Name: 모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 생체 내 전기천공법을 이용한 후각 감각 신경원 표지 및 다광자 현미경을 통한 축삭 형태 변화 관찰 방법을. 이 기술은 신경 발달 연구에 필수적인 실시간 신경 성장 패턴 분석을 가능하게 합니다.

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이 작업은 DFG Schwerpunktprogramm 1392(프로젝트 MA 4113/2-2), 우수 및 DFG 연구 센터 나노 스케일 현미경 및 뇌 분자 생리학 클러스터(프로젝트 B1-9) 및 독일 연구 교육부(BMBF; 프로젝트 1364480)의 지원을 받았습니다.

참고 : 동물 실험 윤리에 대한 괴팅겐 대학위원회의 승인을 동물 취급 및 실험을 수행 하였다. 악기와 피펫 제조 1. 준비 <ol><li> 전기 설치는 큰 작동 거리와 실체 현미경으로 구성되어 있으며 사용 된 염료 형광 조명 및 필터 세트가 장착되어 있는지 확인합니다. </li><li> 전기를위한 전용 단일 세포 electroporator 또는 오실로스코프에 부착 된 일반적인 사각 펄스 발생기를 사용합니다. 피펫 홀더와 목욕 전극에 electroporator 출력을 연결합니다. 마이크로 피펫 홀더 및 목욕 전극에 음의 단자에 펄스 발생기의 양극 단자를 연결한다. 피펫 홀더 및 목욕 전극 모두 염화은의 얇은 층으로 코팅은 와이어를 포함하는 확인. </li><li> 정확한 위치 할 수 있도록 미세 조작기에 피펫 홀더를 탑재합니다. </li&gt; <li> 내부 필라멘트와 붕규산 유리 모세관에서 전기의 마이크로 피펫을 제작합니다. </li><li> 수평 마이크로 피펫 풀러를 사용 Bestman 등. (13)에 의해 설명 된대로 패치 클램프 실험 피펫의 제조를 위해 수정 된 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 긴 생크 및 단일 세포에 대한 전기 천공 15-20 옴의 높은 저항 피펫 결과 작아 선단 구를 생산하는 파라미터를 적응. 피펫 저항은 세포의 그룹의 표시를 위해, 3-4 옴, 예를 들어, 낮아야한다. </li><li> 전용 단일 셀 electroporator로 피펫 저항 직접 측정 또는 정의 전압 펄스의인가 후에 오실로스코프로 전류를 측정하여 오옴의 법칙으로 계산. </li></ol> 일렉트로 솔루션 2. 준비 <ol><li> 개구리 벨소리 (98 mM의 NaCl을, 2 mM의 KCl을에 형광 결합 된 덱스 트란을 녹이고, 1 mM의 염화칼슘 2, 2 mM의 MGC2 리터, 3 mM의 농도의 5 mM의 포도당, pH를 7.8로 조정하고 5 mM의 나트륨 피루 베이트, 10 mM의 HEPES, 삼투압은 mOsmol / l 230이었다). 낮은 염료 농도가 사용되는 경우 세포는 매우 밝게 표시되지 않을 수 있습니다. 대량의 원액을 준비하고 작은 분취 량으로 나눈다. 저장 (개월간 안정)을 위해 그들을 동결. 참고 : 덱스 트란은 서로 다른 크기와 배출 / 여기 스펙트럼의 다양한 사용할 수 있습니다. (예를 들어, 알렉사 488 덱스 트란 10kD, 알렉사 546 - 덱스 트란 10kD, 알렉사 568 - 덱스 트란 10kD, 알렉사 594 - 덱스 트란 10kD, TMR-덱스 트란 3kD). </li><li> 덱스 트란 용액 (5 μL)의 작은 부피와 긴 피펫 팁으로 마이크로 피펫 백필. 조심스럽게 피펫 팁에서 잔류 기포를 제거하기 위해 손가락으로 마이크로 피펫을 가볍게. </li><li> 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 탑재합니다. 