칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

이 절차의 전반적인 목표는 단지 10, 000의 세포에 염색질 immunoprecipitation 실험 수행 가능한 자동화한 플랫폼을 연구원에게 제공하기 위한 것이다. 이는 먼저 염색질 면역침전을 위해 고품질 전단 염색질을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 자동화된 염색질 면역침전 실험을 생성하고 면역 침전된 DNA를 사용하여 자동화된 라이브러리를 실행합니다.

면역 침전된 DNA는 정량적 PCR과 차세대 염기서열분석을 통해 분석됩니다. 궁극적으로, 자동화 기술의 성공은 원래 10, 000 세포 샘플에서 생성된 염색질 면역침전 서열 프로필과 100, 000 세포 및 참조용 기존 데이터 세트에서 수행된 실험을 비교함으로써 검증될 수 있습니다. 이 방법은 다양한 조직에서 특정 바이오마커의 기능에 대한 이해를 심화하기 위해 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

발달 단계 및 질병 상태. 이 기술은 건강과 질병에서 후성유전학적 바이오마커를 식별하는 데 도움이 되므로 정확하고 신뢰할 수 있는 여러 질병의 진단에 영향을 미칩니다. 자동 기술은 특정 세포 유형, 하위 집단 및 생검의 후성유전학적 분석에서 연구자에게 중요한 도구입니다.

표준 자동 염색질 면역침전 실험의 경우, 먼저 120마이크로리터의 크로마틴 면역침전 완충액 H를 100마이크로리터의 전단 크로마틴에 첨가하여 입력 시료를 위해 2-20마이크로리터의 염색질을 보존합니다. 그런 다음 IP star compact에서 자동 실험을 설정하려면 프로토콜을 선택하고 염색질 면역침전 아이콘을 클릭합니다. chromatin immunoprecipitation direct method를 선택한 후 다음 화면에서 chromatin immunoprecipitation 200 microliter protocol을 선택하고 샘플 번호를 지정합니다.

항체 코팅을 위해 염색질 면역침전 실험 매개변수를 4시간으로 설정합니다. 면역침전 단계의 경우 15시간, 각 세척 단계의 경우 5분씩 단계를 수행합니다. 그런 다음 레이아웃 정보 화면에 표시된 지침에 따라 시약을 설정하고 적절한 시약과 고도로 검증된 ChIP-seq 등급 항체를 추가합니다.

그런 다음 20 마이크로 리터의 단백질, 각 반응에 대해 코팅 된 자기 비드를 추가하고 하룻밤 칩 프로토콜과 역 가교가 끝난 후 염색질 샘플을 추가합니다. 마그네틱 비드 기반 DNA 정제 키트로 DNA를 정제합니다. 고감도의 상용 플루오로 메트릭 분석을 사용하여 면역 침전 DNA를 정량화합니다.

다음으로, 적어도 하나의 양성 및 하나의 음성 대조군 게놈 영역에 대한 프라이머를 사용합니다. 분석을 위한 물질의 적절한 매개변수에 따라 정량적 PCR로 면역 침전된 DNA의 품질을 분석합니다. 결과는 프로토콜에 따른 차세대 염기서열분석에 대한 입력 복구의 백분율로 표현됩니다.

이제 라이브러리 준비 아이콘을 클릭한 다음 선호하는 라이브러리 준비 기술을 선택하고 레이아웃 정보 화면의 지침에 따라 시약을 설정합니다. 예를 들어, 이 실험에서는 유전자 발현과 관련된 6개의 서로 다른 히스톤 변형에 대한 염기서열분석 프로파일이 생성되었습니다. 이러한 히스톤 마커 간에 관찰된 높은 피크 상관 관계는 자동화 시스템이 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성할 수 있는 능력을 나타냅니다.

더욱이, 이 그래프는 특정 게놈 영역에서 서로 다른 히스톤 변형에 대한 피크의 분포를 보여줍니다. 마지막으로, 세포 수가 적은 샘플에 대한 자동 염색질 면역침전 실험의 경우, 방금 설명한 대로 자동화 시스템에서 자동 염색질 면역침전 200마이크로리터 프로토콜을 설정합니다. 다음으로, ChIP-seq, 등급 항체 및 시약으로 시스템을 로드하여 10, 000 및 100, 000 세포 사이의 염색질 양에 대해 작동하도록 최적화하고 각 반응에 대한 코팅된 마그네틱 비드를 코팅합니다.

칩 후 라이브러리 준비를 실행하고 micro plex 라이브러리 준비 프로토콜을 선택한 다음 레이아웃 정보 화면에 표시된 지침에 따라 시약을 설정합니다. 10, 000 세포 시작 샘플에서 염색질 면역 침전의 이 대표적인 정량 PCR에서 양성 대조군 영역에서는 항히스톤 항체와 음성 대조 영역에서는 무시할 수 있는 신호로 상당한 농축이 관찰되었습니다. 여기에서는 수동 염색질 면역침전 실험과 재현 가능하고 매우 유사한 일련의 10가지 면역침전 반응이 나타나 있으며, 이는 수동 면역침전과 비교하여 실험 변동성의 눈에 띄는 증가 없이 적은 세포 수로 작동하는 자동화 시스템의 능력을 보여줍니다.

이 데이터는 10, 000 및 100, 000의 서열 라이브러리의 생물 정보학 분석을 보여줍니다. 그는 염색질 면역침전 후 S3 세포를 생성하며, 낮은 세포 수 염색질 면역침전 샘플에서 뛰어난 결과를 보여줍니다. 10,000개의 시작 물질이 있는 실험에 해당하는 이 데이터 세트에는 100, 000 세포 데이터 세트와 Broad Institute 참조 데이터 세트 모두에서 확인된 매우 신뢰할 수 있는 농축 피크가 있는 낮은 배경 노이즈가 포함되어 있습니다.

인코딩 프로젝트의 경우 10, 000 셀 데이터가 엔드 코드 프로젝트에서 사용된 중요한 점수에 의해 순위가 매겨진 피크 중 상위 40%의 98% 중첩 비율로 Broad Institute 데이터와 거의 동일한 피크를 보여준다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. IP star 자동화 시스템은 작업자의 개입을 최소화하여 염색질 면역침전의 HandsOn 시간을 단 1-2시간으로 단축합니다. 또한 자동화된 프로세스는 수동 염색질 면역침전의 오류가 발생하기 쉬운 수많은 단계를 대체하고 매우 일관된 결과를 제공합니다.

이 절차를 시도하는 동안 우수한 염색질 면역침전과 매우 특이적이고 민감한 항체의 좋은 선택이 실험 성공의 열쇠라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 생물학의 모든 분야의 연구자들이 치료의 정확성, 재현성 및 일관성을 개선할 수 있는 길을 열었습니다. 후성유전학 연구.