Name: PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: 배우세요 PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 광수용체 단백질의 고해상도 이미지를 수집하는 방법을. 이 기술은 구조 생물학 연구에서 단백질 이머의 구조적 무결성을 조사하는 데 활용됩니다.

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NSF-MRI 프로그램 (CHE : 1229103)는 새로운 전자 제어 장치, 소프트웨어, 액체 세포 및 이중 AFM / STM을 조립하는 데 필요한 다른 장비의 구입 자금을 인정한다. 우리는 AFM 계측, 교육 및 영상에 대한 지원은 시카고 NSF-MRSEC 프로그램의 대학 (DMR-0820054)의 공용 시설을 인정하고 악기 시간 동안 재료 연구 시설 네트워크 (DMR은-0820054)에 의해 제공. 우리는 특히 우리의 캠퍼스에 필요한 장비를 가져 NSF-MRI 제안의 자금 전에 학생들을 환영 박사 Qiti 구오 박사 저스틴 Jureller, 교수 카 유 리 감사합니다. 소모품 공급을위한 여름 연구 학생 및 교직원에 대한 생활비 지원뿐만 아니라 제공하는 노스 이스턴 일리노이 대학에게 수여 : (P031C110157 ID) 우리는 제목 III STEM 기금에서 자금을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 계속 악기 지원 및 R에 대한 허가를 브루 커 (Bruker) 나노, 주식을 인정PeakForce QNM의 메커니즘을 보여주는 플롯을 eproduce 및 자동 소프트웨어 업데이트를 설명하는 단어 ScanAsyst을 사용합니다.