피펫 내부의 실버 와이어는 염료 용액과 접촉에 있는지 확인하십시오. </li></ol> 애벌레 X의 3. 선택 laevis의 &lt;/ EM&gt; <ol><li> X의 흰둥이 유충을 사용하여 실험 laevis의. 야생형 동물 공 초점 / 다 광자 영상화 동안 자기 형광 발광 표시하므로 기재된 실험에 적합하지 않은 안료 채워진 melanophores을 갖는다. </li><li> Nieuwkoop 및 페이버 (14) 후 premetamorphotic 올챙이 단계입니다. 실험 단계 45-53의 올챙이를 선택합니다. </li></ol> 형광 결합 된 덱스 트란 4. 일렉트로 <ol><li> 페트리 접시에서 조직의 작은 조각을 놓고 (pH 7로 조정 에틸 3- 벤조 에이트 메탄) 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물을 작은 볼륨으로 커버. </li><li> 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물에 올챙이를 마취. 몇 분 후 동물 이동 중지. 올챙이를 터치하여 적절한 마취를 확인합니다. 그들은 비 응답해야합니다. </li><li> 조심스럽게 조직 덮여 페트리 접시에 마취에서 올챙이를 전송합니다. </li><li> 반드시 목욕 ELECTR 확인ODE는 전기 회로를 닫습니다. 전극이 젖은 조직과 접촉에 있는지 확인; 올챙이에 직접 접촉 할 필요가 없습니다. </li><li> 미세 조작기를 이용하여 후각 기관에 마이크로 피펫 팁 가까이 놓습니다. </li><li> 피펫 팁과 후각 기관을 덮고있는 피부에 침투 조심스럽게 주 후각 상피 또는 골비 상피 세포의 중앙에 위치한 감각 신경 층으로 끝을 진행합니다. </li><li> 감각 신경에 염료를 전송하는 데 긍정적 인 정사각형 전압 펄스를 트리거합니다. 하나의 전압 펄스를 적용 (예., 25 V, 펄스 길이 25 밀리 초) 또는 복수의 펄스에 (예., 50 V, 펄스 길이 300 마이크로 초, 200 Hz에서 400 밀리 기차 시간). 라벨의 확장 요구에 대한 최적의 전압 펄스 매개 변수를 결정합니다. 표지화 된 세포의 수를 낮추기 위해 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 반복 횟수를 줄인다. P의 높은 전압의 펄스 진폭, 기간 및 횟수를 적용널리 보급 된 라벨에 대한 ulses. </li><li> 실체 현미경의 형광 조명을 사용하여 트리거 펄스에 의해 성공적으로 염료 압출 및 전기를 시각화. 염료는 성공적인 전기 후 세포체와 수상 돌기로 빠르게 확산됩니다. </li><li> 반복 올챙이의 두 번째 후각 기관에 대한 4.5-4.9 단계를 반복합니다. </li><li> 복구를 위해 신선한 물이 가득 비커에 올챙이를 전송합니다. 약 후 5 분은 올챙이가 마취에서 깨어나 정상적인 수영 운동을 시작합니다. </li><li> 24 시간 후 일렉트릭 염료는 감각 신경에 퍼져 결국 축삭 수송을 통해 후각 망울에 도달합니다. </li></ol> 세포와 축삭 프로세스의 생체 시각화 5. 설치 동물 <ol><li> 0.02 %의 tricaine를 포함하는 물에 올챙이를 마취. </li><li> 조심스럽게 예를 들어, 영상 실,에 올챙이를 전송, 작은 실리콘 고무는 올챙이 크기의 홈에 페트리 접시에 덮여있다. &lt;/ 리&gt; <li> 파라 필름의 스트라이프에 작은 사각형을 잘라. 컷 아웃 창을 통해 노출 된 전방 telencephalon를 떠나, 파라 필름과 올챙이를 커버. 올챙이를 손상없이 접시에 바늘 파라 필름을 고정합니다. </li><li> 올챙이가 0.​​02 %의 tricaine을 포함하는 충분한 물에 잠긴되어 있는지 확인합니다. </li><li> 수직 광자 현미경 공 초점 현미경의 무대에서 이미징 챔버를 탑재합니다. </li><li> 후각 망울의 이미지의 3 차원 스택을 획득. 