Name: 라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 라벨이 없는 바이오 센서 기술을 활용하여 환자 체액에서 HLA 관련 종양 항원을 측정하는 방법을. T세포 수용체 모방 항체를 사용하여 신속하게 암 바이오마커를 검출하고 면역요법에 적합한 환자를 선별할 수 있습니다.

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이 연구는 텍사스 공과 대학 건강 과학 센터의 면역 치료 개발 센터 및 Resonant Sensors Incorporated의 Experimmune에 실험실 공간 및 급여 지원을 제공하는 Abilene Development Corporation의 일부 지원을 받았습니다.

윤리 문 : 드 확인 된 인체 조직과 혈장 샘플 심사위원회 (Institutional Review Board)에서 헨드릭 의료 센터에서 얻었다 프로토콜을 승인했다. 오티 닐화 된 항체의 1 추가 참고 :이 단계의 모니터링는 선택 사항입니다. 모니터링하지 않을 경우 다른 프로토콜을 참조하십시오. <ol><li> 시중에서 판매하는 아비딘 파생 코팅 플레이트 (재료 및 장비 표 참조) 구합니다. </li><li> 우물에 50 μl의 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2를 추가합니다. 참고 : 28 ° C에서 Preinc​​ubate PBS는 온도 관련 공명 변화를 최소화합니다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어와 공백, 표준의 선택 및 샘플 플레이트 레이아웃, 설정 온도 (28 ° C), 분당 스캔의 수를 포함하는 실험 절차를 정의 할 수있는 설치 마법사를 따라 (1) 실험의 길이 ( 150 분 예비 단계를 수용). </리&gt; <li> 라벨 무료 생물 검정 스캐너로 준비 분석 플레이트를 삽입하고 첫 번째 스캔을 시작합니다. 첫 번째 스캔이 완료되면, &quot;시작하는 자체 기준&quot;을 선택합니다. 기준선은 실험의 시작에서 수집 스캔 초기 설정이다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 스캐너가 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 실행할 수 있습니다. 샘플을 첨가하여 기준의 스크린 샷은 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 싱크대에 덤핑으로 PBS를 제거하고 접시에 제어 우물하지만 모든 [PBS의 pH가 7.2에서 10 ㎍ / ml의] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. 제어 우물에 50 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 채도가 약 1.5 시간에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 세척<html> 플레이트 200 μL 200 μL / 웰 PBS pH를 7.2 3 린스 하였다 / 웰의 인산 완충 생리 식염수 + 0.05 % 트윈 20 (PBST)로 3 회. PBS로 반복합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 종이 타월에 판에서 초과 PBS를 누릅니다. 참고 :이 단계는 자동 평 와셔를 수행하거나 싱크대에 액체를 덤핑과 피펫 PBST를 대체하여 플레이트 200 μL PBST로 3 회 세척 할 수있다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μl의 PBS 산도 7.2을 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. </li></ol> 1 단계의 대체 프로토콜 : <ol start="13"><li> 모든 우물 [10 ㎍ / ml의 PBS] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. </li><li> 1.5 시간 또는 밤새 4 ° C 상온에서 품어. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li></ol>분석 대상의 jove_title &quot;&gt; 2. 추가 <ol><li> PBS를 제거하고 적절한 분석 완충액을 잘 당 50 μl를 추가합니다. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 정상 인간 혈청을 PBS에 희석 1:20 사용 하였다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어는 실험 절차를 정의하기 위해 설치 마법사를 따라. </li><li> 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 기본 읽기 시작합니다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 스캐너 실행을 할 수 있습니다. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 우물에서 분석 버퍼를 제거합니다. </li><li> 와 스파이크 컨트롤 HLA A * 02 : [0.625-10 ㎍ / ㎖의]에서 분석 버퍼에 이르기까지 관련 (FLSL) 또는 농도 무관 (SLLV, YLEV, 또는 KVL) 펩티드 베어링 01 단량체. 플레이트의 대조군 웰에 표준의 50 μL를 추가 </li><li> 샘플 분석 버퍼 분석 50 μl를 추가플레이트의 웰. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 인간 혈청을 사용 하였다 아군. </li><li> 약 30 ~ 60 분 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 포화 상태에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μL 분석 버퍼를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. 주 : 검정 완충액은 PBS, 조직 배양 배지, 또는 상기 분석의 목표에 따라 PBS에 1:20으로 희석 인간 혈청 일 수있다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어 또는 반출 바람직한 통계 분석 소프트웨어 원시 데이터 파일을 사용하여 분석한다. 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어가 자동 결합에 기초하여 곡선을 생성실험 설치하는 동안 제공 플레이트 레이아웃. 주 : 분석을 위해 생물학적 정량 스캐너 소프트웨어를 사용하지 않는 경우, 단계를 수행 3.2-3.4. </li><li> 이후의 각 데이터 포인트에서 기저선 및 음성 대조군을 뺀다. </li><li> 각 시점에서의 복제에 웰에 대한 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 막대 그래프의 결합 곡선을 선택하거나 엔드 포인트 데이터의 그래프를 생성합니다. </li></ol>

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</ol>

저자, 데브라 Wawro Weidanz와 로버트 마 그누 손은이 문서에서 사용되는 생물 검정 플레이트 리더와 분석 플레이트를 생산 공진 센서 법인에서 각각 최고 경영자 (CEO)와 최고 기술 책임자 (CTO)이다.

