의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

다음 실험의 전반적인 목표는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍된 요인이 없는 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 이러한 세포를 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하는 것입니다. 이는 먼저 크기가 큰 단일 렌티바이러스 줄기세포 카세트 또는 줄기차를 가진 성체 피부 인간 섬유아세포를 HI PSC로 재프로그래밍함으로써 달성됩니다. 다음으로, 재프로그래밍된 HI PSC를 아데노 크리 푸르(adeno Cree purr) 바이러스에 노출시켜 숙주 게놈에서 줄기 세포를 완전히 절제하고 제거합니다.

그런 다음 feeder free HI PSC에서 게놈 DNA를 추출한 후 아겔 분석을 통해 적절한 줄기 자동차 절제를 확인합니다. 마지막으로, 인자 3 H IPC는 완전히 정의된 무이종 조건으로 느린 변환 방법론에 의해 추정되는 GMP 등급 조건으로 변환됩니다. 궁극적으로, 인간 성인 피부 섬유아세포의 바이러스 기반 재프로그래밍과 H IPC를 임상 등급 조건으로 완전히 전환하는 것은 성인 인간 세포를 재프로그래밍하고 임상적으로 관련된 조건으로 전환하기 위한 이 방법론의 광범위한 적용 가능성을 강조합니다.

이 기술의 의미는 인간 유도 만능 줄기 세포가 완전히 요인이 없고 임상 등급 조건으로 전환되어 인간 치료제와 호환되기 때문에 인간 유도 만능 줄기 세포의 임상 적용으로 확장됩니다. 해동을 시작하기 위해 인자 3 및 임상 등급 인간 유도 만능 줄기 세포를 얻기 위해 따라야 하는 주요 복잡하고 구체적인 절차로 인해 재프로그래밍 절제 및 임상 등급 변환 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 성체 피부 인간 섬유아세포 또는 HAF를 섭씨 37도의 수조에서 2분 동안 노출합니다.

바이알 상단이 물에 잠기지 않도록 주의하십시오. 1ml의 세포 슬러리를 15ml 크로니클 바이알에 넣어 세포를 재현탁시키고 DMSO를 적하 방식으로 희석합니다. 4ml의 예열 된 허프 중간 원심 분리기를 천천히 넣고 바이올렛을 200 배 G로 실온에서 10 분 동안

그런 다음 sup, nacent 및 reus를 흡인합니다. 100에 매체에 있는 세포를, 0.2%gelatin에 6개의 좋은 판 preco의 1개의 우물로 밀리리터 당 000의 세포를 중단하십시오. 2ml의 cell 현탁액을 추가한 다음 2ml의 현탁액을 두 번째 현탁액에 추가합니다.

글쎄, 감염의 다양성을 측정하는 데 사용되거나 MOI가 플레이트를 좌우로, 앞뒤로 흔들어 세포를 고르게 분배한 후 가습실에서 섭씨 37도와 5%이산화탄소에서 밤새 배양합니다.24시간 후, 카운팅 후 세포는 8개의 형질전환 단위 또는 S와 동등한 렌티바이러스 농축액을 두 번 해동하고 허프 배지를 사용하여 10으로 희석합니다. 밀리리터당 8 TS로, 절반 배지를 사용하여 밀리리터당 8 마이크로그램의 형질 주입 시약을 보충했습니다. 10 multiplicity의 감염 비율로 세포를 형질주입합니다.

transduction well을 골고루 혼합하고 렌티바이러스 transduction 후 약 24시간 후에 밤새 배양합니다. 허프 배지를 제거하고 표준 인간 만능 줄기 세포 또는 PSC 배지로 교체합니다. 2일째부터 6일째까지 매일 배지를 0.2%젤라틴으로 코팅된 10cm 접시 2개로 바꾸고, 7일째에 보체 구성 인자 1 또는 CF 1 마우스에서 유래한 6개의 마우스 배아 섬유아세포로 10배 10회 플레이트를 만듭니다.

재프로그래밍된 섬유아세포의 6웰 플레이트 중 하나의 웰에 실온 트립을 추가합니다. 그녀는 세포를 부드럽게 들어 올리고 새로운 인간 PSC 중간 플레이트로 100배 G를 회전시키고, 두 개의 10cm CFI 필로폰 플레이트에 모든 세포를 1:16 비율로 회전시킵니다. 시계 방향 나선형으로 응집체를 분포시키고 배지를 교체하기 전에 약 48시간 동안 배양합니다.

3-4주 후, 21 게이지 바늘을 사용하여 형태와 같은 전형적인 ESC를 가진 8-10개의 특정 콜로니 조각을 선택하고 확장 후 CFI MFS의 개별 웰에 서브클론합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 줄기 자동차 통합 부위를 확인한 후 배아체 형성 및 마커 발현 분석을 통해 세포가 만능인지 확인합니다. 먼저 오래된 인간 PSC 매체를 3 밀리리터의 표준 PSC 매체로 흡인하여 스템 자동차를 소비합니다.