이미지를 만드는 절차는 가능한 한 짧게하고 10 ~ 15 분을 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 별도의 탱크에 일반 물에 올챙이를 돌려 빛에 노출되는 것을 방지. 5 분 후, 올챙이는 마취에서 깨어. </li><li> 반복, 지정된 시간 간격 후 5.1-5.7 단계를 예. 매일. </li></ol> 세포와 축삭 프로세스의 전의 VIVO 시각화 6. 설치 동물 <ol><li> 다른 섹션 5프로토콜의 레이블이 감각 신경을 시각화하기 위해 절제 뇌의 준비를 사용합니다. </li><li> 마취와 척수로의 전환에 뇌의 절개하여 올챙이를 죽일. 후각 기관, 후각 신경과 앞쪽에 telencephalon을 포함하는 조직의 블록을 절제. </li><li> 개구리 링거 용액에 조직 블록을 전송하고 두뇌의 복부 측면을 노출 미세 가위로 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 촬상 챔버 조직 블록을 전송하고 나일론 스레드 현악기 백금 프레임 고칠. </li><li> 공 초점 / 다 광자 현미경의 무대에서 이미징 챔버를 탑재합니다. </li><li> 후각 망울의 이미지의 3 차원 스택을 획득. </li></ol> 7. 이미지 처리 및 데이터 평가 <ol><li> 쿠페, P. 등에 의해 기술 된 바와 같이 최적화하고 이미지 품질과의 연결 구조의 시각화를 개선하기 위해 필터링을 로컬이 아닌 수단에 적용된다. 15. 참고 : 라이브 표본의 깊은 조직 층에 영상 실험의 데이터는 종종 시끄러운. </li><li> 개요에 대한 이미지 스택의 최대 강도 예측을 만듭니다. </li><li> 시간 경과를 들어 이미징 실험은 감각 뉴런의 단일 명백하게 식별 축삭 대한 데이터 세트를 화면. </li><li> 펭 등 알에 의해 설명 된대로 신경 프로세스의 소프트웨어를 이용한 추적을 통해 세포의 형태를 재구성. (16). </li></ol>

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</ol>

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여기에 설명 된 실험 절차 유생 X.의 후각 기관의 라벨링 감각 뉴런을 허용 형광 결합 된 덱스 트란과 살아있는 동물에서 감각 축삭의 성장 이후의 시각화의 전기에 의해 laevis의. 생체 내 전기 천공의 파라미터를 변화시킴으로써 표지화 감각 뉴런의 수를 제어 할 수있다. 그것은 거의 또는 단일 셀 감각 상피의 신경 세포의 큰 그룹 레이블을 억제 할 수있는 효과가있다. 이 마이크로 피펫 특성과 전기 펄스에 대해 특히주의하는 것이 중요하다 신경 라벨의 확장 원하는 보장합니다. 높은 피펫 저항 및 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 반복 횟수의 감소는 더 광범위 라벨링 이어질 수 피펫 저항 및 높은 전압 펄스 진폭, 지속 시간 및 펄스의 개수를 감소시키는 반면, 표지화 된 세포의 양을 줄일 수있다. 목전기에 대한 형광 덱스 트란의 전자 사용은 적용되는 설정이 적절한 경우에 즉각적인 시각적 피드백을 제공합니다. 주의 그 진폭, 기간 및 잠재적으로 세포 손상으로 이어질이나 사망 17 셀 수있는 프로토콜에서 제공하는 값을 초과 펄스 수에 대한 매개 변수를 사용하여. 마이크로 피펫의 막힘 또는 파손 팁도 성공적으로 전기를 방해 할 수 있습니다. X의 후각 기관에서 생체 전기에서 postmetamorphotic 개구리의 피부는 강인하고 쉽게 마이크로 피펫으로 침투 할 수 없기 때문에 laevis의 유생 단계로 제한됩니다. 