Name: 형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 형광 흐름 중지 및 형광 표지 뉴클레오티드를 사용하여 키네신의 ATP 턴오버 주기에서 뉴클레오티드 결합 및 해리 동역학을 측정하는 방법을. 이 기법은 운동 단백질 기능 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC), 왕립 학회와 노팅엄 대학에서 지원됩니다.

Mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합에 따라 형광 강도의 변화의 1 결정. <ol><li> 적절한 반응 버퍼에 1 μM의 키네신 (최종 농도)에 1 μM의 mant 표지 뉴클레오티드를 추가합니다. 일반적으로 미세 소관의 성장과 안정성을 혜택을 버퍼 (설명을 참조)이 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 버퍼 80MM 피페 라진 비스-2-에탄 술폰산 (PIPES)가 포함 pH6.9, 1mM의 MgCl2를 및 1mM의 에틸렌 글리콜 비스-2-아미노 에테르 디아민 테트라 아세트산 (EGTA). 참고 : 모든 프로토콜에 명시된 키네신의 농도는 염기 결합 부위 (즉, 모터 도메인)의 농도를 의미한다. 다른 키네신은 단량체, 이량 체 또는 테트라로 존재 등 분자 당 하나 이상의 뉴클레오티드 바인딩 사이트를 포함 할 수 있습니다. </li><li> 잠복기 (1-3 분) 및 표준 fluorimeter 사용 후 mant 표지 된 뉴클레오티드 키네신 컴플렉스의 발광 스펙트럼을 측정한다. 365NM의 여기 파장을 사용측정 단위는 1nm 400-500 nm의 빛을 방출. </li><li> 단계 1.1에서 사용 된 것과 동일한 반응 완충액가 1mm의 용액 mant 표지 된 뉴클레오티드를 확인. </li><li> 전술 한 바와 같이, mant 뉴클레오티드에만 샘플 발광 스펙트럼을 측정한다 (단계 1.2 참조). </li><li> 이 값을 통해 나누어 (키네신없이 즉,) 용액 mant 뉴클레오티드의 형광 스펙트럼의 피크 강도의 파장에서 신호 스펙트럼을 정규화. </li><li> (예를 들어, 그림 2B)가 mantATP 바인딩 및 / 또는 솔루션 mantADP 바인딩 키네신과 mant 염기 사이의 형광 강도의 차이를 관찰하기 위해 정규화 된 스펙트럼을 그린다. </li></ol> mantATP 협회 및 해리 속도 상수의 2 측정 <ol><li> - 무료 버퍼 2 + 적절한 마그네슘 최대 20 μM의 키네신 (설명 참조)의 용액에 (예를 들어, 80MM 파이프 pH6.9, 1mM의 EGTA, 0.1 % 트윈 20) 하나를 추가MM은 (최종 농도) 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 1 ㎜ (최종 농도) 디티 오 트레이 톨 (DTT). 참고 :이 감소로 버퍼에 트윈 20의 추가 권장 / 버퍼 교환을 위해 사용되는 열을 키네신 단백질의 손실을 방지하는 단계 (2.3 및 3.3) </li><li> 15 분 동안 25 ° C에서 솔루션을 품어. </li><li> (물질의 목록 참조) 제조업체의 지침에 따라 중력 흐름 G-25 세파 덱스 겔 여과 컬럼을 사용하여 키네신에서 별도의 무료 염기 및 EDTA. <ol><li> 적절한의 Mg 2 + 불 함유 버퍼의 적어도 3 컬럼 부피로 컬럼을 평형화 (단계 2.1 참조). 컬럼 상에 키네신 함유 용액을로드합니다. 염화 마그네슘의 최종 농도는 용액 키네신의 컬렉션 후 1 ㎜가되도록, 빈 튜브 100mm의 염화 마그네슘 용액의 적합한 양을 첨가하여 포집 관을 준비한다. 마그네슘 클로라이드의 직접 첨가 열차 단 도움염기가없는 키네신을 SE는. </li><li> 적절한의 Mg 2 + 불 함유 완충액을 사용하여 용출 키네신. 빠르게 작업 할 때 중요하므로 염기의 무료 키네신은 불안정하다. 