1 컴퓨터 및 현미경 설정 <ol><li> N 2 실린더의 밸브를 열고 공기 테이블이 부동 레벨 확인하기 위해 노브를 조정합니다. </li><li> 이 순서에서 컴퓨터, 컨트롤러 및 파이버 광섬유 조명을 켜십시오. </li><li> AFM / LFM 모드로 스캐너를 설정하고 AFM의 머리에 카메라를 중심으로. </li><li> 오픈 소프트웨어입니다. 선택 실험 카테고리 &quot;나노 기계 속성&quot;, 실험 그룹에서 &quot;양적 나노 기계 매핑&quot;, 그리고 실험에서 &quot;유체의 PeakForce QNM&quot;. 부하 실험 한 다음 설정을 클릭합니다. </li><li> 스테이지의 표면을 볼 Z 목적을 사용 카메라 초점. / 아래로 거친을 사용 피에조 약 1mm AFM 헤드 구경의 표면 아래의 단계를 이동합니다. </li></ol> 운모 표면의 2 준비 <ol><li> 깨끗한 샘플지지 디스크 (직경 15 mm, 두께 0.8 mm)의 표면에 접착 스티커를 누른다. 운모 V-4를 밀어접착제 위에 등급 디스크 (25 X 25 X 26mm)가 단단히 연결까지. </li><li> 완전히 공기 방울이와 함께 부착 보장 운모에 명확한 테이프의 조각을 문질러. 균등을 절단 한 측에서 운모 오프 테이프를 당깁니다. 운모는 평평 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다. </li><li> 그립지지 디스크, 원형 핀셋 (디스크 그리퍼)의 쌍 정리 운모 측, 및 스캐너에 놓는다. 운모는 AFM 헤드 개구의 레벨 이하이어야한다. </li></ol> 3 유체 셀 조립 및 운모 표면의 영상 <ol><li> 액체 셀, O-링, 주사기 어댑터, 호스 어댑터, 및 100 % 에탄올 토출 호스 린스. DI 물 내의 유체 세포를 씻어. 모든 부분의 공기가 완전히 건조한 상태가되도록하십시오. </li><li> 깨끗한 유체 셀 포트에 호스 어댑터를 밀어 넣습니다. 부드럽게 플랫 향하고 핀셋을 사용하여 유체 셀의 중심에 압입 O-링을 누른다. </li><li> 프로브 고정 클립을 살짝 봄을 누르고 groov에서 멀리십시오팁을위한 전자. </li><li> 평면 향하고 핀셋으로 멀리 끝에서 긴 끝에 프로브를 잡고. 셀의 중심에 대향하는 선단부와 그루브로 프로브를 배치했다. 에 스프링을 밀어하고 (그림 1B)를 확보하기 위해 프로브를 통해 고정 클립을 조정합니다. </li><li> 완전히 (그림 1C) 들어 갔는지 확인하기 위해 AFM에 클램프를 확인합니다. </li><li> 유체 셀, O-링을 놓고 운모 샘플의 상단에, 아래로 향 프로브. 유체 셀이 AFM의 스터드에 휴식을 허용합니다. 무대에서 유체 셀을 안정시키기 위해 클램프를 낮 춥니 다. 육안 검사가 제대로 지원 디스크와 유체 셀 사이에 압축 된 O-링 표시 될 때까지 현미경의 아래쪽 스위치를 누르십시오. </li><li> 모니터를 보면서, 화면 유체 셀의 상단을 시각화하는 거친 조정 노브 초점. </li><li> X / Y 조절 노브와 Z를 사용하여 목적 팁의 선명한 화상이있을 때까지 이동을 현미경. 팁 앱합니다금속, 황금 삼각형과 같은 귀. 현미경 아래 피에조 레버를 이용하여 시료 표면에 가까운 선단을 이동. 팁의 반사에 초점을 맞 춥니 다. 그것의 반사의 관계에서 실제 캔틸레버를 추적. 이 단계에서, 이들은 밀접하게 정렬되지만 완전히 겹치지 않는한다. </li><li> 멸균 한 ML의 주사기에 주사기 어댑터를 연결합니다. 주사기 어댑터 토출 호스의 일단을 부착하고 완충 용액 용기에 호스의 타 단부를 배치했다. 완전히 주사기의 플런저를 확장 할 수 있습니다. </li><li> 유체 셀 호스 어댑터에 호스를 연결합니다. 유체가 완전히 중심 챔버를 채울 때까지 부드럽게 플런저를 누릅니다. 기포가없는 보장하기 위해 셀을 확인합니다. 현미경에 유체 셀에서 쏟아져에는 유체가없는 확인하십시오. 제기 고체 지지체에 주사기를 놓습니다. </li><li> 화면의 레이저 (확산 빨간 점)을 찾기 위해 카메라 공급 및 X / Y 번역 노브를 사용합니다. 레이저 movem 사용엔트 컨트롤 노브는 팁에 레이저를 이동합니다. </li><li> (- 6 값 = 4) 현미경에 표시 합 신호가 최대가 될 때까지 미세 레이저 및 미러 컨트롤을 조정합니다. </li><li> (± 0.1) 가능한 제로에 가깝도록 현미경에 표시 수직 및 수평 편향을 낮출 좌측 후방 측면에 노브와 주사 헤드의 상단 왼쪽 사분면을 사용 다이오드의 각도를 조정한다. </li><li> 소프트웨어에서 취득 옵션을 선택합니다. 최소 선택 높이 (추적 및 트레이스), 최대 힘의 오류 및 변형에서. 다른 옵션은 사용자 종속적이며 실험가가 원하는 특정 정보에 기초하여 맞추어 질 수있다. </li><li> 각 획득 창에서 RT 비행기 맞추기위한 &quot;라인&quot;을 선택합니다. 