가금류 생산 샘플에서 세균 공동체의 정성 및 정량 평가를위한 하이브리드 DNA 추출 방법
2014년 12월 10일
환경 가금류 생산 샘플에 사용하기 위한 새로운 반자동 하이브리드 DNA 추출 방법이 개발되었으며 전체 박테리아 군집의 정량적 및 정성적 추정치 측면에서 일반적인 기계적 및 효소 추출 방법에 비해 개선되었음을 입증했습니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 기계적 DNA 균질화와 PCR 억제제 제거를 결합한 새로운 DNA 추출 기술을 개발하고 가금류 생산 연속체를 따라 환경 샘플에 대한 황금 표준 및 체세포 추출 방법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 환경 시료를 비드 혼합물이 포함된 마이크로 원심분리 튜브로 분할하여 복잡한 환경 시료를 효과적으로 균질화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 튜브를 고출력 균질화기에 배치하여 박테리아 세포와 환경 매트릭스에서 핵산을 효율적으로 방출하는 것입니다.
다음으로, homogenate는 PCR inhibition binding phase를 통해 gold standard enzymatic DNA extraction Method의 출발 물질로 사용됩니다. 마지막 단계는 샘플을 DNA 추출 로봇 워크스테이션에 배치하여 사용자에게 다양한 다운스트림 애플리케이션에 적합한 추출된 DNA 샘플을 제공하는 것이며, 궁극적으로 알루미늄 MiSeq 플랫폼을 사용한 정량적 PCR 및 마이크로바이옴 분석을 사용하여 이 새로운 하이브리드 방법이 기계적 또는 효소적 추출 방법으로 샘플을 처리하는 것과 비교하여 전체 박테리아 군집에 대한 정성적 및 정량적 평가의 최상의 조합을 제공한다는 것을 보여주었습니다 혼자. 이 방법은 가금류 생산 연속체를 따라 미생물 군집 분석에 대한 통찰력을 제공하지만, 돼지 소 또는 유사하게 복잡한 환경 샘플을 포함하는 작물 생산과 같은 다른 농업 시스템에도 적용할 수 있습니다.
오늘 이 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 학생인 Kaitlyn Griffin입니다. 실험을 시작하려면 수조를 섭씨 95도로 설정합니다. 다음으로, 0.33g의 반복을 3회 계량하여 총 1g의 실온, 토양 또는 배설물을 시료 사이의 2ml 용해 매트릭스 ET-튜브 교체 장갑으로 분석합니다.
825마이크로리터의 인산나트륨 완충액과 275마이크로리터의 사전 용해 용액 또는 PLS를 샘플 튜브에 추가합니다. 다음 와동은 14, 5 분 동안 000 Gs에 분리기를 섞는 후에 15 초 동안 표본을 표본 원심분리기 만든다. 상등액을 디캔팅하고 700 마이크로 리터의 완충액 A SL을 첨가하십시오. 그런 다음 5초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.
오염을 방지하기 위해 한 번에 하나의 튜브를 엽니다. 다음으로, 샘플을 Fast Prep 24 기기에 넣기 전에 원뿔형 튜브에 총 부피의 10%의 헤드스페이스가 있는지 확인합니다. 40초 동안 초당 6미터의 속도로 샘플을 균질화합니다.
빠른 준비 24와 균질화 후 볼텍싱의 차이점에 주목하십시오. 14, 5 분 동안 000 GS에 표본을 원심 분리하십시오. 상등액을 멸균 2ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 추가 700마이크로리터의 SL 완충액 재균질화 및 원심분리에서 용해 매트릭스 ET-튜브의 나머지 샘플로 이동합니다.
이전 설정을 사용하여 샘플 튜브에 플라스틱 잠금 클립을 배치하여 튜브가 튀어나오지 않도록 하고 섭씨 95도의 수조에서 5분 동안 상층액을 배양합니다. 그런 다음 각 마이크로 원심분리기 튜브를 열어 압력을 해제하고 튜브를 다시 덮고 15초 동안 볼텍스합니다. 14, 1 분 동안 000 GS에 표본을 분리기로 만드십시오.
원심분리 후 1.2ml의 상등액을 멸균된 2ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음 탭이 들어 있는 블리스터 팩을 열린 마이크로 원심분리기 튜브 바로 위에 놓고 블리스터 팩의 탭을 튜브로 부드럽게 밀어 넣습니다. inhibit X 탭과 튜브 사이의 접촉을 피하려면 각 샘플에 하나의 inhibit X 탭을 추가합니다.
다음으로, 샘플이 균일한 회백색 액체로 변할 때까지 튜브를 와류로 회전시킵니다. 실내 온도에 1 분 동안 표본을 배양하고 14, 관의 바닥에 어떤 잔여 입자든지 피하면서 5 분 동안 000 치즈에 그(것)들을 원심분리하십시오. 모든 액체를 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 5분 동안 최고 속도로 튜브를 원심분리합니다. 자동 DNA 정제를 시작하기 전에 워크스테이션에 적절한 양의 필터 팁과 버퍼가 포함되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 엘루시안 튜브와 필터 튜브를 로터 어댑터에 추가하고 각 샘플 400마이크로리터를 로터 어댑터의 중간 슬롯에 추가합니다.
로터 어댑터를 워크스테이션 원심분리기에 놓고 모든 마이크로 원심분리기 튜브 덮개가 로터 어댑터 내에 제대로 고정되었는지 확인합니다. 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 proteinAse K 용액을 추가하고 워크스테이션의 슬롯 A에 놓습니다. 워크스테이션의 셰이커 섹션에 2개의 밀리리터 안전 잠금 마이크로 원심분리기 튜브를 추가하고 샘플 튜브의 뚜껑이 단단히 고정되었는지 확인합니다.