본원에 기재된 방법은 높은 처리량 환자의 혈청, 혈장, 소변 또는 타액 시료에 가용성 펩티드 / HLA 복합체의 신속한 검출을 가능 96- 또는 384- 웰 포맷 것이다 암 진단을위한 바이오 마커 스크리닝 시스템을 소개한다. 모노클로 날 항체 및 라벨없는 검출 시스템을 흉내 T 세포 수용체를 이용하여 상기 분석 시스템은 통상의 ELISA에 의해 3.5 시간에 비해 1 시간 미만으로 분석 시간을 삭감. 이 높은 처리량 방법은 치료 암 백신 또는 바이오 의약품에 대한 임상 시험에 환자의 신속한 계층화 할 수 있습니다. 이러한 질병 표적 검출을위한 현재의 방법은 개별 환자 샘플 번거롭고 시간 소모적 프로세스의 친 화성 정제 및 HPLC-MS / MS를 필요로한다. 이 방법은 종래의 ELISA 기법 의무가 있지만, 이러한 우려를 방지 β2 마이크로 글로불린 항체와 같은 보조 검출 시약은 초기 HL의 구조를 변경할 수있다분자는 TCRM 제한 검출에 결합 억제한다. 라벨없는 검출은 이러한 우려를 완화. 이 과정은 이러한 표면 플라즈몬 공명 시스템으로 다른 라벨없는 시스템에서 사용하기 위해 수정 될 수있다. 그러나이 크게 본 연구에서 사용 된 생물학적 검정 시스템에 비해 높은 처리 능력을 감소시킬 것이다. 이 프로토콜은 효과적으로 몇 가지 중요한 단계 준수와 환자의 혈청 및 혈장 비 HLA 바이오 마커의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. &lt;200 PM 시프트 가능성 후속 검출 단계 낮은 신호 발생하므로 초기 항체 코팅 공정의 모니터링은, 표면의 최적화를 위해 권장된다. 혈청 단백질의 풍부가 낮은 농도 분석의 결합 마스크 수 있으므로 기준 및 사후 세척 읽기는 엔드 포인트 분석하는 데 유용합니다. 마지막으로, 샘플의 온도 변화에 잘 잘 변화에 발생할 수 있습니다. 그것은 모든 샘플을 미리 배양하는 것이 좋습니다D 라벨없는 biosassay 부 온도 컨트롤러는 실온 이상에서 2-3 ℃로 설정 될 수있다. 냉장 샘플 작동 온도에 도달 할 수있는 충분한 시간을 허용한다. 이 프로토콜의 장래 변형이 플​​레이트 표면에 TCRM의 다중화를 포함한다. 생물 검정 시스템은 적어도 8 플렉스의 밀도로 우물의 안보에 현재 의무가 있습니다. 시험 샘플 볼륨 당, 각 웰에 4-8 TCRM을 도입함으로써 감소 및 환자 당 점점 복잡한 데이터의 수집을 가능하게한다. 이 기능은 더 치료 옵션과 관련하여 환자를 제공하는 계기가 될 것이다.

