎖와 마우스 수술 후 수분을. </li><li> 수술 복구하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 다시 예열 케이지에서 마우스를 놓습니다. 가열 패드에 배치 새장. </li><li> 을 확인하여 급성기 이후 부상 동안 마우스를 모니터크기 방광, 봉합사 및 동물 중량 하루에 두번. 부드럽게 (묻은, 흐림이나 침전물을 함유하는 수 소변) 요로의 감염을 방지하기 위해 블래 더 (7 일 동안 하루에 두 번) 짠다. </li><li> 항생제 (이일 수술 후 피하 주입을위한 2 ml)에 생리 식염수 주입으로 하루에 한 번 마우스를 치료 (겐타 마이신 0.2 ml를, SC 주입) 5 일 동안이 부상을 게시 할 수 있습니다. </li><li> 부 프레 노르 핀과 수술 후 통증에 대한 쥐 치료 (0.1 ㎎ / ㎏을, 하루에 두 번) 3 일간 부상을 게시 할 수 있습니다. </li></ol> 세포의 7 꼬리 정맥 주입 참고 : 다음 단계에서 꼬리 정맥 내로 세포를 주입하기위한 절차가 설명된다. 세포는 또한 고정대 15-16을 사용하여 이식 척수 내 투여, 또는 치스 테르 나디 라티 나 마그나 (17) 내로 할 수있다. 이는 다른 세포 유형과 같은 중간 엽 기질 세포와 같이이 방법으로 이식 될 수 있음을 고려해야(예를 들어, 골수 간엽 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 세포 양수). 또한, 이러한 나노 입자와 같은 다른 치료 옵션이 척수 손상 후 꼬리 정맥을 통해 주입 될 수있다. <ol><li> 사용하기 전에 바늘을 청소하는 70 % 에탄올과 PBS를 사용합니다. 바늘 만 멸균 장갑 주사기를 처리합니다. </li><li> 0.3 ml의 주사기 (29 G 바늘 및 주사기 0.33 CC)로 테스트 튜브 및로드 셀의 75 μl를 세포에 재현 탁. </li><li> 기포가 세포 현탁액 내에 존재 없는지 확인합니다. 세포의 침강을 방지하기 위해 수평 위치에서 주사기 유지. </li><li> 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 가열 램프 아래에 마우스를 놓습니다. </li><li> 좁은 파란색 선으로 측면 꼬리 정맥을 시각화하기 위해 마우스 제한 수단으로 조심스럽게 잡아 당겨 마우스를 잡고. </li><li> 알코올 면봉으로 꼬리를 청소합니다. 정맥이 가시화되면, 왼쪽 손의 가운데 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리 정맥을 잡아. </li><li> 수평선에서 15도 각도로 표면에 바늘을 가져오고 경사가 있는지 확인합니다. </li><li> 0.33 μL / sec의 속도로 세포의 50 μl를 주입한다. 주입 후, 10 초 바늘의 수축을 지연. 천천히 바늘을 후퇴 및 세포 현탁액의 가능한 유출에주의를 기울이십시오. </li><li> 부하 사이의 단계 7.1에서와 같이 주사기를 청소합니다. </li></ol> 8. 행동 테스트 및 뒷다리 기능 <ol><li> 열기 필드에서 마우스를 놓습니다. </li><li> 바소 마우스 규모 (BMS) (18)에 따라 오픈 필드 테스트와 타박상 후 전위의 기능과 뒷다리 복구를 평가합니다. 참고 : 신경 기능 4 주 (18)에 대한 손상 후 3 일에서, 정기적으로 평가되어야한다. </li></ol> 9. 관류 <ol><li> 실험 기간의 끝에서, 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사 (65 ㎎ / kg)에 의해 동물을 마취. evaluat하기 위해 발가락 핀치를 사용전자 마취 수준은 마우스가 유해 자극에 응답하지 후에 만​​ 진행합니다. </li><li> 수술 비행기에 앙와위에서 동물을 제지합니다. </li><li> 흉곽 아래의 외피와 복부 벽을 통해 잘라. 간에서 다이어프램을 분리합니다. </li><li> 흉강을 노출 다이어프램을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 칼라 뼈까지 흉곽의 측면을 잘라. </li><li> 칼 모양의 연골을 고정하고 머리 지혈을 배치 지혈제를 사용합니다. </li><li> 집게로 횡단하는 비행기에 마음의 바닥 세 번째를 잡습니다. 좌심실에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 마음을 고정하는 지혈제를 사용합니다. 이 바늘을 확보하고 유출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 우심방을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> PBS는 동물을 통해 (18 ml / 분)을 펌프 할 수 있습니다. (약 70 ml의 PBS에 해당하는 3-4 분) 버퍼 주입 기간 동안이 압력을 유지한다. 마음이 깨끗해질 때까지 계속합니다.</li><li> 펌프를 통해 정착액 (증류수에서 4 % 파라 포름 알데히드, 4 % PFA)을 허용하는 꼭지를 전환합니다. 4 % PFA는 약 8 ~ 10 분 (300 ml)에 대한 동물을 통해 펌프 할 수 있습니다. 점차적 / 분으로 30 ㎖가 최대에 도달하는 압력을 증가시킨다. 강화 간 성공적인 관류의 가장 좋은 지표이다. </li></ol> 10. 조직 수집 및 처리, 조직학 및 Iimmunohistochemistry <ol><li> T5에서 L1에 척수를 해부하다. 그리고 (4 ° C에서 O / N) 4 % PFA 6 ml의 조직을 사후 수정. </li><li> 크라이를 보호하고 동결 중에 결정의 형성을 방지하기 위해 39 ° C에서 72 시간 동안 30 % 수크로오스 용액과 동일한 조직을 넣어. </li><li> 빠른 드라이 아이스를 사용하여 코드를 동결 -80 ° C에서 보관합니다. </li><li> 15㎛의 두께의 저온 유지 장치에 의해 부와 유리 슬라이드 상에 수집하고 섹션을 면역 세포 화학 계속. </li><li> 각의에 대한 PBS 200 μL와 섹션을 씻어LIDE (3 회, 각 5 분, RT). </li><li> (200) 10 % NGS의 μL 및 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 각 슬라이드를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL (5 분마다, RT 3 회)와 섹션을 씻어. </li><li> (; PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 5 % NGS) 30 분 (RT)에 대한 슬라이드 차단 솔루션의 200 μL와 비 특정 사이트를 차단합니다. </li><li> 4 ° C에서 O / N 차 항체 200 ㎕를 각 슬라이드를 품어 (5 % NGS에 항체를 희석; PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100). </li><li> 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL로 섹션을 씻으 (3 회, 5 분마다; RT). </li><li> 실온에서 2 시간 동안 적절한 보조 항체를 품어. </li><li> 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL로 섹션을 씻으 (3 회, 5 분마다; RT). </li><li> 4 &#39;, 6- diamidin -2- phenilindole (DAPI) (/ ml의 최종 농도 1 μg의, RT에서 10 분) 200 μL와 얼룩 핵. </li><li> FluorSave 시약을 사용하여 마운트하고 공 초점 현미경으로 분석 할 수 있습니다. 참고 :에서제어 결정, 차 항체를 생략하고 같은 서브 클래스의 무관의 IgG 해당하는 농도로 교체해야합니다. 미세 소관 연관 단백질 2 차 항체를 사용 하였다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계를 선언합니다.