워크스테이션의 터치 스크린을 사용하여 DNA 대변 인간 대변 병원체 검출 프로토콜을 선택하고 후속 화면을 읽어 워크스테이션이 올바르게 로드되었는지 확인합니다. 모든 검사 화면이 통과되면 시작을 선택하여 프로토콜을 실행합니다. 그런 다음 s를 제거하십시오amp로터 어댑터에서 les.
원심분리 증발 기반 시스템을 사용하여 개별 시료에 대한 3가지 복제 정제를 결합합니다. 트리스 EDTA 버퍼를 사용하여 샘플을 최종 부피 100마이크로리터로 다시 용출합니다. 마지막으로, 샘플을 마개하고 다운스트림 분석에 필요할 때까지 섭씨 영하 20도에 놓습니다.
이 그래프는 기계적 방법이 분변 및 깔짚 샘플에 대해 전체적으로 가장 높은 총 박테리아 정규화 유전자 풍부도 추정치를 일관되게 제공했음을 보여줍니다. 효소 방법은 모든 사례에서 추정치가 가장 낮았습니다. 새로운 하이브리드 추출 방법은 정성적 및 정량적 총 박테리아 군집 추정치의 최상의 조합을 생성했습니다.
테스트된 세 가지 추출 방법 중. 이제 이 새로운 반자동 하이브리드 DNA 추출 방법을 수행하는 방법을 더 잘 이해하고 복잡한 환경 샘플에서 미생물 군집의 정성적 및 정량적 평가에서 그 유용성을 확인할 수 있습니다.
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개요
환경 가금류 생산 샘플을 위한 새로운 반자동 하이브리드 DNA 추출 방법이 개발되었습니다. 이 방법은 기존의 추출 방법에 비해 총 박테리아 군집의 정량적 및 정성적 추정치의 개선을 보여주었습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 미생물학
- 환경 과학
- 생명공학
배경
- DNA 추출은 미생물 군집을 분석하는 데 중요합니다.
- 기존 방법은 복잡한 환경 샘플에 어려움을 겪는 경우가 많습니다.
- 추출 기술을 개선하면 하위 응용 프로그램을 향상시킬 수 있습니다.
- 이 연구는 가금류 생산 환경에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- 하이브리드 DNA 추출 기술을 개발합니다.
- 기계적 균질화와 효소적 추출을 결합합니다.
- 가금류 생산의 미생물 군집 분석을 개선합니다.
사용된 방법
- 환경 샘플은 비즈를 사용하여 균질화되었습니다.
- 핵산 방출을 위해 고성능 균질화기가 사용되었습니다.
- 균질화물은 금준위 효소 방법을 사용하여 처리되었습니다.
- 로봇 작업장은 DNA 샘플의 추출을 촉진했습니다.
주요 결과
- 하이브리드 방법은 우수한 정성적 및 정량적 결과를 제공했습니다.
- 기계적 및 효소적 추출 방법 모두를 단독으로 능가했습니다.
- 결과는 정량적 PCR 및 마이크로바이옴 분석을 통해 검증되었습니다.
- 이 방법은 복잡한 샘플을 가진 다른 농업 시스템에 적용 가능합니다.
결론
- 새로운 하이브리드 방법은 환경 샘플로부터 DNA 추출을 향상시킵니다.
- 가금류 생산의 미생물 군집에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
- 이 기술은 다른 농업 문맥에서 사용하도록 적응될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Robust DNA extraction from complex environmental samples is critical for accurate microbiome profiling and quantitative bacterial community assessment in agricultural R&D. The hybrid extraction method enhances both qualitative and quantitative outputs, supporting higher predictive confidence in microbial community analyses. This capability is strategically relevant for biopharma teams developing or validating disease-relevant models and translational biomarkers in animal health and production systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of microbial community structure in complex matrices.
- Improves detection of Gram-positive bacteria, reducing biological ambiguity in target validation.
- Supports functional assessment of microbial contributions to host phenotypes.
- Facilitates portfolio triage by providing reliable community composition data.
Screening & Assay Development
- Delivers high-quality DNA suitable for quantitative PCR and microbiome sequencing workflows.
- Standardizes extraction across diverse sample types, improving assay reproducibility.
- Enhances throughput and reduces manual error via semi-automation.
- Enables reliable downstream screening of microbial or host-microbe interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial community assessment with disease-relevant animal models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in agricultural and animal health research.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by providing robust quantitative and qualitative data.
- Facilitates biomarker discovery and validation in complex environmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This hybrid extraction method fits at the interface of sample preparation and downstream molecular analysis, bridging early discovery and preclinical research in agricultural and animal health pipelines.
- Discovery Biology: Provides reliable DNA extraction for hypothesis testing and microbial pathway clarification.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility for quantitative and qualitative microbial analyses.
- Analytics: Supports quantitative PCR and microbiome sequencing outputs for comparative studies.
- Translational Research: Enables robust microbial community profiling in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, semi-automated workflow adaptable to various complex environmental samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial community studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable DNA extraction across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-quality data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of animal health and agricultural R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and environmental sample handling.
- Needs access to high-powered homogenizers and automated DNA extraction workstations.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and data comparability.
- Adaptable to various environmental matrices with similar complexity to poultry production samples.
- Potential limitations include initial equipment investment and protocol optimization for new sample types.