신경 프로세스 생체 가시화 깊은 뇌 영역 또는 혈관에 의해 여기 / 발광 빛의 산란에 의해 방해 될 수있다. 이 문제는 더 큰 뇌에 더 높은 유생 단계에서 특히 분명하게 미세 축삭 프로세스의 명확한 식별이 더 어려워 노이즈 신호가 발생할 수 있습니다. <p= &quot;jove_content&quot;&gt; 제시된 프로토콜은 허가 클래스는 전체 세포 패치의 라벨처럼, 동물을 해부 라벨 동안 세포를 손상, 조직 슬라이스를 준비하거나 다른 방법에 필요한 조직을 고정하지 않고 그대로 후각 시스템의 감각 신경을 시각화 -clamp 실험 18. 생체 시간 경과 이미징 또는 몇 번의 감각 뉴런의 라벨링을 결합 할 때, 긴 시간 간격 동안 하나의 성숙한 감각 뉴런의 사구체 연결을 시각화 할 수있다. 이 방법은 여러 주 동안 미성숙 감각 뉴런의 축삭 돌기 패턴의 발전을 모니터 할 수도있다. 그것은 살아있는 동물에서 하나의 축삭의 성장 패턴을 모니터링 할 수 있습니다으로이 후자의 옵션은 특히 흥미 롭다. 이 축삭지도와 길 찾기를 제어 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 가능성을 엽니 다. 후각 수용체 발현을 포함하여 여러 가지 요인, 각종 AXOn 개의 안내 분자 및 후각 감각 뉴런의 유도 / 운동량은 감각 신경 축삭 4,5의 목표 발견을 조절하는 것으로 나타났다. 프로토콜 어플리케이션은 후각 감각 뉴런에 한정되지 않고, 또한 예를 들어, 다른 세포 유형을 연구하기 위해 적용될 수있다., 뇌 발달 또는 후각 망울의 승모판 세포의 신경성 영역 / 전구 줄기 세포. 또한 증명 기술은 또한 신경 세포 표지 및 / 또는 연결된 회로 7,19 대한 기능적 정보를 얻을 막 투과성 칼슘 염료를 칼슘 민감성 덱스 트란과 병용하거나 주입 할 수있다. 덱스 트란에 결합 된 형광 물질의 광범위한 이용 가능성은 복수의 개별 셀 또는 다른 색 개체군 표지를 허용한다. 또한 형광 단백질 예 인코딩 DNA 용액을, 플라스미드, 전기 천공에 적합하고 더욱 versatili을 향상시킬 수있다타이 및 기술 (6)의 유용성. 프로토콜은 또한 덱스 트란 및 DNA 또는 청구 morpholinos의 결합 된 전기는 유전자 발현 (13 및 17)를 조작 할 수 있도록 향상 될 수있다. 한 방법은 확실히 복잡하고 척추 동물의 후각 시스템의 축삭 지침을 조절 아직 완전히 이해되지 프로세스를 조사 할 수있는 새로운 도구를 나타냅니다.

감각 뉴런의 평생 전환은 후각 시스템을 다른 많은 감각 및 신경 시스템과 구별합니다1,2. 새로 형성된 감각 뉴런은 후각 상피3의 기저 부분에서 지속적으로 생성되고 축삭돌기를 후각 시스템4의 첫 번째 중계소인 후각구로 확장한다. 그러나 후각 지도의 형성과 유지를 제어하는 세포 및 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다4,5.
여기에서는 유충 X. laevis의 후각 기관의 감각 뉴런을 형광단 결합 dextrans의 생체 내 전기천공법으로 라벨링하는 프로토콜을 설명합니다. 제시된 프로토콜을 통해 축삭 형태 및 연결성을 시각화하고, 시간 경과에 따른 축삭 발달을 추적하고, 축삭 배선 및 유도를 조절하는 메커니즘을 연구할 수 있습니다.
Electroporation은 덱스트란 결합 염료 및 DNA와 같은 하전 된 거대분자를 세포6,7에 도입하는 잘 정립된 방법입니다. 세포막은 짧은 전압 펄스의 적용에 의해 투과화되고 분자는 전기영동으로 사이토졸8로 전달됩니다. 마이크로피펫을 사용한 공간적 제한된 전기천공법은 뉴런을 포함한 세포의 선택적 표지를 가능하게 하며 X. laevis9,10의 시각 시스템을 포함한 다양한 뉴런 시스템에 적용되었습니다.