본 논문에서는 (중증) 70 kdyne의 힘에 무한 호라이즌 임팩터를 이용하여 외상성 척수 손상 모델의 재현성을 얻기위한 방법을 설명했다. 더 큰 힘 패러다임 (80 kdyne)를 사용하여, 우리는 불행하게도 더 높은 마우스의 사망률보다 심각한 부상을 입을 수 있습니다. 이 문제를 방지하기 위해, 우리는 일반적으로 기능 및 저급 사망률의 점진적인 회복 반복 환부에 연관된 적당한 힘 패러다임 (kdyne 70)를 선택한다. 그것은 임팩터 플랫폼 동물의 정확한 고정에 특히주의하는 것이 매우 중요하다 그러한 안정한 부상을 생성하는 단계; 특히 척수 임팩터 팁 중심되어야하고 임팩터의 2 개의 아암은 서로 평행해야한다. 또한, 관심은 척추가 분쇄 될 수 있으며, 코드가 포셉의 팁에 의해 손상 될 수있는 경우, 임팩터 집게로 동물을 차단에주의해야합니다. 애니의 위치척추 후궁 절제술 후 L이 중요하고,이 과정 중 동물 취급도 매우 중요하다. 특별한주의는 항상 같은 사이트에서 같은 연장을 수행해야하는 후궁 절제술 절차에 부여해야합니다. 이러...

