PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경
2014년 10월 24일
이 논문에서는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 단백질 광수용체의 구조를 조사하는 방법을 설명합니다. PeakForce 정량적 나노기계적 특성 매핑(PF-QNM)은 운모 표면에서 손상되지 않은 단백질 이량체를 보여줍니다.
이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 광수용체 단백질의 고해상도 이미지를 수집하는 것입니다. 이것은 먼저 광수용체의 샘플을 얻고 희석함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 단백질 샘플을 갓 절단하고 깨끗한 운모 표면에 약 30초 동안 적용하는 것입니다.
그런 다음 MICA를 완충액으로 헹궈 결합되지 않고 느슨하게 부착된 분자를 제거합니다. 다음으로, 샘플은 적절한 프로브가 장착된 액체 셀에 부착됩니다. 이 어셈블리는 스캐너에 로드됩니다.
액체 셀에 완충 용액을 채운 후 팁과 샘플을 결합하고 스캔을 시작합니다. 궁극적으로, 피크 힘을 통합한 원자력 현미경. 정량적 나노 기계적 특성 매핑은 샘플 표면에서 단일 광수용체 단백질의 이미지를 수집하는 데 사용됩니다.
피크 포스 q와 m을 통합한 원자력 현미경은 생물학적으로 활성화된 거대분자의 기능을 결정하는 중요한 구조적 및 화학적 특성이 무엇인지와 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. NMR 및 X선 결정학과 같은 현재 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 생물학적으로 관련된 환경에서 온전한 단백질 및 기타 생물학적 거대분자의 고해상도 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 프로브와 솔루션을 조정하는 데 여러 단계가 필요하고 그 중 일부는 매우 복잡하기 때문에 어려움을 겪습니다.
최대 하중 q 및 m과 자동화된 소프트웨어를 사용하면 이러한 단계 중 몇 가지가 더 간단해져서 새로운 사용자와 학부생이 프로세스를 훨씬 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 세 명의 학부생인 Marie Kroger, Blair Sorenson, Jessica Thomas입니다. 이 학생들은 다가오는 해에 미생물학, 화학 공학 및 화학 분야에서 대학원 과정을 밟을 것입니다.
이러한 항목은 특정 순서로 켜져 있어야 합니다. 첫 번째는 컴퓨터, 그 다음은 컨트롤러, 마지막으로 광섬유 조명입니다. 현미경은 FM 및 LF fm을 읽어야 합니다.
카메라는 소프트웨어의 FM 광학 헤드 중앙에 있어야 합니다. 다음을 선택해야 합니다. 실험 범주는 기계적 특성입니다.
실험 그룹은 정량적 나노 기계 매핑이고 실험은 유체의 피크 힘 q 및 m입니다. 설정을 올바르게 선택하면 실험을 로드하고 설정할 수 있습니다. 카메라 초점은 먼저 Z 대물렌즈를 사용하여 설정한 다음 코스 컨트롤을 사용하여 스테이지를 배치해야 하며, 목표는 A FM 헤드 조리개를 스테이지 표면 1mm 앞에 배치하여 갓 절단된 운모로 샘플 디스크를 조작하는 것입니다.
깨끗하게 청소된 부품에서 유체 셀을 조립하는 것으로 시작합니다. 먼저 호스 어댑터를 깨끗한 유체 셀의 포트에 연결합니다. 그런 다음 납작헤드 핀셋을 사용하여 매우 부드럽게 O-링을 유체 셀의 움푹 들어간 곳으로 누릅니다.
다음으로 프로브 리테이너 클립에서 스프링을 가볍게 누르고 홈에서 멀어지게 합니다. 동일한 핀셋을 사용하여 프로브를 잡고 홈에 밀어 넣어 팁이 세포 중심을 향하도록 합니다. 그런 다음 클립을 사용하여 프로브를 고정합니다.
다음 단계는 A FM.It 의 클램프가 완전히 접혀 있는지 확인하는 것입니다. 어셈블리를 아래쪽을 향하도록 하여 샘플 위에 놓습니다. 안정화를 위해 어셈블리를 A FM의 스터드에 맞춥니다.