우리는 전기천공된 동물이 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 축삭 성장 패턴과 형태를 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 설명된 절차는 주 및 부속 후각 시스템11,12의 감각 뉴런의 축삭 돌기의 거친 토폴로지를 식별할 수 있도록 합니다. 생체 내 타임랩스 이미징을 사용하여 단일 성숙한 감각 뉴런의 사구체 연결을 감독하고 미성숙 감각 뉴런의 축삭 투영 패턴의 진화를 모니터링하는 데에도 적합합니다12. 설명된 프로토콜은 온전한 동물에서 후각 회로의 구조와 형성을 조사하는 데 적용할 수 있으며 후각 및 기타 신경 시스템 내의 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>형광등이 있는</td> <td>SZX16</td><td>올림푸스</td><td></td> 실체 현미경</tr><tr><td>Axon Axoporator 800A</td><td>분자 장치</td><td></td><td>단일 세포 전기자극기</td></tr><tr><td>ELP-01D</td><td>npi 전자</td><td></td><td>전기자극기</td></tr><tr><td>MMJ</td><td>M&auml; rzh&auml; 사용자 Wetzlar</td><td></td><td>수동 마이크로매니퓰레이터</td></tr><tr><td>P-1000</td><td>Sutter</td><td></td><td>수평 마이크로피펫 풀러</td></tr><tr><td>G150F-4</td><td>워너 인스트루먼트</td><td></td><td>전기천공법 피펫 제조를 위한 유리 모세관; 내부 필라멘트로 되메우기가 더 쉬워짐</td></tr><tr><td>Alexa 488-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22911</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22912</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22913</td><td></td></tr><tr><td>TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby)</td><td>Life Technologies</td><td>D7162</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>마취제; 장갑 사용</td></tr><tr><td>A1-MP</td><td>Nikon</td><td></td><td>다광자 현미경</td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>신경 세포 추적을 위한 대체 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

후각계는 유기체의 일생 동안 새로운 뉴런을 생성할 수 있는 특이한 능력을 가지고 있습니다. 후각 상피의 기저 부분에 있는 후각 줄기세포는 축삭돌기를 후각구로 확장하는 새로운 감각 뉴런을 지속적으로 생성하며, 이 세포는 기존 회로에 통합되는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 특별한 기능 때문에 후각 시스템은 축삭 배선 및 안내를 모니터링하고 시냅스 형성을 조사할 수 있는 독특한 기회를 나타냅니다. 여기에서는 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 절차와 양서류 Xenopus laevis의 유충 후각 시스템에서 축삭돌기의 후속 시각화 절차를 설명합니다. 후각 기관의 감각 뉴런을 염색하기 위해 우리는 전기천공법(electroporation technique)을 채택합니다. 생체 내 전기천공법(In vivo electroporation)은 형광단 결합 덱트랜스(dextrans) 또는 기타 거대분자를 살아있는 세포에 전달하기 위해 확립된 기술입니다. 그런 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물에서 염색된 감각 뉴런과 축삭 돌기를 모니터링할 수 있습니다. 표지된 세포의 수를 동물당 몇 개 또는 단일 세포로 줄임으로써 단일 축삭을 후각 전구로 추적할 수 있으며 일련의 생체 내 타임 랩스 이미징 실험을 수행하여 몇 주에 걸쳐 형태학적 변화를 모니터링할 수 있습니다. 설명된 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 라벨링 및 모니터링을 예시하지만, 후각 및 기타 시스템 내의 다른 세포 유형에도 채택될 수 있습니다.