클래스 I 인간 백혈구 항원 (HLA)의 시료 세포 내 단백질의 레퍼토리 프로 테오 분해로부터 유도 된 길이가 8-11 개의 아미노산의 펩티드는 모든 유핵 세포 1,2- 표면의 펩타이드를 제공한다. HLA 복합체 순환은 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 (도 1) 각각의 셀의 상태를 나타내는 &quot;자연의 바이오 마커&quot;이다. CTL에 의해 일으키는 세포의 제거에 질병 관련 펩티드 결과의 인식. 따라서, 적응 면역 반응이 바이러스 감염 및 종양의 제거에 매우 효과적이다. 그러나 면역 체계는 종종 효과적인 CTL 응답을 회피 할 수있는 바이러스 나 종양에 대한 선택을 촉진 압력을가한다. 모방하는 T 세포 수용체 (TCRM) 모노클로 날 항체의 특정 펩티드 / HLA-A * 02 인식 (모노클로 날 항체) : 유방암 관련 단백질, 대 식세포 이동 억제 인자로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 (MIF19-27) 3 및 NY-ESO-1은 157-165, CTL은 4,5- 대응 방법 효과적인 항 종양의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 이 작업은 대표적인 인구의 30 %까지 발현 HLA-A * 0201 분자에 집중된다. 그러나, TCRM의 생산 다음에 다른 관련 HLA / 펩타이드 복합체의 식별은 훨씬 광범위한 인구 작품의 유틸리티를 확대하고, 대상 면역 요법과 동반 질환 진단의 개발을 가능하게한다. 세포 표면에 대한 결합 펩티드 / HLA 복합체의 부분은 플라즈마 내로 방출된다. 때문에 HLA 관련 바이오 마커의 immunopeptidome 광산에 대한 펩타이드 / HLA 풀, 현재의 방법의 매우 복잡한 특성으로 인해 시간이 소요됩니다. 이 프로세스는 플라즈마로부터 가용성 HLA의 친 화성 정제를 필요로 역상 고압 액체 크로마토 연관된 HLA 펩티드의 분리탠덤 질량 분광법 (MS / MS) -6,7- 그래피 (RP-HPLC) 및 펩타이드 서열. 이 프로세스는 신규 한 치료 적 표적의 발견을위한 가능한 선택이지만, 이미 치료 백신 또는 바이오 파이프 라인 80-10에서 HLA 연관된 타겟 동반자 진단 도구로 성가신 과정이다. 이러한 목표는 관련 임상 시험에 환자를 계층화하고 더 많은 정보 치료 옵션을 제공하기위한 신속한 동반자 진단 개발을위한 도구를 제공에 대해 TCRM은 지시했다. 본 연구에서는 암 진단을위한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템은 TCRM 최소한의 처리 단계와 생물학적 상호 작용을 모니터링하는 라벨이없는 생물 검정 시스템을 사용하는 표시됩니다. 라벨없는 생물 분석 시스템은 유전체 도파로 격자 11-14 발생 가이드 모드 공명 (GMR) 효과를 이용한 방법에 기초한다. 때 광대역 빛이 접촉 회절을이 시스템에 필요한 접시에 격자, 두 가지 특정 파장이 반영됩니다. 고정화 된 수용체와 리간드 간의 결합 상호 작용이 스펙트럼 분석기 (12)와 공명 파장 시프트를 추적하여 실시간으로 모니터링된다. 별도의 공진 피크는 입사 TE (입사면에 수직 전기 벡터) 및 TM (입사면에 수직 인 자기 벡터) 잠재적 11,14 검출 정밀도를 높일 수있는 다수의 데이터 포인트를 제공하는 편광 상태에 대해 발생한다. 이 라벨없는 측정계 항체 미리 감응 플레이트를 사용하여 데이터 분석을 분석 실행 시간은 약 45 분이다. 또한, 다수의 환자 샘플을 HPLC-MS / MS 기반 포맷 위에, 96- 또는 384- 웰 포맷 분명한 이점을 심문 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>ResoSens 라벨-프리 바이오분석 감지 시스템</td><td>공진 센서 통합</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td><td>공진 센서 통합</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ResoVu 소프트웨어</td><td>공진 센서 통합</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A Biotinylated TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A 바이오틴화 TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 단량체&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>전체 펩타이드 서열: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 단량체&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>전체 펩타이드 서열: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 모노머&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>전체 펩타이드 시퀀스: YLEPGPVTV</td></tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 모노머&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>전체 펩타이드 서열: KVLEYVIKV</td></tr><tr><td>풀드 노멀 휴먼 세럼&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 세포 상등액</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>세포는 IMDM, 10% FBS 및 1% penn/strep에서 성장합니다. 