높이 창에서 OT 평면 맞추기위한 &quot;없음&quot;을 선택합니다. 아직 수행되지 않은 경우 X 및 Y는 0으로 오프셋 및 주사 각도를 설정한다. </li><li> 1 Hz에서, 256 라인 당 샘플, ScanAsyst 자동 제어에 스캔 속도를 설정개인, Off로 ScanAsyst 자동 Z 한계. 500 nm의 Z 제한을 변경합니다. 1 μm의 스캔 크기를 설정합니다. </li><li> 참여를 클릭합니다. 이 시점에서, 팁 표면에 접근한다. 선단이 접근되는 동안 화면의 좌측 하단에 Z 압전 전압 변화를 관찰한다. 팁이 범위를 벗어날 경우, 팁 재 접근을 철회. 이것이 실패 할 경우, 팁은 성공적인 접근을 위해 변경 될 필요가있다. 끝이 종사되면, 라인은 이미지를 구성 할 것이다 취득 각 창에 표시하기 시작합니다. </li><li> 1 × 1 μm의에서 운모의 이미지를 가지고 운모 표면이 깨끗하고 평평한 지 확인하기 위해 천천히 확대합니다. 그들이 나타나는 이미지를 저장하기 위해 연속 캡처를 클릭합니다. 확대하고 필요에 따라 표면을 이동. </li></ol> (4) 단백질 증착 및 이미지에 대한 샘플의 준비 <ol><li> 정제 된 단백질 샘플 (38)을 확보하고 얼음에 보관하십시오. 냉동실에 저장하는 경우에 샘플을 해동5 분 동안 얼음. </li><li> / ㎖ 냉장 사용해서 촬상 완충액 0.0010 mg의 단백질을 희석. 여기에 사용되는 촬상 버퍼는 15 mM 트리스 - 염산 (pH가 8.0), 150 mM의 염화나트륨, 15 mM의 MgCl2를이다. </li><li> 4 챔버 (100 × 15mm) 냉장 영상 완충 용액과 페트리 접시를 채 웁니다. 용액의 적어도 5 ㎖로 각 챔버를 입력합니다. 부드럽게 micropipettor 부착 팁 희석 된 단백질 용액을 혼합한다. </li><li> 이미 준비 운모의 표면에 희석 된 단백질 용액 200 μl를 적용합니다. 30 초 후, 원형 핀셋 (디스크 그리퍼)와 단백질 / 운모 표면을 픽업. 실험실 벤치에 샘플 병렬를 잡습니다. </li><li> 샘플 채 시료가 페트리 접시의 분지에 평행 한 것을 보장하면서, 즉시 페트리 접시 (단계 4.2)의 제 1 사분면에 포함 된 완충 용액에서 샘플을 담가. 1 초 후, 샘플을 제거합니다. </li><li> 분지에 샘플 평행을 유지하도록 계속페트리 접시에, 나머지 세 사분면에 대한 4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 여분의 수분을 흡수하고, 현미경의 무대에 디스크를 전송하는 마른 먼지 천에 디스크를 넣습니다. 천으로 실제 표면을 만지지 마십시오. 샘플이 건조하지 않도록하십시오. </li><li> 3.16 - 반복 3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 운모에 5 이미징 단백질 <ol><li> 화면의 왼쪽에있는 체크 박스 파라미터 클릭. 스프링 크기 및 팁 반경은 팁이 사용에 기초하여 설정한다. </li><li> 참여를 클릭합니다. 마찬가지로 운모 촬상 처리 (단계 3.17)에, 선단 접근을 Z-피에조 윈도우를 관찰한다. </li><li> 적어도 두 개의 연속적인 패스에 대한 이미지 스캐너에게 동일한 영역을 허용합니다. 수집 된 각각의 이미지를 저장하기 위해 연속 캡처를 클릭합니다. </li><li> 새로운 영역에 스캐너를 이동 및 / 또는 원하는대로 이미지 크기를 변경합니다. </li><li> 자동화 된 소프트웨어는 조정 완료 후스캔 파라미터들은 특정 이미지 사이즈, 소프트웨어를 해제. </li><li> 수동으로 미세 조정하기 위해 이미지의 초점을 스캔 속도, z는 한계, 행수, 및 전압을 조절한다. 이미지가 너무 초점이 될 경우, 원래의 시작 위치를 반환 다시 소프트웨어를 켭니다. 단백질을 확대하면서 화상의 해상도를 증가시키기 위하여, 주사 속도를 감소 비례 라인의 수를 증가시킨다. </li><li> 실험 후, 100 % 에탄올로 액체 셀을 청소하고 DI H 2 O. 씻어 액체 셀에 완전히 건조 허용합니다. </li><li> 원시 이미지 데이터를 처리하는 데이터 소프트웨어를 연다. 첫째, 패턴 화 된 아이콘을 클릭하여 이미지를 평평하게. 주문 번째 제로를 선택하고 실행을 클릭합니다. 이미지에 따라, 평면 맞는 적절한 평면 화상을 얻을 필요가있다. 이 경우, 평면 맞는 아이콘을 선택하고 커서를 이용하여 화상의 평탄한 영역의 평면을 그린다. 실행을 클릭합니다. 필요한만큼 반복 </li><li> 셀프요법 단면 탭 단백질의 치수를 측정한다. 커서를 라인 분석 할 수있는 분자 또는 지역에 이동립니다. 여러 영역에 대해 반복하고 소프트웨어 오버레이를 생성합니다. 그림 또는 다른 소프트웨어 프로그램에 대한 도면과 호환 형식으로 영상을 생성하는 데 사용되는 데이터를 내보낼. </li></ol>