얼음에 염기가없는 키네신을 저장하고 1 ~ 2 시간 이내에 사용한다. </li></ol></li><li> 중이나 종래 뉴클레오티드 프리 키네신의 준비로, 염기 무 키네신의 최종 용액과 동일한 반응 완충액의 농도 mantATP 시리즈를 준비한다. 0.1 ~ 50 μM (단계 2.5 및 설명을 참조)에 이르기까지 전형적인 시리즈 키네신의 사용 가능한 농도에 따라 필요한 mantATP의 농도의 범위를 결정합니다. </li><li> 염기가없는 키네신의 농도 시리즈를 준비합니다. mantATP의 각 농도 (단계 2.4)의 경우, 무 염기 키네신의 농도 mant 표지 된 뉴클레오티드가 키네신 뉴클레오티드 결합 부위 위에 5-10 배 몰 과량이되도록 제조한다. </li><li> 정지-FLO에 여기 파장을 설정365 ㎚에 fluorimeter w 및 긴 - 패스 필터를 사용하여&gt; 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다. </li><li> 정지 흐름 fluorimeter (그림 3a 및 3b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : mantATP의 가장 낮은 농도부터 하나의 염기가없는 키네신의 적절한 농도 mantATP을 섞는다. 참고 : 반응물이 혼합에 50 % 희석된다. 혼동을 피하기 위해 염기 농도 모두 사전 및 사후 혼합 (즉, 3.0 / 1.5 μM)를 기록해 두십시오. </li><li> mant기로 photobleaching에 설명하기 위해, 지수 함수를 더한 일정한 음의 기울기의 선에 mantATP의 각 농도에서 측정 된 형광 강도의 변화를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m를 =. t + 0 진폭 C), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는) 그림 (b)와 토론을 볼 시간입니다. 이러한 맞는에서를 결정mantATP 각각의 농도에서 상수 (k 개의 OBS)를 평가했습니다. 각 케이 OBS는 협회와 해리 속도 상수 (그림 1, K 1과 K-1)의 컨볼 루션이다. </li><li> (예를 들어, 그림 3C) mantATP 농도에 대해 케이 OBS 음모를 꾸미고하여 협회와 해리 속도 상수를 Deconvolve. 기울기와 y 축 절편을 얻기 위해 선형 함수 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K-1)에이 데이터를 맞 춥니 다. 그라디언트 단위 M -1의 -1과 mantATP 협회 (그림 1, K 1)에 대한 속도 상수를 나타낸다. 절편들 -1 (논의를 참조)의 단위와 해리 속도 상수 (도 1, K -1)을 나타낸다. 이 접근법은 또한 ADP 협회 및 해리를 결정하기 위해 적용될 수있다 : 참고염기로 mantADP를 사용하여 속도 상수 (그림 1, K -4 K 4). </li></ol> mantADP의 해리 속도의 3 측정 상수 <ol><li> 적합한 반응 완충액 2 μM의 키네신의 용액에 (예를 들면, 80 밀리미터 PIPES pH6.9, 1mM의 MgCl2를, 1mM의 EGTA는 0.1 % 트윈 20), 50 μM mantADP (최종 농도)를 추가한다. </li><li> 30 분 동안 25 ℃로 품어. </li><li> G-25 세파 덱스 컬럼을 사용하여 선택한 반응 버퍼에 키네신를 교환 버퍼에 의해 초과 mantADP 및 기타 무료 염기를 제거 제조업체의 지침에 따라 (물질의 목록 참조). 키네신 모터 도메인은 지금 mantADP로드해야합니다. </li><li> 365 ㎚에 정지 흐름 fluorimeter에 여기 파장을 설정하고 긴 통과 필터를 사용하여&gt; 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다. </li><li> 50 배 이상 MOLA으로 mantADP.kinesin 단지 (~ 1μM)를 혼합정지 흐름 fluorimeter (그림 4a 및도 4b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : 1에서 레이블이없는 ATP의 R 초과. </li><li> 단일 지수 함수 플러스 mant 그룹의 광표백를 고려하여 일정한 음의 기울기의 라인에 시간이 지남에 따라 관찰 형광 강도의 감소를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m.t +를 = 공은 진폭 여기서 c), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는 시간,) 그림 (b)와 토론을 참조하십시오. 이 피트로부터 결정된 k 개의 S는 OBS -1 (논의를 참조)의 단위 ADP (도 1, K 4)의 해리에 대한 속도 상수이다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