3일 동안 합류 배양에서 수확한 상등액.</td></tr><tr><td>Iscove의 Dulbecco's Medium (IMDM)</td> <td>변형 Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 + 0.05% 트윈 20(PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-디아암모늄염(ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 휴먼 &베타; 2 마이크로 글로불린&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; 마이크로플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 마이크로플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress 시약 키트</td><td>벡터</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>벡터</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin QS</td><td>벡터</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>항-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

미국 암 학회 (American Cancer Society)에 따르면, 20 만 명 이상의 여성들이 침습적 유방암 매년 진단되고 약 40,000 병으로 죽을 것이다. 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I의 세포 단백질 시료 프로 테오 분해로부터 유도 된 펩티드를 순환 및 세포 독성 T 림프구 (CTL)에 의해 심문 세포 표면에 이러한 단편을 제시한다. T 세포 수용체 모방의 발생 (TCRM) 모노클로 날 항체 유방암 인식 (모노클로 날 항체) 특정 펩타이드 / HLA-A * 02 : 대 식세포 이동 억제 인자 (MIF 19-27) 및 NY-ESO-로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 1 157-165은 효과적인 항 종양 CTL 반응의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 본래 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 유방암 세포에 의해 창고 및 잠재적으로 관련 암 바이오 마커를 표현하고 있습니다. 이 작품은, 진단 암에 대한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템에서T 세포 수용체를 가이드 모드 공명 (GMR) 센서 기술을 이용하여 신규, 라벨없는 바이오 센서와 결합 모방 모노클로 날 항체를 포함하는 s를 제공한다. 창고 MIF / HLA-A의 검출은 * 02 : MDA-MB-231 세포 상층 액 01 단지는, 인간 혈청 아군, 환자 플라즈마가 설명된다. 이 작품의 영향을 대상으로 면역을위한 동반자 질환 진단의 개발을 통해 맞춤 의학 혁명을 가져다 줄 수있을 것이다.

01 분자 3 : 실험의 대표적인 세트는 HLA-A * 02의 컨텍스트 내에서 잘 특성화 TCRM, RL21A, 특히 펩티드를 인식 쥐의 IgG2a 단클론 항체 (MIF 19-27 또는 FLSL)를 사용하여 수행 하였다. 동족 펩티드 / HLA 단량체뿐만 아니라 부적합 HLA 단량체 (15)은 설명 된 절차를 보여주기 위해 사용 하였다. (3)는 분석 포맷을 도시한다. RL21A 다른 펩타이드 / HLA가 3 복합체와 작은 교차 반응성 FLSL / HLA 모노머에 대한 특정이다. 이 특이성은 라벨없는 생물 분석 시스템 (도 4)를 사용하여 효과적으로 요약된다. 고정화 FLSL / HLA 단량체 (도 5)에 RL21A 항체의 적정에 의해 측정이 실험 라벨없는 생물 검정 시스템의 감도가 낮은 나노 몰 범위이다. 백그라운드 신호 크게 혈청 샘플에서 증가 하였지만,이야인간 혈청에서 스파이크 된 FLSL / HLA 단량체 pecific 검출은도 6에서 달성되고, 농도 구배를 용이하게 식별 가능한 이들 샘플이다. 마지막으로, MDA-MB-231 세포주로부터의 상층 액은, 이전 FLSL / HLA-A * 02 제시 도시 : 01 분자를,이 라벨없는 분석 플랫폼 (도 7)를 사용하여 수용성 FLSL 단량체를 포함하도록 도시된다. FLSL / HLA 단량체 이후 추가 RL21A에 신호 (그림 7)을 증가시킨다. 