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<li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li>
<li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li>
<li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li>
<li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToh%2C+KC+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22">Proc. Natl. Acad. Sci. U S A</a>. 107, 9170-9175 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , Schrodinger, LLC. Forthcoming.</li>
<li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome%2C+RpBphP3%2C+reveals+residues+that+modulate+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li>
<li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome%3A+photoconversion+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li>
<li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928(2011).</li>
<li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li>
<li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li>
</ol>

경쟁하는 재정적 이해관계나 이해 상충이 없습니다.

AFM은 생리 학적 조건에서 중요한 단백질 및 다른 생체 고분자를 충분히 촬상 할 수있는 주사 탐침 현미경 방법이다. X-선 결정학 및 NMR 비교하여, AFM의 한 가지 제한은 동일한 해상도, 특히 측 방향 해상도를 달성 할 수 없다는 점이다. 모든 표면에 분자를 분석하는 AFM을 이용하면 데이터를 분석 할 때, 분자의 이미지 표면의 영향과 프로브도 고려되어야한다. 획득 된 이미지 프로브의 영향 Deconvoluting 적절한 소프트웨어를 완료 할 수있다. 실험 결과를 비교하는 이론적 모델을 개발하는 것은 또한 매우 유용하다는 것을 증명할 수 있습니다. 본 논문에서는 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 AFM 이미지 (그림 3)되게됩니다. 현미경 조립체 및 소프트웨어 동작의 설명에 채용 된 특정 악기 모델에 고유하지만, 운모단백질 샘플 준비 절차는 일반적이며 어떠한 AFM 실험에 적용될 수있다. <p class="jov...

원자력 현미경 (AFM)은 1986 년 발명 (도 1) 이후 표면 박막 및 단일 분자의 구조 및 기계적 특성을 조사하기위한 매우 중요한 도구가되고있다. 1-3 액정 셀을 사용하여, 상기 방법은 보유 생리 학적으로 관련 환경에서 생체 고분자의 연구에도 살아있는 세포에 특히 유용해진다. AFM 전통적 접촉 모드 AFM 때문에, 부드러운 물질 또는 표면에 느슨하게 구속 분자 이미징에 사용되어 4-10 탭핑 모드 인해 일반적 부적합 횡력에 의한 피해에 캔틸레버하여 샘플에 가해진. 11 태핑 모드 AFM은 실질적으로 끝이 간헐적으로 표면을 만지지 가진보다는 일정한 접촉하는 이러한 힘을 감소시킨다. 이 모드에서는, 캔틸레버 또는 표면에 수직의 공진 주파수 근처에서 발진된다. 마찬가지로 AFM 모드를 연락하는 지형 항문이다XY (거리)의 함수로서 Z-피에조의 이동을 플롯하여 yzed. 캔틸레버 역학 또는 공진 근처에 매우 불안정 할 수 있습니다; 따라서, 그들은 &quot;정상 상태&quot;상황 밖에서 자동화 매우 도전적이다. 특히 이러한 역학 샘플 특성과 스캔 환경 모두에 따라 달라집니다. 하드 (어) 표면에 흡착 부드러운 분자를 들어, 분자 잘 조정 피드백 루프는 표면에 대한 피드백 진동의 원인이됩니다. 상기 작동 유체는 캔틸레버의 튜닝을 복잡. 온도 나 유체 수준의 변화는 세트 포인트, 이익, 및 기타 영상 매개 변수의 일정 재조정이 필요합니다. 이러한 조정은 매우 시간 소모적이고 누구나 도전을 경향이있다. 피크 포스 양적 나노 기계 속성 매핑 (PF-QNM)는, 모드 AFM을 눌러처럼 간헐적으로 샘플 (그림 2)에 연락하여 측면의 상호 작용을 방지 할 수 있습니다. 12-15 &lt;/ SUP&gt; 그러나, PF-QNM 비 공진 모드 및 태핑 모드 AFM보다 훨씬 낮은 주파수에서 작동합니다. 이것은 탭핑 모드 AFM, 유체의 존재에 의해 악화 특히 튜닝의 과제를 제거한다. PF-QNM을 선택하면 이미지가 접촉의 모든 지점에서 힘 응답 곡선을 복용에 의해 수집됩니다. ScanAsyst 소프트웨어의 추가로, 주사 파라미터 조정 (15)는 자동화 될 수 있고, 높은 해상도 이미지에도 경험이없는 사용자에 의해 분내에 수득. 사용자는 AFM에 익숙하게되면 자동화 된 파라미터의 일부 또는 전부는 수동으로 화질 미세 조정을 허용 실험가 언제든지 비활성화 될 수있다. 그 이래, PF-QNM이. submolecular 레벨 박테리오로돕신, 세포막 단백질 및 다른 천연 단백질을 매핑 적용된 박테리오로돕신 들어 16-18, 단백질 유연성 및 X-선 결정 학적 구조 사이에 직접적인 상관 관계가있다. 12 PF -qnM은 높은 해상도로 살아있는 세포 조사하기 위해 사용되었다. 세포의 무결성과 기능에 대 한 중요 한 적혈구 막 내 구조와 역학 사이 19, 20 또한, PF-QNM 데이터를 밝혀왔다 중요한 연결합니다. (21) 우리는 22 bacteriophytochromes (BphPs)라고 붉은 빛 감광체의 구조를 연구하기 위해 AFM (23)를 포함하여, 주 사형 프로브 현미경 (SPM)의 방법을 채용했다. 24,25 그들은 공유 시그널링 이펙터 모듈 등의보기에 연결된 광 검출 모듈로 구성 히스티딘 키나아제 (HK)로서. 26 광 감지 모듈은 일반적으로 구조 변화 시그널링 이펙터 모듈에 도달하고, 전체 단백질의 전체에 변형 선도의 시리즈, 광자의 흡수에 구조적 변형을 겪는다 bilin 발색단을 포함 . 이러한 변화를 바탕으로 24,27-29, 두 가지 광 흡수의가BphPs, 빨간색과 원적외선 광 흡수 상태 tates은 홍보 및 PFR로 표시. 홍보는 대부분의 BphPs에 대한 열 안정성, 어두운 적응 상태입니다. PR / PFR의 광 변환의 분자 기초가 완전히 때문에이 단백질의 제한 구조 지식을 이해하지 않습니다 28. D. 하나의 구조를 제외 radiodurans는, 이들 단백질의 번역 30 모두 X-선 결정 학적 구조가 어두운 상태에 적응하고 이펙터 도메인이 부족하다. 그대로 BphPs 효과적으로 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 연구하기에는 너무 크고 X-선 결정학을위한 (특히 광 적응 상태에서) 그들의 본래 형태로 결정화 악명 어렵다. BphPs은 최근 적외선 형광 단백질 마커로 설계되었다 (IFP의).이 단백질의 31 구조 특성이 적용 IFP 디자인 지원을 촉진 할 수 있습니다. 32-36 이 기사의 초점은하는 절차를 제시하는 것PF-QNM 통해 액체 셀 AFM을 이용 BphPs의 촬상. 방법은 광합성 세균에서 R. bacteriophytochrome의 RpBphP3 (P3)의 광 적응 상태의 연구에 의해 증명된다 palustris. 여기에 제시된 AFM 절차는 단백질의 이미징을위한 편리하고 간단한 방법뿐만 아니라 다른 생물학적 거대 분자이다. 이 방법으로, 개별 분자의 구조적인 세부 사항은 상위 과학 과정 실험실 세션 유사한 시간의 단기간에 수집 할 수있다. 단면을 측정하고 상기 차원 분석을 통해 완료, 실험 데이터는 유용한 계산 모델을 비교할 수있다. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>Nanoscope V 컨트롤러 및 J 스캐너</td></tr><tr><td>장착 프로브</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>태핑 모드 유체 셀</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>운모 V-4 등급</td><td>SPI 공급</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>샘플 지원 디스크</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로피펫터</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>인용된 참고 문헌에 따라 준비</td></tr><tr><td>나노스코프 소프트웨어</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments, Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM 디스크 그리퍼</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12mm</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>Pymol 분자 그래픽 시스템 v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

