라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

이 절차의 전반적인 목표는 환자 체액에서 인간 백혈구 항원 또는 HLA 관련 종양 항원을 측정하여 환자를 관련 면역 요법으로 계층화하는 것입니다. 이는 먼저 TCRM으로 알려진 항체를 모방한 T 세포 수용체를 MICROPLATE 표면에 고정시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 표적 펩타이드 HLA 단량체의 연속 희석과 함께 환자 시료를 추가하여 표준 곡선을 생성하는 것이며, 이를 통해 환자 시료에서 표적 항원을 정량화할 수 있습니다.

다음으로, free label bioassay 시스템의 항체에 대한 표적 항원의 결합은 평형에 도달할 때까지 모니터링됩니다. 마지막 단계는 표준 곡선을 사용하여 결과 데이터를 분석하여 환자 샘플의 표적 항원의 양을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 무표지 바이오센서 기술은 환자 샘플에서 암 바이오마커를 검출하는 데 사용됩니다.

lc MSS와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 HLA 관련 항원을 빠르게 고처리량으로 검출할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 암 환자를 치료 방식으로 빠르게 계층화할 수 있는데, 이는 바이오마커 검출 플랫폼 역할을 하기 때문입니다. 이 방법은 암 바이오마커의 스크리닝과 관련이 있지만, 이 시스템은 실제로 세포 기반 분석, 면역 표현형 하이브리드 스크리닝 또는 소분자 라이브러리 스크리닝을 포함한 많은 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 치료용 T세포 수용체 모방 항체를 개발하던 시절에 처음 떠올랐습니다. 우리는 이러한 유형의 치료로부터 가장 큰 혜택을 받을 환자를 어떻게 식별할 수 있는지 자문했습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실에서 일하는 생명공학 대학원생인 Kristen Dahl입니다.

먼저 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 섭씨 28도에서 사전 배양하여 온도 관련 공명 변화를 최소화합니다. 50마이크로리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS pH 7.2를 아바돈 유도체 코팅 플레이트의 웰에 추가합니다. 그런 다음 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 엽니다.

설정 마법사를 따라 플레이트 레이아웃에서 블랭크, 표준물질 및 시료 선택, 온도 설정, 분당 스캔 횟수 및 실험 길이를 포함하는 실험 절차를 정의합니다. 그런 다음 준비된 분석 플레이트를 라벨이 없는 생물학적 분석 스캐너에 삽입하고 첫 번째 스캔을 시작합니다. 기준선은 실험 시작 시 수집된 초기 스캔 세트입니다.

이것이 이 특정 플레이트에서 수행된 첫 번째 판독인 경우 스캐너가 온도를 평형화하고 기준선의 드리프트를 제거할 수 있을 만큼 충분히 오래 작동하도록 합니다. 베이스라인이 안정화된 후 또는 최소 5회 스캔 후 판독을 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다. PBS를 버리고 50마이크로리터의 RL 21 비오틴화 항체를 플레이트의 제어 웰을 제외한 모든 것에 추가합니다.

그런 다음 50마이크로리터의 PBS를 제어 웰에 추가합니다. 다음으로, 플레이트를 생물 검정 스캐너에 다시 삽입하고 포화 상태에 도달할 때까지 판독을 재개합니다. 약 1.5시간 후 읽기를 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다.

그런 다음 PBS 웰당 200마이크로리터와 0.05%Tween 20 또는 PBST로 플레이트를 세 번 세척합니다. 세제 없이 PBS pH 200 웰당 7.2마이크로리터를 3번 헹궈 세척한 후 세탁합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 종이 타월의 접시에서 여분의 PBS를 두드립니다.

다음으로, 모든 활성 웰에 50마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 판독을 재개하여 세척 후 공진을 모니터링합니다. 읽은 후 읽기를 중지하고 플레이트를 꺼냅니다.

분석물을 추가합니다. PBS를 제거하고 이 분석을 위해 적절한 분석 버퍼의 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. 시판되는 정상 인간 혈청을 PBS에서 1 내지 20으로 희석하였다.

그런 다음 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 열고 설정 마법사를 따릅니다. 실험 절차를 정의하려면 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 삽입하고 기준선 판독을 시작합니다: 기준선이 안정화된 후 또는 최소 5회 스캔 후에 판독을 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 웰에서 분석 버퍼를 제거합니다.

그런 다음 분석 완충액에서 밀리리터당 0.625에서 10마이크로그램 범위의 농도로 관련성이 있거나 관련이 없는 펩타이드를 함유하는 HLAA oh 2 0 1 단량체로 대조군을 스파이크합니다. 그런 다음 플레이트의 제어 웰에 50마이크로리터의 표준물질을 추가합니다. 다음으로, 분석 완충액에 있는 분석물 50마이크로리터를 플레이트의 샘플 웰에 추가합니다.

이 분석을 위해 스파이크(spiked) 시판되는 인간 혈청이 사용되었습니다. 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 포화 후 약 30-60분 후에 포화도에 도달할 때까지 판독을 재개한 후 판독을 일시 중지하고 플레이트를 배출합니다. PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척한 다음 이전과 같이 PBS 웰당 200마이크로리터로 3번 헹궈낸 다음 모든 활성 웰에 50마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.

이제 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 판독을 재개하여 판독을 중지하고 플레이트를 배출하기 전에 세척 후 공진을 모니터링합니다. 마지막으로, 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하거나 원시 데이터 파일을 선호하는 통계 분석 소프트웨어로 내보냅니다. 생물 검정 스캐너 소프트웨어는 실험 설정 중에 제공된 플레이트 레이아웃을 기반으로 결합 곡선을 자동으로 생성합니다.

Biotinylated RL 21 A-T-C-R-M 또는 IgG two A를 AVID AVIDAN 분석 플레이트에 고정시킨 대표적인 결과는 평형 상태 및 세척 후 환자 혈장 샘플에서 표적 종양 항원 F-L-S-L-H-L-A의 검출을 보여줍니다. IgG 2 A는 비특이적 결합 조직 절편을 양성 대조군과 음성 대조군으로 염색하기 위한 대조군으로 사용된다. 그리고 RL 21의 경우 RL 21 A에 의한 종양 조직의 염색은 F-L-S-L-H-L-A 복합체의 발현을 확인합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 항체를 모방한 T 세포 수용체를 사용하여 환자 체액에서 HLA 관련 바이오마커를 측정하고 label-free bioassay 시스템에서 표적 항원과 항체의 결합을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 상승을 방지하고 각 단계에 올바른 샘플 버퍼를 사용하기 위해 사용하기 전에 모든 샘플 버퍼를 배양해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.