척수 손상 (SCI)은, 운동, 폭력 1, 자동차 사고와 같은 고 에너지 외상으로 인한 가장 흔한 부상이다 빠진다. 심한 SCI에서 부상 힘은 신경 기능의 갑작스러운 손실을 일으키는 신경 조직을 파괴 또는 손상. 외상 SCI 나이 10, 40 세 사이의 젊은 성인에서 자주 발생합니다. 그것은 크게 환자의 정신적, 육체적 조건에 영향을 미치는 사회 2에 엄청난 경제 효과가 발생합니다. 급성기의 치료 방법은 자주 가능성이 더 손상 3-4 감쇠 코르티코 스테로이드, 수술 안정화 및 압축 해제의 고용량에 한정되어 있지만, SCI 후 전위의 복구에 이러한 방법의 역할은 여전히 논란이있다. 급성 조직 손실, 외상 및 여러 세포 유형 5-6의 변성의 원인이 탈수 초화와 죽음의 보조기구의 활성화뿐만 아니라. 기능의 회복 정도의 수열은 부상 사이트 7에서 절약 백질의 정도에 상관 관계. SCI의 동물 모델은 부상으로 조직의 생물학적 반응을 조사하고 치료 가능성을 테스트하기 위해 모두 사용될 수있다. 또한, 인간 병리 유용한 동물 모델뿐만 아니라 그 상태의 일부 측면을 재현하는 아니라 직접 관찰과 임상 실험에 비해 많은 장점을 제공한다. 척수 손상의 가장 널리 사용되는 모델은 노출 된 척수 수술 8로 전달되는 압축 타박상 또는 부상을 포함한다. 제어 무게 드롭 타박상 부상의 개발은 SCI 연구의 역사에서 중요한 이정표를 나타냅니다. 오하이오 주립대 척수 연구 센터 컴퓨터 (9)에 의해 제어 된 충격 파라미터를 척수의 특정 압축을 유도하기 위해 사용될 수있는 장치의 기술적 과제를 추구하고있다. 이것은 원래 사용 위스콘신 위해 설계되었습니다일 쥐; 나중에 쥐 10으로 적용하도록 수정되었습니다. 이러한 종류의 접근 방식의 이점은 손상의 역학은 더 깊이 연구 할 수 있고 부상 파라미터 재현성 실험 모델을 얻기 위해서 더욱 완벽한 방식으로 정의 될 수 있음을하며, 따라서 효과의보다 정확한 평가를 허용 기능 회복 과정에 대한 시험 처리. 많은 연구 SCI 모델 (11)에서 줄기 세포의 다양한 이식 효과를 평가했다. 우리는 최근에 마우스 기증자 (12 ~ 13)의 죽음 이후 하위 심실 구역 (SVZ) 몇 시간에서 성인 신경 줄기 세포를 격리했다. 이 절차는 SCI 치료를위한 재생 의학의 접근에 유리한 것으로 보인다 신경 줄기 세포라는 사후 신경 전구 물질 (PM-의 NPC)의 인구를 제공합니다. 본 논문에서는 설명 할 것이다 : ⅰ) 중요한 추적 PKH26와 셀 라벨을위한 프로토콜, ⅱ) surg적인 절차는 외상 SCI에 수행하고, 표지 세포의 ⅲ) 정맥 주사 (IV) 관리합니다. 또한,이 연구에서 우리는 이식 된 세포가 척수 병변 사이트로 마이그레이션 및 미세 소관 관련 단백질 (MAP)이 양성 세포에 주로 차별화 것을 보여줍니다. 또한, 분화는 뒷다리 기능의 안정 회복 촉진 수반한다.