인해 시스템의 감도, 웰에도 4 및도 5에 표준 편차의 함수로서와 같이 온도 변화의 결과로 발생할 수있는 음의 공진 시프트 포함한 잘 변동. 이러한 변화는 실온의 약간 과량 (즉, 28 ° C)의 온도에서 모든 샘플 및 생물학적 검정 플레이트 판독기의 사전 인큐베이션 대폭 저감 할 수있다. 간단히도 8에서, (96)- 그럼 폴리스티렌 플레이트를 코팅 하였다 [10 ㎍ / ml의] RL21A의 PBST로 세척하고 0.5 % 저지방 우유, 블로킹 및 일련 희석액을 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 PBST로 세척하고, 실온에서 2 시간, 대 정상적인 인간 혈청 FLSL HLA 단량체는 표준 곡선을 생성하기 위해 PBS에 1:10으로 희석 또는 환자 혈장은 PBS에 1:10으로 희석. HLA 손상을 검출하고, PBST 세척 : 플레이트를 PBST로 세척하고, 토끼 항 - 인간 β2 마이크로 글로불린에의 [5000 (1)]와 함께 실온에서 1 시간 배양 하였다. 플레이트를 염소 항 - 토끼 IgG를 [1 : 10,000]에 30 분 동안 인큐베이션시키고, PBST로 세척 하였다. 비색 검출 ABTS (2,2'- Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6​​-술폰산] -diammonium 염) 15 분의 배양 시간과 기판 및 마이크로 플레이트 판독기에서 405 nm에서 관찰을 사용하여 수행 하였다. FLSL / HLA 세 환자 샘플에서 검출되었다. 도 8b에서, 환자 플라즈마 RL.064는 PBS에 1:20으로 희석 한 후 추가되었다판 ED 60 분의 레이블이없는 검출기에서 모니터링. 환자 혈청에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 스튜던트 t 시험 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.05)를 사용하여 수행 하였다. 도 8c에, 조직 절편은 양성 대조군 마우스 항 - HLA-A2 (BB7.2) RL21A, 각각의 IgG2a 및 IgG2b의 네거티브 컨트롤 1 ㎍ / ㎖의에 염색 하였다. 염색은 제조업체의 지시에 따라 핵 염색 항 마우스 검출 키트, DAB (diaminobenzadine)와 헤 마톡 실린 QS를 사용하여 검출되었다. RL21A으로 종양 조직의 염색은 FLSL / HLA 복합체의 프리젠 테이션을 확인합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg"> 도 1 :. 클래스 I 인간 백혈구 항원에 의해 종양 항원 제시 변환 암성 세포 질환이다. HLA 샘플 intracellul아칸소 단백질과 세포 표면에서 암 관련 변경 사항을 알 수있다. CTL과 TCRM 그 세포에 별개의 HLA-펩타이드 복합체를 통해 암 세포를 인식 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg"> 그림 2 :. 초기 기준을 보여주는 데이터 수집의 생물 검정 스캐너 ​​소프트웨어에서 데이터 수집의 스크린 샷 예는 FLSL / HLA 복합체의 10 ㎍ / ml로 코팅 된 플레이트에 RL21A 항체를 첨가하여 검색합니다. 항체의 농도는 표시됩니다. 각 라인은 개인이 아니라 시간이 지남에 따라 모니터링 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg"> 그림 3 :. 분석 플레이트 캡처 확인해의 회절 격자 표면에 고정 항체의 분석 형식의 그림evant 펩타이드 / 솔루션 HLA 복합체. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg"> 그림 4 :. 관련이없는 HLA 모노머 (YLEV, SLLV 및 KVL)에 비해 그 관련 (FLSL) HLA 모노머에 대한 바이오틴 RL21A TCRM의 특이성의 FLSL / HLA 복잡한 데모에 대한 RL21A의 특이성. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 표면에 고정화하고, 검출에 표지 된 PBS 또는 무관 관련 HLA 단량체 [10 ㎍ / ㎖의]를 사용하여 수행 하였다. RL21A는 FLSL / HLA 단지에 대한 특정했다. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.001)를 이용하여 수행 하였다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg"> 그림 5 :. detecti의 동종의 펩타이드 / HLA 복합체 RL21A의 감도를 바인딩 그림제한 및 FLSL / HLA 복합체 RL21A의 감도를 결합합니다. 비 오티 닐화 된 HLA 단량체 FLSL [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 플레이트 표면에 고정화하고, 지시 된 바와 같이 표지 된 RL21A는 PBS에서 연속 희석으로 플레이트에 첨가 하였다. 