여기에, 우리는 키네신에 대한 염기 상태 사이의 전환 역학의 관​​찰 및 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 급속 혼합 방법 정지 흐름을 이용한다. 이 유형의 방법은 키네신 9-11,13-16의 다양한 뉴클레오티드가 결합 및 해리 공부 광범위하게 사용되어왔다. 인산 릴리스 (그림 1, 3 단계)의 관찰을 허용하지 설명하는 방법. 그러나, 정지 흐름 형광은 형광 강도의 변화 (17)에 결합하도록 인산염의 인산염 생산을 감지 단백질을 이용하여 이러한 전환을 관찰하기 위해 사용될 수있다. 단백질에 결합 할 때, 일반적으로 형광 강도의 증가를 나타내는 작은 형광 단 methylanthraniloyl (mant)로 표지 뉴클레오티드를 이용 제시 방법. 또한, mant의 형광체는, 경우에 R 2 &#39;또는 3&#39;위치 중 하나에 접합ibose 종종 염기 9-12의 결합, 분해 또는 가수 분해에 거의 또는 전혀 효과가 있습니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 상업 소스 (재료의 목록 참조)에서 쉽게 사용할 수있는 단일 이성질체 8 정제 할 때 빠르게 다시 평형으로 2 &#39;및 3&#39;복합체의 혼합물로 제공됩니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 염기 결합과 분해의 반응 속도를 관찰 할 수있는 훌륭한 기자 분자를 확인합니다. 형광 표지 된 뉴클레오티드의 사용은 기재된 분석에서 형광 강도의 실시간 변경을 판독한다는 것을 의미한다. 이는 시약의 신속한 혼합과 후속 반응과 관련된 형광의 변화를 실시간 관찰을 허용 정지 흐름 형광, 이러한 분석에 적합하다. 검출의 방법으로서 혼합 기술과 같은 형광 정지 흐름의 조합이 상대적으로 샘플 EF 인 시스템을 생산ficient. 예를 들어, 0.8 필요도 3c에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 - 정제 키네신-13 1.0 mg의, MCAK는,도 4b에 도시 된 데이터를 획득하는 것은 ~ 정제 키네신-13, MCAK 0.3 밀리그램을 필요로한다. 형광 물질로서 mant의 사용의 한 가지 단점은 photobleaching에 경향이 있다는 것이다. 이것은 정지 흐름에서, 키네신의 부재 하에서, 반응 완충액 mant 표지 된 뉴클레오티드의 용액을 혼합하여, 반응 동력학을 키네신 분리하여 관찰 될 수있다. mant 그룹이 표백 된대로 형광 강도의 느린 감소는 관찰된다. mant 그룹의 광표백을 설명한 프로토콜에 사용되는 시간의 척도의 범위에서 잘 선형 함수에 의해 설명된다. 따라서, 광표백에 대한 데이터를 보정하는 방법은 단순한 하나의 파라미터에 의해 설명 된 선형 함수 (즉, MT + c)가 아닌 일반적인 평평한 기준선에 의해 설명 기준선 지수 함수로 적합 할 것이다. mantATP 바인딩 mantATP 협회와 해리에 대한 속도 상수 미세 소관의 부재에서 키네신 뉴클레오티드 바인딩 사이트와 연결된 상태를 유지 (2 절) ADP를 측정 할 때 제거해야합니다. 이 mantATP 협회와 해리 (그림 1, 1 단계) ADP 해리 분리하여 관찰 할 수 있습니다. 이 키네신은 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.1)를 통해 EDTA의 적어도 50 배 과량 인큐베이션 달성했다. EDTA는 마그네슘 2 + 이온은 염기 (11)의 방출을 초래 염기 결합 주머니에서 해리의 Mg 2 +를 일으키는 원인이 담즙산. 