<table><tbody><tr><td>PKH26GL-1KT&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>091M0973</td><td></td></tr><tr><td>인피니트 호라이즌 (IH) 임팩터 장치&nbsp;</td><td>Precision Systems and Instrumentation, LLC</td><td>모델 0400 시리얼 0171</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin 10 mg/ml</td><td>Euroclone</td><td>ECM0011B</td><td>멸균 식염수 용액 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Isoflurane-Vet 250 ml</td><td>Merial</td><td>B142J12A</td><td></td></tr><tr><td>Blefarolin POM OFT 10 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>2Biological Instruments</td><td>HB101-sm-402</td><td></td></tr><tr><td>메스, 크기 10</td><td>Lance Paragon</td><td>26920</td><td></td></tr><tr><td>Small Graefe Forceps</td><td>2Biological Instruments</td><td>11023-14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Medicon Instruments</td><td>07 60 07</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>2Biological Instruments</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합사 (4/0)</td><td>Safil Quick</td><td>C0046203</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>2Biological Instruments</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 7 wound clip applicator</td><td>2Biological Instruments</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>7 mm Reflex wound clips</td><td>2Biological Instruments</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>1086431000</td><td></td></tr><tr><td>Anti Microtubule Assocoated Protein&nbsp; (지도) 2</td><td>Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 시약&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr>2mm l-글루타민(Euroclone), 0.6% 포도당(Sigma-Aldrich), 9.6gm/ml 푸트레신(Sigma-Aldrich), 6.3ng/ml 프로게스테론(Sigma-Aldrich), 5.2ng/ml 아셀렌산나트륨(Sigma-Aldrich), 0.025mg/ml 인슐린(Sigma-Aldrich), 0.1mg/ml 트랜스페린(Sigma-Aldrich) 및 2&mu를 포함하는<td>신경 줄기 세포 배지</td><td></td><td></td>;<td> g/ml 헤파린(나트륨 염, 등급 II; Sigma-Aldrich), bFGF(인간 재조합, 10ng/ml; Life Technologies) 및 EGF(인간 재조합, 20ng/ml; Life Technologies)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>유로클론</td><td>ASM5002</td><td></td></tr><tr><td>l-글루타민</td><td>유로클론</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5780-25G</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6149-1MG</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-셀레나이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9133-1MG</td><td></td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 5391</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨-염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0200000</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>h-EGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>주사기 0.33 cc 29 G</td><td>Terumo</td><td>MYJECTOR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>Schering Plough SpA</td><td>TEMGESIC</td><td></td></tr><tr><td>아이 젤</td><td>Bausch & 롬</td><td>리포식</td><td></td></tr></tbody></table>

척수 손상의 실험 contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

척수 손상은 신경 기능 장애의 복잡한 특징으로하는 파괴적인 임상 상태입니다. 척수 손상의 동물 모델은 부상 생물학적 반응을 조사하고 치료 가능성을 테스트하기 위해 모두 사용될 수있다. 수술로 노출 된 척수에 전달 타박상 또는 압축 부상 병리의 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 보고서에서 실험 타박상 특정 상해 매개 변수의 정의를 통해 재현 손상 동물 모델을 만들 수있는 무한 호라이즌 (IH) 충격기 장치를 사용하여 수행됩니다. 줄기 세포 이식이 일반적 쇠약 상태를 경화시키기위한 전략 잠재적으로 유용한 것으로 간주된다. 많은 연구는 줄기 세포 이식의 다양한 효과를 평가했다. 여기에서 우리는 CD1 쥐에서 세포의 꼬리 정맥 주입 다음 척수 손상에 대한 적응 방법을 보여줍니다. ⅰ) 셀 라벨 위스콘신 : 즉, 우리는 절차를 제공중요한 추적 제, II) 마우스의 수술 전 치료, contusive 척수 손상의 III) 실행, 사후 부검 신경 전구체의 IV) 정맥 투여. 이 모델은 타박상 재생 의학 접근법 효능 및 줄기 세포 이식의 안전성을 평가하기 위해 이용 될 수있다.