설명 된 프로토콜이 성공적으로 전기 및 마취 X.의 후각 시스템의 감각 뉴런의 축삭 프로세스 생체 시각화 적용될 수있다 laevis의, 공 초점 레이저 스캐닝 또는 광자 현미경 (그림 1)를 사용하여. 전기는 형광 결합 된 덱스 트란 입력하고 빠르게 후각 기관의 세포 내부에 확산 할 수 있습니다. 이것은 전압 펄스 트리거링 후 성공적인 라벨을 확인하는 형광 조명을 적용하는 것이 도움이된다. , 전기 파라미터들에 따라 예를 들면., 피펫 저항은, 세포 (도 2A, B) 또는 후각 기관의 단셀 (도 2c)의 그룹이 표시되어있다. 표시된 감각 뉴런의 축삭은 후각 신경 (그림 2D)으로 시각화 할 수 있으며 축삭 프로세스는 성공적인 전기 후, 후각 망울도 보통 24 시간을 관찰 할 수있다(그림 3). 감각 뉴런의 그룹 일렉트로는 후각 망울 (도 3a)에서 거친 배선 패턴을 시각화 허용한다. 단세포 전기 천공은 후각 망울 (도 3C-E)에서 사구체 구조 개별 축색 돌기 패턴, 축삭 분기점 및 연결성을 조사하기 위해 적용될 수있다. X의 투명 흰둥이 올챙이 생체 공 초점 또는 마취 올챙이의 그대로 뇌에 표시된 감각 뉴런의 광자 이미징 laevis의 허가. 동일한 표지 감각 뉴런 (도 4)의 생체 내에서 반복하여 시각화 축삭 성장 패턴의 개발은 며칠 / 주에 걸쳐 추적 될 수있다. 후각 망울의 축삭 패턴이 상당히 달라질 수 일렉트로 시점 감각 신경 세포의 성숙에 따라. 성숙한 신경 세포는 이미 술을 특징으로 정교한 축삭 가지를 가지고사구체에 연결 ED 지역. 성숙한 신경 세포의 축삭의 성장 패턴은 오히려 안정적이지만, 축삭 분기 및 사구체 터프 개선의 신장 (그림 4A-E) 관찰 할 수 있습니다. 감각 뉴런, 연장 된 시간 기간 동안 생체 내에서 관찰 할 수있다 예를 들어., 이상 3 주 이상 (도 4F-I). 한편, 미성숙 신경 축색은 터프 arborizations를 가지지 않는, 초기 성장 과정에 여전히 아직 최종 사구체 타겟에 연결되지 않았다. 실험적 프로토콜은 성숙 동안 이러한 뉴런의 발달을 추적 가능 예., 축삭 신도 분기점 터프 arborizations (도 4J-L)의 확립. 더 예를 들어도 Hassenklöver과 만지니 (12)을 참조하십시오. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"> 마취 X의 후각 기관의 실험 프로토콜의 그림 1. 개요도. (A) 주 후각 상피의 감각 신경 세포 (MOE) 또는 서 골비 기관 (VNO) laevis의 유충은 형광 덱스 트란 용액을 가득 유리 피펫을 사용하여 전기로 표시되어 있습니다. 표지 된 신경 세포의 축삭은 후각 신경 (ON)을 통해 다음과 결국 후각 망울 (OB)에 도달. (B) 올챙이는 마취 및 레이블 뉴런을 반복해서 특정 시간 간격으로 공 초점 또는 다 광자 현미경을 사용하여 조사 하였다 할 수있다. (C)라고 표시된 세포의 축삭의 성장 패턴의 점증 적 개발은 주 일의 시간 범위에 걸쳐 올 수 있습니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500"> 그림 2. 선거법후각 기관에서 감각 신경의 troporation. 낮은 저항 피펫으로 (A) 일렉트로는 후각 기관의 여러 세포의 라벨링에 연결됩니다. 이 대표적인 예에​​서 다수의 후각 수용체 뉴런 (ORNs, 작성 화살촉)와 두 개의 기둥 모양의 세포를 지원 SCS (별표) 염색 하였다. 점선은 피펫 저항을 증가, 표지화 된 세포의 수를 제한하고, 후각 상피 (OE). (B) 전기 파라미터를 정제, 예를 들면.의 경계를 구별. 이 예에서, 하나의 감각 신경 세포 (작성 화살촉)와 하나의 인접한지지 세포 (별표)는 전기 후 염색 하였다. 후각 상피 (오픈 화살촉)를 떠나 하나의 축삭을합니다. (C)을 성공적으로 단일 세포 전기 개별 감각 신경 세포 (채워진 화살표) 및 후각 상피의 연결 축삭 (오픈 화살촉)의 독점적 인 라벨로 이어집니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400"> 그림 3. 절제 후각 망울의 후각 축삭 돌기를 시각화. (A) 후각 망울에서 감각 신경의 축삭 돌기의 거친 토폴로지는 낮은 저항 전기 피펫을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 하나의 후각 망울의 반구와 관련 후각 신경 (ON)이 그려져있다. 다른 형광 물질에 결합 된 네 덱스 트란이 후각 기관의 네 먼 위치에서 일렉트로되었다 : 횡 (녹색), 중간 (노란색), 환경부 (적색)과 VNO (오렌지)를 내측. 