수행은 2.1 단계 때 따라서, - 2.3, 그것은 2 +의 Mg 무료 버퍼를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 염기가없는 키네신 단백질은 버퍼가 무료 염기로부터 EDTA에서 모두를 분리하는 교환이다. 이 분리, 일회용 중력 흐름 GE를 달성하기리터의 여과 열은 충분하며, 간단하고 (물질의 목록 참조)를 사용하는 것이 빠르다. 자유 염기와 mantATP 키네신의 상호 작용과 연관 해리 속도 상수 (단계 2.8)의 컨벌루션 있도록 mantATP 농도 (단계 2.4)의 범위에서 수행된다. 이러한 유형의 실험 뒤에 이론은 잘 하나 mantATP의 낮은 농도로 시작이 실험을 수행하는 참고 문헌 18에 기재되어있다. 이것은 다른 농도 사이의 세척 단계의 필요성을 제거합니다. 그것은 가능성 mantATP 농도가 증가함에 따라 중지 흐름 fluorimeter의 감도를 조정하는 것이 필요하다. mantATP 농도는 항상 의사 일차 조건을 유지하기 키네신 뉴클레오티드 결합 부위의 농도에서 최소한 5 배를 초과해야한다. mantATP의 농도가 증가함에 그러나, 신호 변화가 감소 키네신에 결합 뉴클레오티드의 분수로 일손이 될 수있다. Therefo, 키네신의 농도는 각각의 새로운 mantATP 농도 증가 mantATP 재 등의 농도는 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.6) 이상으로 10 배 몰 과량보다 결코 크다고. mantADP 해리 mantADP 협회 및 해리 속도 상수는 mantATP (섹션 2)에서 기술 한 바와 동일한 방법에 의해 측정 될 수 있지만. 키네신로부터 ADP의 해리 직접 mantADP.kinesin 착체이어서 비 표지 ATP (단계 3.5)의 과량 혼합 mantADP (단계 3.1-3.3)와 뉴클레오티드 결합 부위를 미리로드에 의해 관찰 될 수있다. 초과 레이블이없는 ATP는 키네신에 mantADP의 리 바인딩을 방지함으로써 mantADP 협회에서 분리에서 관찰 할 수있는 해리 반응 (그림 1, K 사)를 할 수 있습니다. 이 분석에서, 비 표지 ATP의 농도는 NUC의 적어도 50 배 몰 과량이어야결합 부위를 leotide. 이 분석 배후 이론은 잘 이러한 직접적인 방법은 단계 2.8에서 설명 된 Y-축에 외삽 상수보다 해리 속도에 대한 정확한 값을 제공 레퍼런스 18에서 설명된다. 미세 소관의 포함 설명 된 방법은 또한 미세 소관의 존재하에 염기의 결합 및 해리 동력학을 결정하는데 사용될 수있다. 미세 소관 전에 중지 흐름에 혼합에 염기가 포함 주사기 소개 : 그림 (b)와 (b)에서 낮은 주사기 (인 세트). 이 미세 소관을 만족시키는이 구성에서, 키네신은 동시에 뉴클레오티드를 만날 것이다. 안정화 된 미세 소관은 튜 불린 중합체의 수명은 안정화 화학, 하나의 사용에 의해 확장되는 경우, 사용되는 예컨대 &#39;구아노 신-5와 같은 탁솔 또는 nonhydrolysable GTP 유사체뿐만 - [(α, β) -methyleno] 삼인산 (GMPCPP는 물질의 목록 참조). 이는 액체 질소 9,19에서 수개월 동안 저장 될 수 있도록 미세 소관 GMPCPP와 튜 불린 중합의 2 사이클을 사용하는 것이 가능하다. 미리 제조 된 미세 소관의 사용은 상당히 이러한 분석을 수행하기에 실용적 어려움을 감소시킨다. 분석에서 미세 소관을 포함하기 위해, 미세 소관 안정에 적합한 반응 완충액을 사용하는 것이 중요하다. 선택의 버퍼 (BRB80라고도 함) 80 mM의 PIPES의 pH를 6.9, 1 mM의 MgCl2를 1 mM의 EGTA (20, 21)을 포함하는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼 기반 PIPES이다. 설명 된 방법은 키네신과 사용이 제한되지 않지만, 구성된 모든 뉴클레오티드 결합 단백질에 적용될 수있다. 예를 들어, 유사한 방법 분자 모터 (12,22)의 미오신 가족 mant 구아노 신 표지 된 뉴클레오티드의 사용의 상기 연장 부재의 ATP 회전율 사이클에 적용된이 유형의 방법은 단백질 23,24 GTP 가수 분해한다.