이 시스템에 대한 인식은 낮은 나노 몰 범위에 있었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg"> 그림 6 :. 인간 혈청에서 HLA의 검출의 가시 박힌 인간 혈청 데모에서 HLA 단지의 검출. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 상에 고정화시켰다. 관련 (FLSL) 또는 무관 (SLLV) HLA 단량체와 아군 풀링 정상적인 인간 혈청은 PBS에 1:20으로 희석 한 다음 판에 추가하고 60 분 동안 라벨없는 검출기에서 측정 하였다. 인간 혈청에 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 일반적으로, 백그라운드 신호 (부적합 SLLV 단량체) 높다ER 희석 혈청 샘플 분석 PBS에서 정제하여 (도 4 참조)에 비해. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg"> 도 7 :. 가용성 HLA 복합체가 유방암 세포 배양 상청액에서 검출 유방암 세포 상청액 HLA를 감지하는 능력이 입증된다. 오티 닐화 RL21A TCRM, RL9A TCRM (음성 대조군), 및 이소 제어 분석 플레이트의 표면에 고정시켰다. 아군 [5 ㎍ / ㎖의] unspiked 및 MDA-231 세포 배양 상등액을 첨가하고, 라벨없는 검출기에서 60 분 동안 결합​​을 모니터링 하였다. FLSL 및 SLLV HLA 단량체 샘플 RL9A과 RL21A 바인딩에 대한 긍정적 인 컨트롤을 나타냅니다 아군. 일방향 ANOVA는 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. 그림 8 :. 환자 샘플에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출 (A) 면역 흡착제 분석 (ELISA) 링크 전통적인 효소는 환자의 혈장에서 FLSL / HLA 특정 단지를 검출하기 위해 사용 하였다. (B) 바이오틴이 RL21A TCRM 또는의 IgG2a는 [10 μg의는 / ㎖]하는 아비딘 분석 플레이트에 고정되었다. 환자 RL.064에서 (C) 유방 종양 조직 이전에 FLSL / HLA 복합체의 종양 프리젠 테이션을 확인하기 위해 3 기술로 염색했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

이 절차의 전반적인 목표는 환자 체액에서 인간 백혈구 항원 또는 HLA 관련 종양 항원을 측정하여 환자를 관련 면역 요법으로 계층화하는 것입니다. 이는 먼저 TCRM으로 알려진 항체를 모방한 T 세포 수용체를 MICROPLATE 표면에 고정시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 표적 펩타이드 HLA 단량체의 연속 희석과 함께 환자 시료를 추가하여 표준 곡선을 생성하는 것이며, 이를 통해 환자 시료에서 표적 항원을 정량화할 수 있습니다.다음으로, free label bioassay 시스템의 항체에 대한 표적 항원의 결합은 평형에 도달할 때까지 모니터링됩니다. 마지막 단계는 표준 곡선을 사용하여 결과 데이터를 분석하여 환자 샘플의 표적 항원의 양을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 무표지 바이오센서 기술은 환자 샘플에서 암 바이오마커를 검출하는 데 사용됩니다.lc MSS와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 HLA 관련 항원을 빠르게 고처리량으로 검출할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 암 환자를 치료 방식으로 빠르게 계층화할 수 있는데, 이는 바이오마커 검출 플랫폼 역할을 하기 때문입니다. 이 방법은 암 바이오마커의 스크리닝과 관련이 있지만, 이 시스템은 실제로 세포 기반 분석, 면역 표현형 하이브리드 스크리닝 또는 소분자 라이브러리 스크리닝을 포함한 많은 응용 분야에 적용할 수 있습니다.이 방법에 대한 아이디어는 치료용 T세포 수용체 모방 항체를 개발하던 시절에 처음 떠올랐습니다. 우리는 이러한 유형의 치료로부터 가장 큰 혜택을 받을 환자를 어떻게 식별할 수 있는지 자문했습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실에서 일하는 생명공학 대학원생인 Kristen Dahl입니다.먼저 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 섭씨 28도에서 사전 배양하여 온도 관련 공명 변화를 최소화합니다. 50마이크로리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS pH 7.2를 아바돈 유도체 코팅 플레이트의 웰에 추가합니다. 그런 다음 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 엽니다.설정 마법사를 따라 플레이트 레이아웃에서 블랭크, 표준물질 및 시료 선택, 온도 설정, 분당 스캔 횟수 및 실험 길이를 포함하는 실험 절차를 정의합니다. 