이것은 액세서리 후각 망울 (AOB) 및 메인 후각 망울 (MOB)의 세 가지 주요 투영 필드를 시각화한다. <str arborizations>(CE)</str> 예. X에서 그 주 후각 축삭이 (작성 화살촉이, 또한 Hassenklöver 및 만지니 12 참조) 한 개, 두 개 또는 여러 개의 사구체에 연결하기 전에 정기적으로 (오픈 화살촉을) 두 갈래 laevis의. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500"> 단일 후각 신경 세포의 축삭의 생체 시간 경과 영상에서 그림 4. (AE)성공적인 단일 세포 전기 후 레이블 축삭 반복 후각 망울 (OB)으로 시각화 할 수 있습니다. 이 예는 일주일 동안 조사 된 개별 축삭을 보여줍니다. 전체적인 형태는 현저하게 변경되지 않으며, 두 개의 주요 분기점 삭제 (오픈 화살촉) 식별 될 수있다. 다른 두 사구체 다발 안정 (별표)를 유지하는 반면 시간의 과정을 통해, 하나의 사구체 술이 지속적으로 감소 (채워진 화살표)를 거쳐 있습니다. (FI)이 대표적인 예는 장기적인 관찰의 가능성을 보여줍니다이 특정 축삭을 조사 하였다으로 3 주 이상합니다. 성장 패턴의 어떠한 명백한 변화가 검출 될 수 없다. (JL)은 성장 과정에서 미성숙 감각 축삭의 예가 도시된다. 그것은 아직 사구체하고 특성 사구체 깃이없는 연결되지 않았습니다. 축삭 가지가 가늘고 긴 오일 후, 축삭은 여러 번 미세 arborizations은 두 갈래로 갈라설립했다.

우리는 뉴런 형태와 시간 경과에 따른 발달을 시각화하기 위해 전기천공법과 후속 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경에 의한 후각 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 프로토콜을 설명합니다.

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 후각 감각 뉴런에 레이블을 지정하여 축삭 형태 및 발달을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 fluoro four coupled dextran을 단일 후각 감각 뉴런에 포어링함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 염료가 감각 뉴런의 축삭돌기로 퍼질 때까지 24시간을 기다리는 것입니다.다음으로, 올챙이를 마취하고 다광자 현미경을 사용하여 후각구의 3차원 이미지 스택을 획득합니다. 마지막 단계는 지정된 시간 간격 후에 동일한 동물에서 라벨링된 뉴런을 반복적으로 검사하는 것입니다. 궁극적으로 세포 형태학의 재구성을 통해 축삭 형태학의 변화를 시각화할 수 있습니다.이 방법은 축삭돌기가 전뇌의 목표 영역을 향해 어떻게 성장하는지, 시냅스가 어떻게 형성되는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 전에. electroporation 설정이 working distance가 큰 실체 현미경으로 구성되어 있고 dye를 위한 형광 조명과 필터 세트가 장착되어 있는지 확인합니다.electroporation에 사용되는 것은 전용 single cell electroporation 또는 오실로스코프에 부착된 일반 사각 펄스 발생기를 사용합니다. electroporation output을 피펫 홀더와 수조 전극에 연결합니다. 피펫 홀더와 수조 전극에 얇은 염화은층으로 코팅된 은선이 포함되어 있는지 확인하십시오.다음으로, 정확한 위치 지정이 가능하도록 마이크로 매니퓰레이터에 피펫 홀더를 장착합니다. 그 후, 내부 필라멘트가 있는 규산보 유리 모세관으로 전기천공을 위한 마이크로 피펫을 제작합니다. 마이크로 피펫 극성의 매개변수를 설정하여 단일 세포 전기천공을 위한 높은 피펫 저항성을 가진 더 긴 섕크와 더 작은 팁 개방 마이크로 피펫을 생성합니다.그런 다음 전용 단일 셀을 전기공공으로 사용하여 피펫 저항을 직접 측정합니다. 이 절차에서는 플루오로 4 결합 덱스트란을 3 밀리 몰의 농도로 프로그 링거에 용해시킵니다. 이 원액을 작은 부분 표본으로 나누고 나중에 사용할 수 있도록 냉동실에 보관하십시오.다음으로, 마이크로 피펫에 1-5마이크로리터의 덱스트란 용액을 다시 채웁니다. 마이크로 피펫을 조심스럽게 두드려 피펫 팁에 남아 있는 기포를 제거합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 피펫 홀더에 장착합니다.피펫 내부의 은색 와이어가 염료 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 이제 페트리 접시에 작은 티슈 조각을 넣고 0.02%트리카가 함유된 소량의 물로 덮습니다. 다음으로, 0.02%trica를 함유한 물에서 사전 변성 올챙이를 마취합니다.