peakforce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

원자 힘 현미경 (AFM)의 표면의 힘에 응답을 프로빙 캔틸레버에 부착 피라미드 팁을 이용한다. 팁의 편향은 지형 화상으로 변환 될 수 레이저 및 섹터 탐지기에 의해 10 ~ PN 측정 할 수있다. 진폭 변조 또는 &quot;탭핑 모드&quot;는 AFM 이미지를 생성하기 위하여 그것의 공진 주파수로 진동하면서 표면 간헐적 접촉하는 프로브를 포함한다. 유체 세포와 함께 사용, 태핑 모드 AFM은 생리 학적으로 관련 조건에서 단백질과 같은 생물학적 거대 분자의 이미징을 할 수 있습니다. 태핑 모드 AFM 프로브와 경험이없는 사용자를 위해 도전 할 수있는 스캔 매개 변수의 다수의 빈번한 조정의 수동 튜닝이 필요합니다. 고품질 화상을 얻기 위해서는, 이러한 조정은 대부분의 시간을 소비한다. PeakForce 정량적 나노 기계 공간 매핑 (PF-QNM)가 힘을 측정함으로써 respon 이미지를 만들어샘플과 접촉의 모든 지점에 대한 자체 곡선. ScanAsyst 소프트웨어로, PF-QNM은 자동화 할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 자동으로 주어진 샘플에 대한 설정 점, 구동 주파수, 스캔 속도, 이익, 및 기타 중요한 검색 매개 변수를 조정합니다. 뿐만 아니라이 프로세스가 깨지기 탐침과 시료를 보호 않으며, 그것은 훨씬 높은 해상도의 이미지를 얻기 위해 필요한 시간을 감소시킨다. PF-QNM 유체의 AFM 이미징 호환; 따라서, 생물학적으로 중요한 물질을 이미징하는 광범위한 애플리케이션을 갖는다. 본 논문에서 제시하는 방법은 광합성 R.에서 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 이미지를 얻기 위해 PF-QNM의 응용 프로그램을 설명합니다 그 빛 적응 상태에서 palustris. 이 방법을 사용하여, 각각의 단백질의 이량 P3와 다이머의 응집체는 촬상 버퍼의 존재 운모 표면에 관찰되었다. 적절한 표면을 조정 및 / 또는 용액 농도,이 방법일반적으로 생물학적 관련 거대 분자와 부드러운 소재에 적용될 수있다.