45마이크로리터의 농축된 아데노 크리 푸르 또는 밀리리터당 8마이크로그램의 트랜스펙션제와 함께 바이러스. 그런 다음 세포에 추가하고 배양 후 24시간 동안 배양하고, 바이러스 수피네이트를 흡인하고, 인간 PSC 배지가 세포를 두 번 세척하도록 유도합니다. 그런 다음 HPSC 배지를 밀리리터당 2마이크로그램의 순수 마이신으로 추가하고 5일 후에 매일 교체하고 나머지 콜로니를 서브클론하고 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 확장합니다.

다음으로, pre Eloqua 기저막 매트릭스 1바이알을 얼음 위에서 해동하고 차가운 기저 매체를 1에서 30의 최종 농도로 희석합니다. 웰당 1밀리리터를 사용하여 6웰 플레이트의 원하는 웰 수를 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 18 게이지 바늘을 사용하여 이전에 mes로 코팅 된 우물에서 최소 20-30 개의 군체를 교차 해칭합니다.

고양을 줄이고 플레이트에서 세포를 옮기는 데 주의하십시오. 1시간 배양 후 200마이크로리터 피펫으로 코팅된 웰의 매트릭스를 흡입합니다. 오래된 플레이트에서 콜로니 조각을 부드럽게 긁어내어 제거하고 매트릭스 코팅 플레이트에 하나씩 새로 결합된 배지 3ml에 조심스럽게 넣습니다.

48 시간 동안 배양 한 후, 절제 된 포스트 및 피더가없는 전환 HI PSC가 80 % co 유창성에 도달하면 배지를 매일 교체하십시오. 시판되는 DNA 추출 키트를 사용하여 줄기 자동차 렌티바이러스의 외인성 통합에 특이적인 여기에 표시된 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. PCR로 DNA를 분석하여 적절한 절제를 통해 절제 후 HI PSC를 GMP 등급 조건으로 전환합니다.

HPSC 복합 배지 1 및 임상 등급 GMP 준수 배지 또는 복합 배지 2를 섭씨 37도로 예열 80:20의 비율로 혼합합니다. 세포에서 기존의 결합 배지를 흡인하고 새로운 따뜻한 배지 용액 3 밀리리터로 교체합니다. 4일째에 적절한 콜로니 크기와 밀도를 유지하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 3일 동안 배지를 매일 교체하고, 배지를 3일 동안 1번과 2번 배양하는 따뜻한 결합 배지의 50 50 혼합물로 교체하십시오.

7일째에 배지를 매일 교체하고, 1번과 2번을 각각 20-80 비율로 가열한 복합 배지로 전환하고 3일 동안 매일 교체하십시오. 10일째에는 따뜻한 100% 미디엄 2개로 바꾸고 매일 교체하십시오. 세포는 이제 완전히 정의된 이종 자유 배지에 있습니다.

다음으로, 정의된 무이종 기질을 사용하여 6웰 플레이트의 1웰을 코팅한 후, 합류 셀의 웰에 있는 이종 프리 배지를 1개의 x 암을 포함하는 새로운 배지로 교체합니다. 1시간 동안 배양한 후 18게이지 바늘을 사용하여 세포를 기계적으로 갓 준비된 세포에 넣습니다. 글쎄, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 특성화하기 전에 최대한의 부착을 허용하기 위해 세포가 이틀 동안 방해받지 않고 배양하도록 합니다.

이 그림은 3개의 서로 다른 사전 절제된 H-I-P-S-C 라인의 대표적인 그림을 보여주며, 여기에 표시된 것은 stem car에 대한 특정 서열에 특이적인 앰플리콘 밴드의 결핍에 의해 입증된 바와 같이, stem car 렌티바이러스로부터 완전히 자유로운 하나의 특정 sub clone을 보여주는 절제 후 역전사 PCR 겔입니다. 이 그림에서는 합성 매트릭스에 대한 이종 함유 매트릭스에 대한 사전 con 변환 IPC와 합성 매트릭스에 대한 사후 소비세 이종 무료 GMP 등급 H IPC가 SOX 2, OCT 4 및 nanog를 포함한 표준 다능성 관련 요인의 정량화를 보여줍니다. QPCR 사용은 여기에 설명되어 있습니다.

마지막으로, 여기에서 볼 수 있듯이, GMP 등급 조건으로 변환된 사전 변환 및 사후 변환된 HI PSC는 비인간 항원을 나타내는 시알산(sialic acid) 및 글리콜 뉴론산(glycol neuronic acid)에 대한 유세포 분석을 통해 테스트되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 stemco 재프로그래밍 바이러스로 인간 성인 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하고, 게놈에서 바이러스를 절제하고, 이러한 HI PSC를 인간 치료제와 완전히 호환되는 임상 등급 조건으로 완전히 변환하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 3세대 항바이러스 벡터인 스타카(staca)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 예방 조치가 필요하다는 점을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 이러한 적절한 PPE와 VSL 2 플러스 조직 배양실을 사용해야 합니다.