만지고 반응이 없는지 확인하여 적절한 마취를 확인하십시오. 그런 다음 올챙이를 티슈로 덮인 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 전극이 젖은 조직과 접촉되어 있는지 확인하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫 팁을 올챙이의 후각 기관 가까이에 배치합니다.그 후 후각 기관을 덮고있는 피부에 침투하십시오. 피펫 팁을 사용하여 팁을 주 후각 상피 또는 MRO 비강 상피의 중앙에 위치한 감각 뉴런 층으로 조심스럽게 전진시킵니다. 이제 양의 제곱 전압 펄스를 트리거하여 단일 전압 극 또는 다중 펄스의 트레인을 적용하여 염료를 감각 뉴런으로 전달합니다.그런 다음 형광 실체 현미경을 사용하여 성공적인 염료 압출 및 전기천공을 시각화합니다. 염료는 성공적인 전기천공 후 세포체와 수상돌기로 빠르게 퍼집니다. 올챙이의 두 번째 후각 기관에 대한 절차를 반복한 후 올챙이를 깨끗한 물이 채워진 비커에 옮겨 넣고 전기천공된 염료가 감각 뉴런과 후각구로 퍼지도록 합니다.전기천공법 후에 적어도 24 시간은, 0.02%trica를 포함하는 물에 있는 올챙이를 마취합니다. 다음으로, 올챙이를 이미징 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. param 스트립에서 작은 사각형을 잘라냅니다.그런 다음 올챙이를 param으로 덮고 앞쪽 꼬리 cephalon은 컷 아웃 창을 통해 남겨 둡니다. 올챙이를 다치게 하지 않고 접시에 바늘로 매개변수를 고정하고 올챙이가 0.02%Trica를 함유한 충분한 물에 잠겨 있는지 확인하십시오. 그런 다음 이미징 챔버를 정립 다중 광자 현미경 또는 컨포칼 현미경의 스테이지에 장착합니다.후각구의 3차원 이미지를 획득하고 이미징 절차가 10-15분을 초과하지 않도록 합니다. 그 후, 올챙이를 별도의 탱크에 일반 물로 되돌려 놓고 빛에 노출되지 않도록하십시오. 이 이미지에서, 서로 다른 플루오로 4개에 연결된 4개의 갑판 가닥을 후각 기관의 4개의 먼 위치에서 전기천공시켰으며, 측면은 녹색으로, 중간은 노란색 내측으로 표시했으며, 보머 비강 기관은 주황색으로 표시했습니다.이를 통해 부속 후각구(accessory olfactory bulb)와 주 후각구(main olfactory bulb)의 세 가지 주요 투영 필드를 시각화할 수 있습니다. 이 이미지는 후각구의 구조에 겹쳐진 단일 후각 감각 뉴런의 다양한 축삭 성장 패턴의 3차원 재구성을 보여주며, 다음은 후각구로 돌출되어 구형 사구체에서 술이 있는 수목화를 형성하는 단일 후각 감각 뉴런 축삭의 예입니다. 여기 오푸스 레부에서 볼 수 있듯이, 이 축삭돌기는 하나, 둘 또는 여러 개의 gmer에 연결되기 전에 규칙적으로 분기됩니다.이는 in vivo time lapse imaging에 의해 반복적으로 조사된 개별 후각 감각 뉴런의 대표적인 예로, 축삭 형태의 지속적인 변화를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전기천공법을 통해 후각 감각 뉴런에 레이블을 지정하는 방법과 생체 내 타임랩스 이미징을 사용하여 후각 감각 뉴런의 발달을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Portela-Lomba, M., et. al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2020). 이 비디오는 불멸의 인간 후각 외피 신경교세포와 공동 배양된 축삭 절제술된 쥐 망막 신경절 뉴런(RGN)에서 축삭 재생의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. RGN은 붉은색 솜씨와 녹색 축삭돌기가 있는 면역 표지되어 있습니다. 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 캡처되었으며 축삭 및 축삭 재생 지수가 있는 뉴런의 비율은 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

여기 SCS는 확장 axons을 함께 개발 할 수 있습니다하는 Schwann 세포 (SC) 마이그레이션 분석을 설명합니다.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

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소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

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