그 빛 적응 상태에서 광 수용체 단백질, P3, 대표 AFM 이미지는 그림 3과 그림 4에 제시되어있다. 갓 죽습 운모 기판 (그림 3a는) 단백질 흡착에 적합한 평평한 표면입니다. 음성 대조군으로서 깨끗한 운모의 화상을 수집하는 것은 여러 가지 이유로 중요하다. 첫째, 액체 세포가 깨끗 보장 이전 실험에서 잔류 물질은 표면을 오염하지 않습니다. 둘째, 프로브의 품질을 테스트한다. 프로브가 더럽거나 변형 된 경우,이 줄무늬로 이미지에 표시 또는 노이즈로 자신을 선물 할 것이다. 마지막으로, 운모 깨끗한​​ 화상을 프로브 적절 미래 실험 조정될 수 확인한다. 단일 감광체 단백질 이량 체는 표면 커버리지 (도 3B, C) ​​적절한 경우 PeakForce QNM를 사용하여 관찰 될 수있다. 화살표는 개별적인 신호 다이머; 별표는 단백질 집합체를 의미한다.단백질 샘플, 증착 시간 및 영상 버...

이 논문에서는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 단백질 광수용체의 구조를 조사하는 방법을 설명합니다. PeakForce 정량적 나노기계적 특성 매핑(PF-QNM)은 운모 표면에서 손상되지 않은 단백질 이량체를 보여줍니다.

