형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

이 절차의 전반적인 목표는 키네신의 A TP 턴오버 주기 동안 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 뉴클레오타이드가 없거나 형광 표지된 뉴클레오티드가 적재된 키네신 단백질을 준비함으로써 이루어집니다. 다음으로, 정지된 유동 형광계를 사용하여 준비된 키네신을 뉴클레오티드와 혼합하고 형광 표지된 뉴클레오티드의 결합 또는 해리와 관련된 형광의 변화를 관찰합니다.

그런 다음 형광의 변화는 속도 상수를 얻기 위해 지수 함수에 적합합니다. 마지막으로, 측정된 속도 상수는 위임되고 속도 상수는 A TP 전환 주기의 특정 전환에 기인합니다. 궁극적으로, 형광 표지된 뉴클레오티드와 중단된 흐름 형광의 조합은 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 데 사용됩니다.

CIN 이 절차를 시연할 사람은 박사후 연구원인 Jennifer Patel과 제 연구실의 대학원생인 Hannah Belch입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 man으로 표시된 뉴클레오타이드를 1밀리몰의 EDTA 및 1밀리몰의 DTT에서 마그네슘이 없는 완충액에 최대 20마이크로몰의 키네신으로 결합한 후 용액을 섭씨 25도에서 15분 동안 배양하고 중력 흐름 G 25 SX 겔 여과 컬럼을 설정하고 최소 3개의 무마그네슘 컬럼 부피와 평형을 이룹니다. 완충기. 그런 다음 essin 용액을 컬럼에 로드하여 kinesin에서 유리 뉴클레오티드와 EDTA를 분리합니다.

빈 튜브에 100밀리몰의 염화마그네슘 용액을 추가하여 염화마그네슘의 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 수집 튜브를 수리합니다. 키네신 용액을 채취한 후 적절한 무마그네슘 완충액을 사용하여 키네신을 빠르게 용리합니다. 채취 튜브에 염화마그네슘이 존재하면 컬럼에서 Ian이 키네신을 얼음에 저장하고 1-2시간 이내에 사용한 직후 키네신을 안정화하는 데 도움이 됩니다.

그 동안 남자에게 TP 집중 시리즈를 준비하십시오. 사용 가능한 kinesin의 농도에 따라 농도 범위를 선택하십시오. mant의 각 농도에 대해 TP는 nucleotide로 표시된 man이 kinesin nucleotide 결합 부위보다 5배에서 10배 과도한 몰 초과량이 되도록 적절한 농도의 kinesin을 준비합니다.

정지 흐름 형광계의 여기 파장을 365나노미터, 방출 파장을 롱 패스 필터로 400나노미터 이상으로 설정합니다. 다음으로, 가장 낮은 농도의 Manta TP부터 시작하여 정지된 흐름 형광측정기를 사용하여 만타 TP와 뉴클레오티드 프리 키네신을 1:1 부피 대 부피 비율로 혼합합니다. 다음 공식을 사용하여 mant A TP의 농도를 지수 함수에 가르치기 위해 형광 강도 측정의 변화를 맞추고, mant 그룹의 광표백을 설명하기 위해 일정한 음의 기울기 선을 맞춥니다.

이러한 적합치에서 맨트의 각 농도에서 속도 상수를 결정합니다. 그런 다음 TP는 mant의 집중에 대해 kops를 치실로 사용하여 연관 및 해리 속도를 이양합니다. 그런 다음 TP 이 데이터를 선형 함수에 피팅하여 기울기 및 y축 절편을 구합니다.

구배는 man에 대한 속도 상수를 나타내며, 초당 몰당 단위와의 TP 연관성을 나타냅니다. intercept는 초당 단위로 일정한 해리 속도를 나타냅니다. 해리 속도 상수를 측정하려면 DP를 50의 적절한 완충액에 2개의 마이크로몰 키네신 용액으로 발효시킵니다.

마이크로몰은 DP 인큐베이터를 섭씨 25도에서 30분 동안 사용하는 것을 의미했습니다. G 25 Sedex 컬럼을 사용하여 mant A DP가 로드된 kinesin에서 fre mant, A DP를 제거하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 stop flow fluter를 설정한 후, 정지된 흐름을 사용하여 mant A DP Kinine 복합체를 50배 이상의 라벨링되지 않은 A TP의 몰 초과와 1:1 부피 대 부피 비율 맞춤으로 혼합합니다. 시간이 지남에 따라 관찰된 형광 강도의 감소는 단일 지수 함수와 그룹의 광표백을 허용하기 위한 일정한 음의 기울기 선입니다.

이 적합도에서 결정된 kops는 초당 단위로 mant A DP의 해리에 대한 속도 상수입니다. 맨틀리 목재 뉴클레오티드의 결합 또는 해리에 따른 신호 변화의 크기는 특정 kinesin에 따라 다릅니다. 따라서 형광 강도 변화의 존재와 크기를 모두 확인하기 위해 먼저 평형 측정을 수행하는 것이 유용합니다.

형광 스펙트럼은 TP를 발효시키고 Kinesin M CAC의 용액 및 복합체 모두에서 DP를 의미했습니다. 이 그림은 human a TP와 nucleotide free kinesin을 혼합할 때 발생하는 반응을 보여줍니다. Man A TP를 M CAC에 결합할 때 발생하는 형광 강도의 증가가 여기에 나와 있으며, 이는 man에 대한 속도 상수에 적합합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 선형 함수에 대한 TP 농도는 kops에 기여하는 속도 상수의 디콘볼루션을 허용하고 연관 및 해리 속도 상태 발효 A TP를 제공합니다. 이 그림은 여기에 예시된 바와 같이 M CEC에서 해리 시 관찰된 발효 A DP의 형광 강도 감소를 보여줍니다. Kinesin의 mant A DP의 해리에 대한 속도 상수는 이 데이터를 지수 함수에 피팅하여 결정됩니다. 이러한 프로토콜은 일단 숙달되면 각각 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 방법은 키네신에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 미오신 및 G 단백질과 같은 다른 뉴클레오티드 결합 단백질에도 적용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 표지된 뉴클레오티드와 정지 유량계를 사용하여 키네신에 대한 뉴클레오티드 결합 및 해리의 동역학을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.