클램프를 내립니다. O-링을 검사하려면 O-링이 보일 때까지 현미경의 아래쪽 스위치를 누르십시오. 지지 디스크와 유체 셀 사이에서 단단히 압축되어야 합니다.
유체 셀은 거친 조정 손잡이를 사용하여 초점을 맞출 수 있습니다. 그런 다음 XY 조정을 사용하여 프로브 팁에 초점을 맞춥니다. 그것은 금속 황금 삼각형처럼 보입니다.
이제 아래쪽 pizo 레버를 사용하여 팁을 샘플 표면 가까이로 이동하고 팁, 반사에 대한 초점을 조정하고 이 반사와 관련하여 캔틸레버 위치를 모니터링합니다. 현재로서는 긴밀하게 정렬되어야 하지만 완전히 겹치지 않아야 합니다. 이제 주사기를 준비합니다.
1ml의 버퍼 용액을 채우고 어댑터를 부착합니다. 그런 다음 주사기를 배출 호스에 부착하고 플런저를 완전히 확장합니다. 다음으로, 챔버를 채우기 위해 어댑터를 사용하여 호스를 유체 셀에 연결하고 챔버 중심이 가득 찰 때까지 플런저를 부드럽게 누릅니다.
유체 셀에서 현미경으로 기포나 유출이 없어야 합니다. 그런 다음 챔버 위의 잘 지지된 위치에 주사기를 놓습니다. 그런 다음 카메라 피드와 XY 변환 노브를 사용합니다.
화면에서 레이저를 찾으려면 확산 빨간색 점으로 나타나야 합니다. 찾으면 레이저 컨트롤을 사용하여 프로브로 이동합니다. 이제 마지막으로 현미경의 합 신호가 4에서 6 사이로 최대화될 때까지 레이저 및 미러 컨트롤을 조정하고 사분면 다이오드를 조정합니다.
그런 다음 스캔 헤드의 손잡이를 사용하여 현미경의 값이 가능한 한 0에 가깝게 돌아갈 때까지 수직 및 수평 편향을 조정합니다. 계속하기 전에 적절한 획득 옵션을 선택해야 합니다. lines 창당 샘플에서 스캔 속도를 약 1 헤르츠로 설정합니다.
256을 입력합니다. 스캔 지원 자동 제어용. 스캔 어시스트 자동 Z 제한에 대해 개별을 선택하고 끄기를 선택합니다.
Z 한계는 500나노미터여야 하고 스캔 크기는 1미크론이어야 합니다. 설정이 올바르게 설정되면 프로브를 측정합니다. 프로브 팁이 표면에 접근함에 따라 Z pazo 전압 변화를 관찰합니다.
팁이 범위를 벗어나 철회했다가 다시 접근하면 프로브 팁을 교체해야 할 수 있습니다. 이것이 작동하지 않으면 팁이 맞물렸을 때 각 획득 창에 선이 나타나야 하며 이러한 선은 이미지를 구성합니다. 운모의 이미지를 지속적으로 캡처하기 시작합니다.
천천히 확대하여 MICA 표면이 평평하고 깨끗한지 확인합니다. 냉장 이미징 버퍼 용액이 있는 4개의 챔버 페트리 접시를 준비합니다. 각 챔버에는 최소 5밀리리터가 필요합니다.
희석된 단백질의 분취액을 섭취하기 전에 마이크로 피펫으로 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 200마이크로리터의 분취액을 취하여 희석된 단백질을 MICA 표면에 적용합니다. 용액이 표면에 상주할 때까지 약 30초 동안 기다립니다.
그런 다음 디스크 그리퍼를 사용하여 디스크를 기울이지 않고 들어 올리고 즉시 버퍼 용액의 첫 번째 풀에 담그십시오. 1초 동안 디스크가 벤치와 평행을 유지하는지 확인합니다. 헹굼 단계에서 샘플을 페트리 접시와 평행하게 유지하는 것이 매우 중요합니다.
이 부드럽고 유연한 분자는 수용액의 강한 흐름에 의해 표면에서 왜곡될 수 있습니다. 다음으로, 풀당 1초 동안 다른 세 개의 풀 각각에 디스크를 잠시 담그십시오. 그런 다음 디스크를 건조하고 먼지가 없는 천에 옮깁니다.