이식 된 세포의 총 수는 1 × 10 6 세포이며 꼬리 정맥에서 세 개의 연속 주사로 분할 하였다. 우리는 인산 완충 용액 50 μL (PBS)에 3.3 × 105 세포를 투여. 첫 번째 주사는 두 번째 6 시간 후, 손상 후 30 분 내에서 수행 병변 후 지난 18 시간했다. PM-NPC의 SCI에 대한 투여 후 18 시간의 시간 제한의 선택은이 시점에서 14의 혈액 뇌 장벽의 투과성을 최적으로 결정 하였다. 줄기 세포 주입의 효과를 평가하기 위해 또한 양성 대조군 laminectomies 동물이 유용 할 것이다 (N = 14)와 PBS가 음성 대조군 (N = 14)로 주입 된 동물. PM-의 NPC, 뒷다리 기능의 복구를 향상 병변 사이트로 마이그레이션 및 MAP-2 양성 세포의 분화 T9는 타박상 프로그레시브 g이어서 뒷다리 기능의...

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 척수 손상에 대한 타박상 모델을 자세히 설명한 다음 신경 줄기 세포를 이식하는 것입니다. 이는 먼저 사후 분석, 신경 전구 세포 또는 PM NPC를 바이탈 트레이서 PKH 26으로 라벨링하여 수행됩니다. 다음으로, 마우스의 등쪽 절개를 하고 척수를 노출시킵니다.그런 다음 무한 지평선 또는 IH 임팩터 장치를 사용하여 척수에 병변을 만듭니다. 마지막으로, PKH 26으로 표지된 PM 및 PC를 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 궁극적으로, 생착된 PKH 20 6:00 PM과 병변 부위의 PC의 운명을 따릅니다.부상 모델은 척수 손상 남성을 복제합니다. 일차적인 기계적 손상 다음에는 진행성 2차 변성이 뒤따르며, 여기서 세포 및 약물 치료가 연구됩니다. 설명된 적용들은 신앙에 대한 더 깊은 통찰을 얻을 수 있는 방법론적 기초를 제공할 수 있다.퇴행 및 염증 사건이 발생하는 동안 척수에 이식된 줄기세포의 유도. 병변을 시연하는 것은 실험실의 박사 과정 학생인 Tony Laja Longo 박사가 될 것입니다. 꼬리 주사는 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Ache가 수행하며, 텍스트 프로토콜에 설명된 기준을 충족하는 신경 줄기 세포부터 시작합니다.Resus는 150 마이크로 리터 당 6 개의 세포에 10의 1 배의 농도로 세포를 현탁시킵니다. 파이펫을 로드하기에 충분한 세포를 갖기 위해 마우스당 6개의 세포에 대해 최소 1.2배, 10을 준비합니다. 신경 줄기 세포 배지를 사용하여 10ml 원뿔형 바이알에 세포를 세 번 세척하고 실온에서 5분 동안 500배 G로 회전시켜 세포를 펠릿화합니다.각 세척 후, 최종 스핀 카운트 전에, 세포는 회전 후 상등액을 흡인하여 세포의 흡인을 방지하기 위해 약 25 마이크로 리터의 액체를 남깁니다. 다음으로, 세포 입천장에 1ml의 희석제 C를 첨가하여 2X 현탁액을 준비하고 부드러운 피펫팅을 사용하여 즉시 재현탁합니다. 염색하기 전에 튜브에 있는 희석제 C 1밀리리터에 PKH 26 에탄올 D 용액 4마이크로리터를 첨가하여 희석제 C에 2x 염료 용액을 준비하고 잘 혼합합니다.빠르게 분산시키기 위해 1ml의 2 x cell 현탁액을 1ml의 2 XD 용액에 첨가하고 즉시 피펫팅으로 샘플을 혼합합니다. cell die suspension을 1-5분 동안 배양한 후 HBSS에 동일한 부피의 1%BSA 용액을 첨가하여 염색을 중지하고 1분 동안 incubation합니다. 그런 다음 500배 G에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.10ml의 완전 배지를 사용하여 세포 회수율, 세포 생존율 및 형광 강도를 평가하기 위해 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 원심분리하여 상층액을 버리고 세포 펠릿에 10ml의 HBSS를 첨가합니다. HBSS로 두 번 세척하고 멸균 생리학적 용액에 세포를 재현탁합니다.텍스트 프로토콜에 따라 수술 부위와 마우스를 준비한 후, 수술 중 저체온증을 피하기 위해 메스로 동물의 등쪽을 슬라이드 워머에 올려 놓고 겸자를 사용하여 T 7에서 T 12까지의 관심 영역을 수직 절개합니다. 