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 광수용체 단백질의 고해상도 이미지를 수집하는 것입니다. 이것은 먼저 광수용체의 샘플을 얻고 희석함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 단백질 샘플을 갓 절단하고 깨끗한 운모 표면에 약 30초 동안 적용하는 것입니다.그런 다음 MICA를 완충액으로 헹궈 결합되지 않고 느슨하게 부착된 분자를 제거합니다. 다음으로, 샘플은 적절한 프로브가 장착된 액체 셀에 부착됩니다. 이 어셈블리는 스캐너에 로드됩니다.액체 셀에 완충 용액을 채운 후 팁과 샘플을 결합하고 스캔을 시작합니다. 궁극적으로, 피크 힘을 통합한 원자력 현미경. 정량적 나노 기계적 특성 매핑은 샘플 표면에서 단일 광수용체 단백질의 이미지를 수집하는 데 사용됩니다.피크 포스 q와 m을 통합한 원자력 현미경은 생물학적으로 활성화된 거대분자의 기능을 결정하는 중요한 구조적 및 화학적 특성이 무엇인지와 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. NMR 및 X선 결정학과 같은 현재 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 생물학적으로 관련된 환경에서 온전한 단백질 및 기타 생물학적 거대분자의 고해상도 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 프로브와 솔루션을 조정하는 데 여러 단계가 필요하고 그 중 일부는 매우 복잡하기 때문에 어려움을 겪습니다.최대 하중 q 및 m과 자동화된 소프트웨어를 사용하면 이러한 단계 중 몇 가지가 더 간단해져서 새로운 사용자와 학부생이 프로세스를 훨씬 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 세 명의 학부생인 Marie Kroger, Blair Sorenson, Jessica Thomas입니다. 이 학생들은 다가오는 해에 미생물학, 화학 공학 및 화학 분야에서 대학원 과정을 밟을 것입니다.이러한 항목은 특정 순서로 켜져 있어야 합니다. 첫 번째는 컴퓨터, 그 다음은 컨트롤러, 마지막으로 광섬유 조명입니다. 현미경은 FM 및 LF fm을 읽어야 합니다.카메라는 소프트웨어의 FM 광학 헤드 중앙에 있어야 합니다. 다음을 선택해야 합니다. 실험 범주는 기계적 특성입니다.실험 그룹은 정량적 나노 기계 매핑이고 실험은 유체의 피크 힘 q 및 m입니다. 설정을 올바르게 선택하면 실험을 로드하고 설정할 수 있습니다. 카메라 초점은 먼저 Z 대물렌즈를 사용하여 설정한 다음 코스 컨트롤을 사용하여 스테이지를 배치해야 하며, 목표는 A FM 헤드 조리개를 스테이지 표면 1mm 앞에 배치하여 갓 절단된 운모로 샘플 디스크를 조작하는 것입니다.깨끗하게 청소된 부품에서 유체 셀을 조립하는 것으로 시작합니다. 먼저 호스 어댑터를 깨끗한 유체 셀의 포트에 연결합니다. 그런 다음 납작헤드 핀셋을 사용하여 매우 부드럽게 O-링을 유체 셀의 움푹 들어간 곳으로 누릅니다.다음으로 프로브 리테이너 클립에서 스프링을 가볍게 누르고 홈에서 멀어지게 합니다. 동일한 핀셋을 사용하여 프로브를 잡고 홈에 밀어 넣어 팁이 세포 중심을 향하도록 합니다. 그런 다음 클립을 사용하여 프로브를 고정합니다.다음 단계는 A FM.It 의 클램프가 완전히 접혀 있는지 확인하는 것입니다. 어셈블리를 아래쪽을 향하도록 하여 샘플 위에 놓습니다. 안정화를 위해 어셈블리를 A FM의 스터드에 맞춥니다.클램프를 내립니다. O-링을 검사하려면 O-링이 보일 때까지 현미경의 아래쪽 스위치를 누르십시오. 지지 디스크와 유체 셀 사이에서 단단히 압축되어야 합니다.유체 셀은 거친 조정 손잡이를 사용하여 초점을 맞출 수 있습니다. 그런 다음 XY 조정을 사용하여 프로브 팁에 초점을 맞춥니다. 그것은 금속 황금 삼각형처럼 보입니다.이제 아래쪽 pizo 레버를 사용하여 팁을 샘플 표면 가까이로 이동하고 팁, 반사에 대한 초점을 조정하고 이 반사와 관련하여 캔틸레버 위치를 모니터링합니다. 현재로서는 긴밀하게 정렬되어야 하지만 완전히 겹치지 않아야 합니다. 이제 주사기를 준비합니다.1ml의 버퍼 용액을 채우고 어댑터를 부착합니다. 그런 다음 주사기를 배출 호스에 부착하고 플런저를 완전히 확장합니다. 다음으로, 챔버를 채우기 위해 어댑터를 사용하여 호스를 유체 셀에 연결하고 챔버 중심이 가득 찰 때까지 플런저를 부드럽게 누릅니다.유체 셀에서 현미경으로 기포나 유출이 없어야 합니다. 그런 다음 챔버 위의 잘 지지된 위치에 주사기를 놓습니다. 그런 다음 카메라 피드와 XY 변환 노브를 사용합니다.화면에서 레이저를 찾으려면 확산 빨간색 점으로 나타나야 합니다. 찾으면 레이저 컨트롤을 사용하여 프로브로 이동합니다. 이제 마지막으로 현미경의 합 신호가 4에서 6 사이로 최대화될 때까지 레이저 및 미러 컨트롤을 조정하고 사분면 다이오드를 조정합니다.그런 다음 스캔 헤드의 손잡이를 사용하여 현미경의 값이 가능한 한 0에 가깝게 돌아갈 때까지 수직 및 수평 편향을 조정합니다. 계속하기 전에 적절한 획득 옵션을 선택해야 합니다. lines 창당 샘플에서 스캔 속도를 약 1 헤르츠로 설정합니다.256을 입력합니다. 스캔 지원 자동 제어용. 스캔 어시스트 자동 Z 제한에 대해 개별을 선택하고 끄기를 선택합니다.Z 한계는 500나노미터여야 하고 스캔 크기는 1미크론이어야 합니다. 설정이 올바르게 설정되면 프로브를 측정합니다. 