과도한 수분이 천으로 전달되도록 하되 디스크가 완전히 건조되지 않도록 하십시오. 천이 샘플에 닿지 않도록 하십시오.amp디스크 그리퍼가 있는 천에서 s를 조심스럽게 제거하고 s를 놓습니다.ample A FM 스캐너에 올려 놓습니다. 유체 셀을 샘플 위에 놓고 설정 및 이미징을 진행합니다.
프로브에 대한 모든 매개변수가 끝나면 스프링 크기와 팁 반경이 올바르게 설정됩니다. 이미징할 때와 같이 프로브를 측정합니다. Micah, 끝이 표면에 접근할 때 ZP azo를 관찰하십시오.
이미지를 촬영할 때 스캐너가 최소 두 번 연속 통과 동안 동일한 영역을 이미지화할 수 있도록 합니다. 연속 캡처를 사용하여 각 이미지를 저장합니다. 원하는 대로 이미지 크기와 위치를 조정합니다.
자동화 소프트웨어가 특정 이미지 크기에 대한 스캔 매개변수 조정을 완료하면. 소프트웨어를 끄십시오. 이미지의 초점을 수동으로 조정하고 스캔 속도, Z 한계, 라인 수 및 설정점을 조정합니다.
이미지의 초점이 너무 흐려지면 소프트웨어를 다시 켜서 원래 시작 위치로 돌아갑니다. 단백질을 확대하는 동안 스캔 속도를 줄이고 라인 수를 비례적으로 늘려 이미지의 해상도를 높입니다. 나중에. 이미지를 분석할 때 먼저 병합 아이콘을 클릭하여 이미지를 병합합니다.
0번째 순서를 선택하고 작업을 실행합니다. 때로는 적절하게 평평한 이미지를 얻기 위해 일반 맞춤을 사용해야 합니다. plain fit 아이콘을 선택하고 커서를 사용하여 이미지의 평평한 영역 위에 평면을 그립니다.
플레인 맞춤을 실행하고 필요에 따라 작업을 반복합니다. 다음으로, 단백질의 치수를 측정하기 위해 단면 탭을 선택합니다. 분석할 분자 또는 영역 위에 커서를 사용하여 선을 그립니다.
여러 영역에서 이 프로세스를 반복합니다. 오버레이가 필요한 경우, 빛에 적응한 상태의 광수용체 단백질에 대해 FM을 사용하여 여러 생물학적 분자를 연구할 수 있으며, 갓 절단된 운모 기질은 단백질 흡수에 적합한 평평한 표면입니다. 단일 광수용체 단백질 이량체는 피크 포스 QNM 모드를 사용하여 관찰할 수 있었습니다.
화살표는 개별 이량체를 가리키고 별표는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 단백질 응집체를 나타냅니다. 단백질의 단면은 이미지가 평탄화된 후에 측정될 수 있습니다. XY 데이터는 높이 측정과 상관관계가 있습니다.
이는 다양한 계산에 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적으로 관련된 환경에서 표면의 단백질에 대한 고해상도 이미지를 수집하기 위해 A FM 실험을 설정할 수 있습니다. 피크 포스 q 및 m 사용일단 마스터하면 이 기술을 약 3-4시간 내에 수행할 수 있습니다.
따라서 피크 힘 q 및 m은 기기 분석, 생화학 및 현대 물리학과 같은 실험실 과정에 등록한 학부생에게 소개하기에 적합한 원자력 현미경 형태입니다. 개발 후 이 방법은 스캐닝 프로브 현미경 검사 분야의 연구원들이 단백질, 핵산 및 생물학적으로 관련된 배지에서 살아있는 세포와 같은 생물학적 분자를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
이 논문은 원자간 힘 현미경(AFM)을 사용하여 단백질 광수용체의 구조를 조사하는 방법을 설명합니다. 피크포스 정량 나노기계적 속성 매핑(PF-QNM) 기술을 사용하여 맥아 표면에서 손상되지 않은 단백질 이량체를 나타냅니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물물리학
- 구조생물학
배경
- 단백질 광수용체는 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.