다섯 번째와 여섯 번째 흉부 돌기 사이의 공간 사이에 있는 피부와 표재성 지방 패드를 실체 현미경으로 잡습니다. 혈관 아래의 과정을 T 6으로 세고 T 7로 이동합니다.그런 다음 마우스의 복부 쪽 아래에 약간의 베어링을 놓아 척추의 곡률을 높이고 그로프 집게를 사용하여 척추를 막아 고정합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 얇은 판의 등쪽 표면이 메스 끝에 닿을 때까지 척추 수준에서 척추 수준에서 T 7에서 T 10까지 척추 근육의 파라를 양측으로 자릅니다. 그런 다음 메스를 사용하여 척추 수준에서 T 7에서 T 10까지의 접합부를 체크하고 얇은 판의 등쪽 표면이 T 8과 T 9 사이의 작은 돌출부 사이의 공간에 있는 메스 끝 정지와 접촉할 때까지 확인합니다.그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 T 8과 T 9, T 9와 T 10 사이의 조직을 자릅니다. 이제 rongeur를 사용하여 T nine 프로세스를 제거하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 근육층을 조심스럽게 긁어내어 접합부를 노출시킵니다.뼈가 드러날 때까지 계속합니다. 집게를 사용하여 얇은 판에서 근육을 제거하고 척추 사이에 작은 공간을 엽니다. 그런 다음 뼈 아래에 마이크로 가위를 부드럽게 삽입합니다.양쪽의 얇은 판을 자르고 집게를 사용하여 제거하여 탯줄을 노출시킵니다. 론 주르를 사용하여 남아 있는 비어 있거나 들쭉날쭉한 뼈 조각을 제거합니다. 그런 다음 T nine 등쪽 돌기의 위쪽 절반을 제거합니다.IH 임팩터 장치 프로토콜을 따른 후, 본문의 지침에 따라 4개의 OH 흡수성 봉합사를 사용하여 제거된 얇은 판 부위의 노출된 척수를 먼저 덮어 절개 부위를 봉합합니다. 밑에 있는 근육이 끼이지 않도록 주의합니다. 2개 또는 3개의 반사 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.허리 아래쪽에 2ml의 식염수를 피하로 주입하고 마우스를 가열 패드의 예열 케이지에 넣어 회복합니다. 세포의 꼬리 정맥 주입을 수행합니다. 시험관에 세포를 재현탁시키고 0.3ml 주사기에 75마이크로리터를 장전하여 세포 현탁액에 기포가 없는지 확인합니다.세포 침전을 방지하려면 주사기를 수평 위치에 두십시오. 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 마우스를 구속기로 부드럽게 당겨 좁은 파란색 선으로 나타나는 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다.알코올 면봉을 사용하여 꼬리를 청소하고 정맥이 보이면 왼손의 중지와 엄지 손가락 사이의 꼬리 정맥을 잡습니다. 본 영상에서 보여준 T9 타박상은 뒷다리 기능의 일과적 상실을 일으켰으며, 부상 후 30분, 6시간, 18시간 후에 꼬리 정맥에 3회 주사하여 5번째 세포 또는 PBS를 10회 주입하였다. 여기에서 볼 수 있듯이, 2-3주 이내에 PBS는 부상을 입었고, 마우스는 개선되었으며, 뒷다리 기능은 PM.NPCs로 처리된 마우스의 기저 마우스 척도 또는 BMS의 3점에 도달했지만, 여기에서 볼 수 있듯이 대부분의 생착된 PM NPC는 PKH 26으로 표지되어 병변 형성 클러스터의 가장자리에 축적되었습니다.투여 직후, 이식된 세포는 병변 가장자리를 따라 이동했고 더 확산된 방식으로 뉴런으로 분화했습니다. 병변 및 이식 후 30 일에, pm NPC의 세포체는 크기가 증가하고 대부분의 세포에서, 수지상 같은 과정은 명백하고 특정 항체에 의해 완전히 면역 염색되었습니다.이 프로 절차를 얻는 동안, 더 높은 힘이 더 심한 부상으로 인해 동물의 사망률을 증가시킬 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 병변 발생 패러다임의 패러다임을 사용하고, 그 다음에는 보다 재현 가능한 회복 과정을 사용할 것을 제안합니다.이 비디오를 시청한 후에는 무한 지평선 임팩터를 사용하여 마우스의 외상성 척수 손상에 대한 재현 가능한 실험 모델을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