그런 다음 준비된 분석 플레이트를 라벨이 없는 생물학적 분석 스캐너에 삽입하고 첫 번째 스캔을 시작합니다. 기준선은 실험 시작 시 수집된 초기 스캔 세트입니다.이것이 이 특정 플레이트에서 수행된 첫 번째 판독인 경우 스캐너가 온도를 평형화하고 기준선의 드리프트를 제거할 수 있을 만큼 충분히 오래 작동하도록 합니다. 베이스라인이 안정화된 후 또는 최소 5회 스캔 후 판독을 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다. PBS를 버리고 50마이크로리터의 RL 21 비오틴화 항체를 플레이트의 제어 웰을 제외한 모든 것에 추가합니다.그런 다음 50마이크로리터의 PBS를 제어 웰에 추가합니다. 다음으로, 플레이트를 생물 검정 스캐너에 다시 삽입하고 포화 상태에 도달할 때까지 판독을 재개합니다. 약 1.5시간 후 읽기를 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다.그런 다음 PBS 웰당 200마이크로리터와 0.05%Tween 20 또는 PBST로 플레이트를 세 번 세척합니다. 세제 없이 PBS pH 200 웰당 7.2마이크로리터를 3번 헹궈 세척한 후 세탁합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 종이 타월의 접시에서 여분의 PBS를 두드립니다.다음으로, 모든 활성 웰에 50마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 판독을 재개하여 세척 후 공진을 모니터링합니다. 읽은 후 읽기를 중지하고 플레이트를 꺼냅니다.분석물을 추가합니다. PBS를 제거하고 이 분석을 위해 적절한 분석 버퍼의 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. 시판되는 정상 인간 혈청을 PBS에서 1 내지 20으로 희석하였다.그런 다음 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 열고 설정 마법사를 따릅니다. 실험 절차를 정의하려면 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 삽입하고 기준선 판독을 시작합니다: 기준선이 안정화된 후 또는 최소 5회 스캔 후에 판독을 일시 중지하고 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 웰에서 분석 버퍼를 제거합니다.그런 다음 분석 완충액에서 밀리리터당 0.625에서 10마이크로그램 범위의 농도로 관련성이 있거나 관련이 없는 펩타이드를 함유하는 HLAA oh 2 0 1 단량체로 대조군을 스파이크합니다. 그런 다음 플레이트의 제어 웰에 50마이크로리터의 표준물질을 추가합니다. 다음으로, 분석 완충액에 있는 분석물 50마이크로리터를 플레이트의 샘플 웰에 추가합니다.이 분석을 위해 스파이크(spiked) 시판되는 인간 혈청이 사용되었습니다. 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 포화 후 약 30-60분 후에 포화도에 도달할 때까지 판독을 재개한 후 판독을 일시 중지하고 플레이트를 배출합니다. PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척한 다음 이전과 같이 PBS 웰당 200마이크로리터로 3번 헹궈낸 다음 모든 활성 웰에 50마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.이제 플레이트를 생물학적 분석 스캐너에 다시 삽입하고 판독을 재개하여 판독을 중지하고 플레이트를 배출하기 전에 세척 후 공진을 모니터링합니다. 마지막으로, 생물 검정 스캐너 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하거나 원시 데이터 파일을 선호하는 통계 분석 소프트웨어로 내보냅니다. 생물 검정 스캐너 소프트웨어는 실험 설정 중에 제공된 플레이트 레이아웃을 기반으로 결합 곡선을 자동으로 생성합니다.Biotinylated RL 21 A-T-C-R-M 또는 IgG two A를 AVID AVIDAN 분석 플레이트에 고정시킨 대표적인 결과는 평형 상태 및 세척 후 환자 혈장 샘플에서 표적 종양 항원 F-L-S-L-H-L-A의 검출을 보여줍니다. IgG 2 A는 비특이적 결합 조직 절편을 양성 대조군과 음성 대조군으로 염색하기 위한 대조군으로 사용된다. 그리고 RL 21의 경우 RL 21 A에 의한 종양 조직의 염색은 F-L-S-L-H-L-A 복합체의 발현을 확인합니다.이 동영상을 시청한 후에는 항체를 모방한 T 세포 수용체를 사용하여 환자 체액에서 HLA 관련 바이오마커를 측정하고 label-free bioassay 시스템에서 표적 항원과 항체의 결합을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 온도 상승을 방지하고 각 단계에 올바른 샘플 버퍼를 사용하기 위해 사용하기 전에 모든 샘플 버퍼를 배양해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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