키네신은 고도로 보존 된 모터 도메인 한 것을 특징으로하는 단백질의 슈퍼 패밀리이다. 키네신 모터 도메인은 뉴클레오티드 의존적으로 미세 소관과 상호 작용한다. 키네신 가족의 구성원은 미세 소관 역학 2,3를 조절 비 전좌 미세 소관 최종 바인딩 키네신에 미세 소관을 따라 감독 방식으로화물을 운반 전좌 키네신,,,에서 기능의 범위를 표시합니다. 키네신은 4-6 세포 골격 미세 소관 (microtubule)과의 상호 작용을 조절하는 adensosine-5'-삼인산 (ATP)의 매출을 사용합니다. ATP, ADP, ADP.Pi 또는 전혀 염기가 결합 될 수있다 (그림 1) : 미세 소관의 키네신 모터 도메인 때문에 친화력의 형태는 염기 상태에 따라 다릅니다. 키네신의 분자 적 메커니즘을 이해하기 위해, ATP 회전율 미세 소관과 상호 관계의 이해가 필요하다.refore은 키네신 필드의 주요 목적은 상이한 뉴클레오티드 상태의 기능적 특성 및 미세 소관의 존재 및 부재하에 둘 사이에 전환 동력학을 특성화하는 것이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg"> 키네신에 대한 간단한 ATP 턴 오버주기 그림 1은 네 가지 상태로 구성됩니다. 염기가없는 (Φ) 사 전환의 각각은 순방향 및 특징, ADP.P 내가 -bound, ATP가 바인딩과 ADP가 결합 된 역방향 속도 상수 (K x 및 각각 -x K). ATP 회전율의 화학 사이클 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 결합되는 방법을 이해하기 위해서는, 하나의 레이트 microtub 부재 제한 ATP 회전율주기의 어느 단계를 결정해야한다개 모듈은 다음 사이클이 미세 소관의 존재에 의해 변경되는 방식을 결정합니다. 가장 간단한 ATP 턴 오버주기는 네 개별 화학 물질 단계로 구성 : (1) ATP가 빈 사이트에 바인딩 (Φ가 빈 사이트, 즉 염기없는 키네신을 의미한다); (2) ATP 분열; (3) 인산의 해리 및 (4) ADP 해리 (도 1). 속도 제한 단계는 완전한 사이클 ATP 턴 오버에 대한 속도 상수를 설정한다. 따라서, 각각의 천이 각각 측정하고 완전한 사이클에 대한 속도 상수에 비교해야 속도 제한이있는 단계를 결정한다. 방법은 여기서 설명되지 않은 전반적 ATP 회전율 사이클 속도 상수를 측정 할 수 있지만 여기에 참고 7에서 발견 될 수 있고, 우리는 각각의 단계에 대한 화학적 반응 속도 상수를 판별 할 수있는 방법을 설명한다. 염기 가수 분해 단백질의 정점에서 개개의 전환주기를 연구하는 데 사용할 다수의 방법이있다. 여기에 제시된 방법은 advantag을형광 물질로 표지 된 methylanthraniloyl 뉴클레오티드의 특성 예는, 일반적으로 단백질 (8)에 결합시 형광 강도의 변화를 표시 mant, 라. 그것의 작은 크기는 리보오스 (도 2A)에 결합 될 때, 그것은 일반적으로 뉴클레오티드 결합 또는 9-12의 가수 분해 반응 속도에 거의 또는 전혀 효과를 가지고 있음을 의미하기 때문 mant 그룹이 사용된다. 여기서는 키네신의 ATP 턴 오버주기 뉴클레오티드 결합 및 분리의 관찰을 할 수 있도록 정지 흐름과 결합해서 형광 mant-표지 된 뉴클레오티드의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-메틸안트라닐로일) 아데노신-5' 삼인산&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5'-diphosphate&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>ATP의 디소듐 염은 100&nbsp의 농도로 만들어집니다; 100&nbsp의 mM; mM MgCl2. 농도는 260&nbsp에서 흡수로 확인해야 합니다. nm (e = 15,400&nbsp; M-1cm-1). -20&nbsp에서 부분 표본에 저장된 용액; oC.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&nbsp; M 원액, pH 8.0. 위험: 분말은 흡입하면 유해합니다.</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp; 같은 날 사용하기 위해 신선하게 만든 물에 담긴 M 원액. 위험: 분말은 흡입하거나 피부에 닿으면 유해합니다.</td></tr><tr><td>NAP-5 열</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex 수지 중력 흐름 젤 여과 열</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>비가수분해 아날로그 GTP</td></tr><tr><td>Stopped-flow 형광계&nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>일부 배관이 부착된 형광계로, 관찰 큐벳에서 시약을 빠르게 혼합할 수 있습니다. 따라서 ~0.1의 시간 척도에서 반응의 역학을 허용합니다&nbsp;-&nbsp; 100개&nbsp; SEC를 모니터링합니다.</td></tr></tbody></table>

