위치 선택성과 유전자는 수정 된 유전자 총을 사용의 Organotypic 뇌 조각에 타겟팅

이 절차의 목표는 유전자 총을 사용하여 유기형 절편의 고유한 영역을 빠르고 효율적으로 transfection하거나 라벨링하는 것입니다. 이것은 먼저 뇌 또는 다른 조직의 생존 가능한 유기형 조각을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 생체 전달을 위해 DNA 또는 디코딩된 금 입자를 생산하는 것입니다.

다음으로, 유기형 절편을 안정화된 유전자 건 마운트 아래에 놓고 코팅된 입자를 조직 또는 일피솜 형질전환 또는 라벨링으로 발사합니다. 마지막 단계는 분리된 영역에 전달된 이종 유전자의 영향을 관찰하거나 분석하는 것입니다. 궁극적으로 이 접근 방식을 통해 사용자는 다양한 이종 유전자를 가진 장기 절편의 고유한 영역을 정확하게 transfection할 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 생물 물류가 말단으로 분화된 세포를 transfection할 수 있을 뿐만 아니라 작용 반경을 작은 직경으로 제한할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 단일 유전자의 지역적 기여도를 이해하는 것과 같은 주요 신경생물학적 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 새로운 뇌를 작은 수용자 틀에 삽입하여 이 절차를 시작하십시오.

실온보다 약간 높은 온도로 호출된 ARO 용액으로 덮습니다. 그런 다음 얼음 위에 올려 금형을 섭씨 4도까지 빠르게 냉각합니다. 아로스가 설정되었을 때.

5분에서 10분 후, 곰팡이에서 아로스에 박힌 뇌를 제거한다. 그런 다음 섬유섬유 슬라이서 플랫폼에 붙입니다. 그런 다음 플랫폼을 멸균 얼음 차가운 PBS가 들어 있는 Vibra 슬라이서 챔버로 옮깁니다.

슬라이스 후 세포 배양 삽입물의 슬라이스를 인서트 외부에 배양 배지가 있는 6개의 멀티웰 트레이에 부드럽게 놓습니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 배양하십시오. 이 절차에서는 먼저 50마이크로리터의 0.05몰 정자와 10마이크로리터의 DNA를 10밀리그램의 금 입자에 10밀리그램의 금 입자에 첨가하여 직경 40나노미터의 금 입자를 사용하여 나노 발사체를 준비합니다.

그런 다음 용액 혼합물에 염화칼슘을 첨가하여 DNA 분자가 금 나노 입자에 결합하는 것을 돕습니다. 그런 다음 주사기로 용액을 튜브에 끌어 넣습니다. 튜빙 준비 스테이션에 튜빙을 놓습니다.

금 입자가 가라앉도록 합니다. 그런 다음 주사기로 흡인에 의해 supinate를 제거합니다. 튜브를 회전하여 금 입자가 고르게 퍼지도록 합니다.

그런 다음 분당 5리터의 일정한 질소 흐름으로 입자를 건조시킵니다. DNA 총알을 만들려면 튜브 절단기를 사용하여 튜브를 1cm 조각으로 자릅니다. 그런 다음 유전자 배양 카트리지에 즉시 삽입하거나 멸균 층류 후드에서 사용할 때까지 섭씨 4도에서 건조된 상태로 유지하고 DNA 코팅된 금이 들어있는 카트리지를 카트리지 홀더에 로드합니다.

그런 다음 홀더를 유전자 총에 로드합니다. 멸균 집게를 사용하여 변형된 유전자 총 배럴을 부착합니다. 유기형 슬라이스가 들어 있는 필터 인서트를 멸균 플라스틱 접시에 넣습니다.

유기형 슬라이스에서 매체를 제거합니다. 그런 다음 마운트를 사용하여 가스 압력을 50PSI로 설정합니다. 유전자 전달을 위해 절편의 원하는 영역에서 10mm 위 위치에 유전자 총을 놓습니다.

그런 다음 배럴 중앙을 조심스럽게 조준하고 코팅된 입자를 조직에 발사합니다. biotic transfection 후, PBS로 슬라이스를 부드럽게 두 번 씻습니다. 그런 다음 PBS에서 4% 얼음처럼 차가운 PFA를 20분 동안 배양하여 슬라이스를 고정합니다.

그런 다음 PBS에서 슬라이스를 두 번 씻습니다. 다시 말하지만, 슬라이스를 방해하지 않고 메스를 사용하여 삽입물에서 멤브레인을 부드럽게 자릅니다. 그런 다음 집게로 멤브레인 지지대를 현미경 슬라이드에 놓고 유기형 절편이 그 위에 놓이도록 합니다.

그런 다음 슬라이스에 마운팅 미디어 한 방울을 추가합니다. 덮개를 놓고 조직에 직접 힘을 가하지 않고 부드럽게 미끄러지십시오. 그런 다음 네일 바니시를 얇게 펴 커버 슬립을 고정합니다.

이 그림은 형광 단백질로 인코딩된 DNA가 6주 된 쥐의 유기형 절편으로 생물적으로 전달되는 것을 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 비키니 층과 소뇌의 분자층의 계면에서 발견되는 놀라운 수지상 하버를 가진 비키니 뉴런은 P-E-G-F-P-N 1로 일시적인 생체 형질 주입 후 뚜렷한 라벨링을 보여줍니다. 다음은 가시가 있는 수상돌기의 더 높은 배율이며, 다음은 해마의 ca 1 영역에서 발견되는 초금속 세포입니다.

PDS Red FP 코팅 금 나노 입자의 생체 전달 후 마스터하면 이 기술을 이 절차 후 3-4일 동안 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 컨포칼 현미경 검사와 같은 다른 방법을 사용하여 특정 뉴런이 인접 영역과 어떻게 연결되어 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.