프로브 팁이 표면에 접근함에 따라 Z pazo 전압 변화를 관찰합니다.팁이 범위를 벗어나 철회했다가 다시 접근하면 프로브 팁을 교체해야 할 수 있습니다. 이것이 작동하지 않으면 팁이 맞물렸을 때 각 획득 창에 선이 나타나야 하며 이러한 선은 이미지를 구성합니다. 운모의 이미지를 지속적으로 캡처하기 시작합니다.천천히 확대하여 MICA 표면이 평평하고 깨끗한지 확인합니다. 냉장 이미징 버퍼 용액이 있는 4개의 챔버 페트리 접시를 준비합니다. 각 챔버에는 최소 5밀리리터가 필요합니다.희석된 단백질의 분취액을 섭취하기 전에 마이크로 피펫으로 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 200마이크로리터의 분취액을 취하여 희석된 단백질을 MICA 표면에 적용합니다. 용액이 표면에 상주할 때까지 약 30초 동안 기다립니다.그런 다음 디스크 그리퍼를 사용하여 디스크를 기울이지 않고 들어 올리고 즉시 버퍼 용액의 첫 번째 풀에 담그십시오. 1초 동안 디스크가 벤치와 평행을 유지하는지 확인합니다. 헹굼 단계에서 샘플을 페트리 접시와 평행하게 유지하는 것이 매우 중요합니다.이 부드럽고 유연한 분자는 수용액의 강한 흐름에 의해 표면에서 왜곡될 수 있습니다. 다음으로, 풀당 1초 동안 다른 세 개의 풀 각각에 디스크를 잠시 담그십시오. 그런 다음 디스크를 건조하고 먼지가 없는 천에 옮깁니다.과도한 수분이 천으로 전달되도록 하되 디스크가 완전히 건조되지 않도록 하십시오. 천이 샘플에 닿지 않도록 하십시오.amp디스크 그리퍼가 있는 천에서 s를 조심스럽게 제거하고 s를 놓습니다.ample A FM 스캐너에 올려 놓습니다. 유체 셀을 샘플 위에 놓고 설정 및 이미징을 진행합니다.프로브에 대한 모든 매개변수가 끝나면 스프링 크기와 팁 반경이 올바르게 설정됩니다. 이미징할 때와 같이 프로브를 측정합니다. Micah, 끝이 표면에 접근할 때 ZP azo를 관찰하십시오.이미지를 촬영할 때 스캐너가 최소 두 번 연속 통과 동안 동일한 영역을 이미지화할 수 있도록 합니다. 연속 캡처를 사용하여 각 이미지를 저장합니다. 원하는 대로 이미지 크기와 위치를 조정합니다.자동화 소프트웨어가 특정 이미지 크기에 대한 스캔 매개변수 조정을 완료하면. 소프트웨어를 끄십시오. 이미지의 초점을 수동으로 조정하고 스캔 속도, Z 한계, 라인 수 및 설정점을 조정합니다.이미지의 초점이 너무 흐려지면 소프트웨어를 다시 켜서 원래 시작 위치로 돌아갑니다. 단백질을 확대하는 동안 스캔 속도를 줄이고 라인 수를 비례적으로 늘려 이미지의 해상도를 높입니다. 나중에. 이미지를 분석할 때 먼저 병합 아이콘을 클릭하여 이미지를 병합합니다.0번째 순서를 선택하고 작업을 실행합니다. 때로는 적절하게 평평한 이미지를 얻기 위해 일반 맞춤을 사용해야 합니다. plain fit 아이콘을 선택하고 커서를 사용하여 이미지의 평평한 영역 위에 평면을 그립니다.플레인 맞춤을 실행하고 필요에 따라 작업을 반복합니다. 다음으로, 단백질의 치수를 측정하기 위해 단면 탭을 선택합니다. 분석할 분자 또는 영역 위에 커서를 사용하여 선을 그립니다.여러 영역에서 이 프로세스를 반복합니다. 오버레이가 필요한 경우, 빛에 적응한 상태의 광수용체 단백질에 대해 FM을 사용하여 여러 생물학적 분자를 연구할 수 있으며, 갓 절단된 운모 기질은 단백질 흡수에 적합한 평평한 표면입니다. 단일 광수용체 단백질 이량체는 피크 포스 QNM 모드를 사용하여 관찰할 수 있었습니다.화살표는 개별 이량체를 가리키고 별표는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 단백질 응집체를 나타냅니다. 단백질의 단면은 이미지가 평탄화된 후에 측정될 수 있습니다. XY 데이터는 높이 측정과 상관관계가 있습니다.이는 다양한 계산에 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적으로 관련된 환경에서 표면의 단백질에 대한 고해상도 이미지를 수집하기 위해 A FM 실험을 설정할 수 있습니다. 피크 포스 q 및 m 사용일단 마스터하면 이 기술을 약 3-4시간 내에 수행할 수 있습니다.따라서 피크 힘 q 및 m은 기기 분석, 생화학 및 현대 물리학과 같은 실험실 과정에 등록한 학부생에게 소개하기에 적합한 원자력 현미경 형태입니다. 개발 후 이 방법은 스캐닝 프로브 현미경 검사 분야의 연구원들이 단백질, 핵산 및 생물학적으로 관련된 배지에서 살아있는 세포와 같은 생물학적 분자를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

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포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

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여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

배우세요 PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 광수용체 단백질의 고해상도 이미지를 수집하는 방법을. 이 기술은 구조 생물학 연구에서 단백질 이머의 구조적 무결성을 조사하는 데 활용됩니다.

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

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