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 atp 턴 오버주기를 분석하는

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

미세 소관 관련 모터 단백질의 키네신 상과는 모두 ATP를 가수 분해하고 미세 소관을 결합하는 특성 모터 도메인을 공유 할 수 있습니다. 키네신은 ATP 매출 및 미세 소관의 상호 작용의 두 거대 집단에서 차이를 표시합니다. 이러한 차이는화물 운송, 미세 소관 슬라이딩, 미세 소관 해중합 및 미세 소관 안정화 등 다양한 기능을 특정 키네신을 조정. 키네신의 작용 기전을 이해하기 위하여는 ATP 회전율의 화학 사이클은 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 연결되는 방법을 이해하는 것이 중요하다. ATP 턴 오버주기를 해부, 하나의 접근 방식은주기의 각 단계를 시각화하는 형광 표지 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. ATP 회전율주기의 각 염기 전환의 반응 속도를 결정하는 것은 완전한 사이클을 식별 할 수에 대한 속도 제한 단계 또는 단계를 할 수 있습니다. 키네신, 그것은에서 속도 - 제한 단계를 아는 것이 중요키네신은 미세 소관과 함께 상호 작용할 때 미세 소관의 부재는,이 단계는 일반적으로 수천 배로 촉진되어있다. 미세 소관의 부재주기를 완전히 키네신의 ATP 회전율 사이클을 이해하는 미세 소관의 존재 하에서 그와 비교된다. 개별 뉴클레오티드 천이 속도론은 일반적으로 수동 특히 미세 소관의 존재 하에서 반응물을 혼합하여 관찰 너무 빠르다. 급속한 혼합 장치는, 예컨대 동역학은 수 밀리 초만큼 약간의 시간 척도에서 관찰 될 수 있도록 정지 흐름 fluorimeter으로, 그러한 천이를 감시하는데 사용될 수있다. 여기서는 정지 흐름에 의한 시약의 급속 혼합은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 해부 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 사용되는 프로토콜을 기술한다.

mant 군의 형광 강도의 증가는 통상적으로 키네신 mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합시에 관찰된다. 그러나, 이러한 신호 변화의 크기가 문제가되는 특정 키네신에 의존한다. 따라서, 운동 분석을 진행하기 전에 형광 강도의 변화의 유무와 크기를 모두 확인 평형 측정을 수행하는 것이 유용하다. mantATP 및 mantADP 대표적인 형광 스펙트럼, 솔루션 및 키네신-13, MCAK 복잡한 모두, 그림 (b)에 표시됩니다. 이러한 데이터는 MCAK 바인딩시 mantATP과 mantADP 모두 표시 형광 강도 증가를 강조. 키네신에 mant 염기의 결합에 따라 형광 강도의 변화는 협회와 ATP와 ADP 모두의 해리에보고하는 데 사용됩니다 (제 2 조 및 제 3). MCAK의 경우에는 형광 강도의 차이는 mantATP.kinesin 및 mantADP.kinesin 사이 관찰 도 3a는 뉴클레오티드 프리 mantATP 키네신과 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 키네신 mantATP-13의 결합시 발생하는 형광 강도의 증가를 나타내는 데이터는 주제, MCAK는도 3b에 도시된다. 도 3b에 도시 된 형태의 데이터 mantATP 농도의 범위에서 수집된다. mantATP 농도 대 결정된 속도 상수 (k 개의 OBS)의 플롯은 그림 3C에 표시됩니다. 선형 함수에 이러한 데이터를 피팅 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K -1) OBS를 (2.8 단계) K에 기여 속도 상수의 디컨 볼 루션을 할 수 있습니다. 따라서, 연관 및 mantATP 대한 해리 속도 상수 모두의 결정을 가능하게 (도 1, K 1 및 K -1 각각). 도 4a는 비 표지 ATP의 과량 mantADP.kinesin 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 도 4b의 데이터는 키네신-13, MCAK로부터 해리시 mantADP 관찰 형광 강도의 감소를 나타낸다. mantADP의 해리에 대해 (단계 3.6)의 지수 함수에 속도 상수를이 데이터를 피팅하여 결정된다. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg"> 형광 물질의 methylanthraniloyl (mant)로 표지 그림 2 뉴클레오티드는 ATP 턴 오버주기의 각 단계를 분리하는 데 사용됩니다. 리보오스에 위치 2 '또는 3'중 하나에 접합 mant의 형광 물질의 위치를 보여주는 mantATP의 (A)의 구조. (B) 용액 (있는 no)에 대한 mantATP 및 mantADP 노멀라이징 형광 스펙트럼과 mantATP키네신 MCAK (mATP + MCAK 및 mADP + MCAK) 복잡한에서 D mantADP. mantATP 스펙트럼은 용액에 mantADP에 최대에 형광성 표준화 된 솔루션 mantATP에 대한 최대의 형광 mantADP 스펙트럼 정규화되어 있습니다. MCAK와 혼합 mant 뉴클레오티드의 스펙트럼은 1 분 후 혼합시 징수됩니다. 같은 프로토콜에 설명되어 시약 및 fluorimeter 설정의 농도는 1.1 및 1.2 단계를 반복합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg"> mantATP의 연결 속도 상수의 그림 3 측정. (A) 중단 흐름에 의해 장소 후 혼합한다 반응 묘사 설계도 : mantATP (mATP하는) 뉴클레오티드 무료로 키네신 결합. 단백질에 결합시 mant 그룹 증가 형광 강도. (B) 형광 신호 변화 (검정)과 mantATP MCAK (25 M) (5 M의 뉴 혼합시 관찰cleotide 무). 이 데이터는 (토론 참조) mant의 형광의 photobleaching에 대한 계정을 하나의 지수 함수 플러스 일정한 음의 기울기의 라인에 적합 (빨간색 점선)는 삽입 된 :. 전에 중지 흐름 fluorimeter에 혼합에 주사기의 내용. 염기가없는 MCAK와 mantATP의 반응에 대해 결정 (C) 속도 상수 (k 개의 OBS)는 mantATP의 농도 역모를 꾸몄다. 이 그래프는 M -1 (S)의 단위와 연관 속도 상수 (도 1, K, 1) 인 구배 -1 y 절편은 해리 속도 상수 인 (도 1, K-1)와 함께 선형 영역을 갖 의 단위 -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> . mantADP 미리로드 키네신은 레이블이없는 ATP의 과잉으로 희석 : mantADP의 해리 속도 상수의 그림 4 측정 (A) 도식이 중지 흐름으로 자리 포스트 혼합 걸리는 반응을 묘사. 해리 mantADP함으로써 mantADP 협회 (논의를 참조)의 위로 반응을 예방, 비 표지 ATP에 의해 대체된다. mant 군의 형광 강도는 단백질로부터 해리 따라 감소한다. 키네신 MCAK mantADP로부터의 분리시에 관찰 (B) 형광 감소. 형광 신호 (블랙) (설명을 참조) mant기로 photobleaching에 대해 고려하여 단일의 지수 플러스 일정한 음의 기울기의 선에 맞는 (점선 적색)이다. 결정 속도 상수 mantADP (그림 1, K의 해리에 대한 속도 상수4) 삽입 된 :.. 중지 흐름 fluorimeter에 혼합하기 전에 주사기의 내용 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

이 절차의 전반적인 목표는 키네신의 A TP 턴오버 주기 동안 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 뉴클레오타이드가 없거나 형광 표지된 뉴클레오티드가 적재된 키네신 단백질을 준비함으로써 이루어집니다. 다음으로, 정지된 유동 형광계를 사용하여 준비된 키네신을 뉴클레오티드와 혼합하고 형광 표지된 뉴클레오티드의 결합 또는 해리와 관련된 형광의 변화를 관찰합니다.그런 다음 형광의 변화는 속도 상수를 얻기 위해 지수 함수에 적합합니다. 마지막으로, 측정된 속도 상수는 위임되고 속도 상수는 A TP 전환 주기의 특정 전환에 기인합니다. 궁극적으로, 형광 표지된 뉴클레오티드와 중단된 흐름 형광의 조합은 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 데 사용됩니다.CIN 이 절차를 시연할 사람은 박사후 연구원인 Jennifer Patel과 제 연구실의 대학원생인 Hannah Belch입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 man으로 표시된 뉴클레오타이드를 1밀리몰의 EDTA 및 1밀리몰의 DTT에서 마그네슘이 없는 완충액에 최대 20마이크로몰의 키네신으로 결합한 후 용액을 섭씨 25도에서 15분 동안 배양하고 중력 흐름 G 25 SX 겔 여과 컬럼을 설정하고 최소 3개의 무마그네슘 컬럼 부피와 평형을 이룹니다. 완충기. 그런 다음 essin 용액을 컬럼에 로드하여 kinesin에서 유리 뉴클레오티드와 EDTA를 분리합니다.