출처: Lakshman, N., et al. 최소한의 척수 손상의 마우스 모델에서 내인성 신경 줄기 세포 활성화를 평가하기 위한 신경구 분석. J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 쥐 척수 손상 모델에서 신경 줄기 세포(NSC)의 활성화 및 이동을 보여줍니다. 척수를 노출시키기 위해, 마취된 마우스에서 척추의 흉부 부위에서 척추를 제거합니다. 그런 다음 구부러진 바늘을 사용하여 척수의 백질에 표면 손상을 만들어 중심관을 보존합니다. 부상 후 운하를 둘러싼 NSC가 활성화되고 조직 복구를 돕기 위해 부상 부위로 이동합니다.

 신경 줄기 세포 활성화 및 이동을 연구하기 위한 최소 척수 손상 모델

심각한 척수 손상의 타박상 모델이 설명되어 있습니다. 자세한 수술 전, 수술 및 수술 후 단계는 일관된 모델을 얻기 위해 설명되어 있습니다.

쥐에 심각한 척수 손상의 타박상 모델

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

자가조립 펩타이드(SAP)와 신경전구세포(NPC)를 성장 인자와 함께 사용하여 경추 척수 손상을 치료하는 것은 재생과 회복을 촉진하는 유망한 접근 방식입니다. 경추 SCI의 타박상/압박 동맥류 클립 랫 모델과 수액 주입 및 NPC 이식을 포함하는 복합 치료가 확립되었습니다.

실험 경추 척수 손상의 신경 전구체 세포 및 자기 조립 펩티드의 시너지 사용

심각한 척수 손상은 종종 조직 결함을 초래합니다. 급성 손상 후 및 완전한 척수 절개 후 5주 후에 기계적 마이크로 커넥터 시스템의 이식을 통해 쥐의 조직 적응, 재생 반응 및 기능 개선을 촉진하기 위해 이러한 격차를 성공적으로 메우기 위한 두 가지 가능성이 설명됩니다.

실험 전략은 급성 및 만성 병변 후 부상 척수에서 큰 조직의 차이를 극복하기

이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.

PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

이 논문에서는 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 생체 외 모델로 신경 줄기 세포로 이식된 장기 척수 기관형 절편을 생성하고 유지하기 위한 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for validating Cell transplantation in Spinal Cord (척수 손상에서 세포 이식을 검증하기 위한 플랫폼으로서의 장기 마우스 척수 유기형 절편 배양)

이 연구에서는 척수 손상 복구를 위해 지방 유래 줄기 세포의 재생 촉진 거동을 조사하고 활용하는 데 사용할 수 있는 신경 모방 복합 하이드로겔을 개발하고 특성화했습니다.

Stem Cell Delivery를 이용한 척수 손상 조합치료제 개발

배우세요 쥐의 척수 손상 충돌 모델에서 신경 줄기 세포 이식 기법을. PKH 26로 표지한 전구 세포를 꼬리 정맥에 주입하여 손상 부위에서 세포의 운명을 추적하고 재생 의학 연구에 활용하는 방법을 익히세요.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

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