- 원자간 힘 현미경은 생체 분자의 고해상도 이미지를 허용합니다.
- 이러한 단백질의 구조를 이해하면 그들의 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- PF-QNM은 AFM의 이미징 기능을 향상시키는 새로운 기술입니다.
연구 목적
- 광수용체 단백질의 고해상도 이미지를 수집합니다.
- 단백질 이량체의 구조적 무결성을 조사합니다.
- 단백질 구조를 시각화하는 데 있어 PF-QNM의 효과를 입증합니다.
사용된 방법
- 광수용체 단백질의 샘플 준비.
- 적용 전 단백질 샘플의 희석.
- 갓 분리된 맥아 표면에 샘플 적용.
- 부착되지 않은 분자를 제거하기 위한 완충액으로 헹궈줍니다.
주요 결과
- 맥아 위에서 손상되지 않은 단백질 이량체의 성공적인 이미징.
- 나노기계적 속성 매핑에서 PF-QNM의 능력 시연.
- 광수용체의 구조적 세부 사항을 드러내는 고해상도 이미지.
- 단백질 구조에 대한 향후 연구를 위한 방법의 검증.
결론
- 이 방법은 단백질 광수용체를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.
- PF-QNM은 단백질 구조-기능 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 이 기술은 유사한 조사를 위해 다른 생체 분자에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy with PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) enables high-resolution imaging of intact protein photoreceptors in biologically relevant environments, supporting target validation by revealing structural details of light-sensing proteins. This approach reduces reliance on crystallization and NMR, offering a label-free method to assess protein integrity and oligomerization states early in discovery. The automation via ScanAsyst software improves reproducibility and accessibility for screening applications, accelerating mechanistic de-risking of photoreceptor targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of protein dimerization and aggregation states to interrogate therapeutic hypotheses about photoreceptor function.
- Operational Value: Provides label-free, native-condition imaging that avoids artifacts from fixation or staining, supporting reliable target confirmation.
- Predictive Value: Supports assessment of structural stability and conformational changes under physiological buffer conditions, informing lead selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantitative nanomechanical maps (e.g., adhesion, deformation) that serve as functional readouts for compound-induced conformational shifts.
- Reproducibility: ScanAsyst automation minimizes user-dependent variability in probe tuning and scanning parameters, enhancing assay robustness.
- Scalability: Compatible with fluid imaging and routine mica preparation, allowing repeated use across multiple protein targets in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to photoreceptor proteins involved in optogenetics and circadian signaling pathways, linking structural insights to functional modulation.
- Preclinical Continuity: Enables structural validation of photoreceptor variants or mutants prior to cellular or in vivo testing.
- Mechanistic De-risking: Correlates nanomechanical properties with light-adapted states, reducing uncertainty in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
PF-QNM fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural and mechanical data that inform early go/no-go decisions. It complements biochemical assays by adding direct nanoscale imaging of target engagement and oligomerization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on photoreceptor oligomerization and structural integrity in native-like conditions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative topographical and mechanical outputs for assessing compound effects on protein structure.
- Analytics: Delivers height, adhesion, and deformation maps at each pixel, enabling multiparametric comparison of protein states.
- Translational Research: Bridges structural discovery to preclinical validation by confirming target integrity before functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable AFM workflow for diverse macromolecules, reducing revalidation effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target structure by resolving dimers and aggregates without crystallization.
- Operational Value: Automation via ScanAsyst reduces training burden and improves inter-user consistency.
- Strategic Value: Enables faster structural triage of targets, reducing time spent on low-confidence candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of protein quality and stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, fluid cell handling, and protein surface chemistry.
- Depends on access to AFM systems with PeakForce QNM and ScanAsyst software, fluid cells, and probes suitable for biological samples.
- Necessitates standardization of sample dilution, mica preparation, and buffer conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different protein concentrations, surface treatments, and environmental conditions (e.g., pH, ionic strength).
- Limited by sample adhesion efficiency and potential tip-induced deformation on very soft samples, as noted in the need for parameter optimization.