빈 튜브에 100밀리몰의 염화마그네슘 용액을 추가하여 염화마그네슘의 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 수집 튜브를 수리합니다. 키네신 용액을 채취한 후 적절한 무마그네슘 완충액을 사용하여 키네신을 빠르게 용리합니다. 채취 튜브에 염화마그네슘이 존재하면 컬럼에서 Ian이 키네신을 얼음에 저장하고 1-2시간 이내에 사용한 직후 키네신을 안정화하는 데 도움이 됩니다.그 동안 남자에게 TP 집중 시리즈를 준비하십시오. 사용 가능한 kinesin의 농도에 따라 농도 범위를 선택하십시오. mant의 각 농도에 대해 TP는 nucleotide로 표시된 man이 kinesin nucleotide 결합 부위보다 5배에서 10배 과도한 몰 초과량이 되도록 적절한 농도의 kinesin을 준비합니다.정지 흐름 형광계의 여기 파장을 365나노미터, 방출 파장을 롱 패스 필터로 400나노미터 이상으로 설정합니다. 다음으로, 가장 낮은 농도의 Manta TP부터 시작하여 정지된 흐름 형광측정기를 사용하여 만타 TP와 뉴클레오티드 프리 키네신을 1:1 부피 대 부피 비율로 혼합합니다. 다음 공식을 사용하여 mant A TP의 농도를 지수 함수에 가르치기 위해 형광 강도 측정의 변화를 맞추고, mant 그룹의 광표백을 설명하기 위해 일정한 음의 기울기 선을 맞춥니다.이러한 적합치에서 맨트의 각 농도에서 속도 상수를 결정합니다. 그런 다음 TP는 mant의 집중에 대해 kops를 치실로 사용하여 연관 및 해리 속도를 이양합니다. 그런 다음 TP 이 데이터를 선형 함수에 피팅하여 기울기 및 y축 절편을 구합니다.구배는 man에 대한 속도 상수를 나타내며, 초당 몰당 단위와의 TP 연관성을 나타냅니다. intercept는 초당 단위로 일정한 해리 속도를 나타냅니다. 해리 속도 상수를 측정하려면 DP를 50의 적절한 완충액에 2개의 마이크로몰 키네신 용액으로 발효시킵니다.마이크로몰은 DP 인큐베이터를 섭씨 25도에서 30분 동안 사용하는 것을 의미했습니다. G 25 Sedex 컬럼을 사용하여 mant A DP가 로드된 kinesin에서 fre mant, A DP를 제거하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 stop flow fluter를 설정한 후, 정지된 흐름을 사용하여 mant A DP Kinine 복합체를 50배 이상의 라벨링되지 않은 A TP의 몰 초과와 1:1 부피 대 부피 비율 맞춤으로 혼합합니다. 시간이 지남에 따라 관찰된 형광 강도의 감소는 단일 지수 함수와 그룹의 광표백을 허용하기 위한 일정한 음의 기울기 선입니다.이 적합도에서 결정된 kops는 초당 단위로 mant A DP의 해리에 대한 속도 상수입니다. 맨틀리 목재 뉴클레오티드의 결합 또는 해리에 따른 신호 변화의 크기는 특정 kinesin에 따라 다릅니다. 따라서 형광 강도 변화의 존재와 크기를 모두 확인하기 위해 먼저 평형 측정을 수행하는 것이 유용합니다.형광 스펙트럼은 TP를 발효시키고 Kinesin M CAC의 용액 및 복합체 모두에서 DP를 의미했습니다. 이 그림은 human a TP와 nucleotide free kinesin을 혼합할 때 발생하는 반응을 보여줍니다. Man A TP를 M CAC에 결합할 때 발생하는 형광 강도의 증가가 여기에 나와 있으며, 이는 man에 대한 속도 상수에 적합합니다.여기에서 볼 수 있듯이 선형 함수에 대한 TP 농도는 kops에 기여하는 속도 상수의 디콘볼루션을 허용하고 연관 및 해리 속도 상태 발효 A TP를 제공합니다. 이 그림은 여기에 예시된 바와 같이 M CEC에서 해리 시 관찰된 발효 A DP의 형광 강도 감소를 보여줍니다. Kinesin의 mant A DP의 해리에 대한 속도 상수는 이 데이터를 지수 함수에 피팅하여 결정됩니다. 이러한 프로토콜은 일단 숙달되면 각각 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 방법은 키네신에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 미오신 및 G 단백질과 같은 다른 뉴클레오티드 결합 단백질에도 적용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 표지된 뉴클레오티드와 정지 유량계를 사용하여 키네신에 대한 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

배우세요 형광 흐름 중지 및 형광 표지 뉴클레오티드를 사용하여 키네신의 ATP 턴오버 주기에서 뉴클레오티드 결합 및 해리 동역학을 측정하는 방법을. 이 기법은 운동 단백질 기능 메커니즘 연구에 활용됩니다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

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