Name: 히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응 정량화 방법을 통해 신경과학 및 행동생물학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 검정법은 촉수와 입 사이 거리 측정을 통해 먹이 행동을 정확히 분석할 수 있습니다.

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저자는 비디오 제작에 도움을 준 K. P. Madhu, Nita Beliappa 및 푸네에 있는 Indian Institute of Science Education and Research의 미디어 센터 직원에게 감사드립니다. 이 연구는 SG에 대한 인도 정부 생명공학부의 우수 센터 프로그램에 따른 자금 지원과 인도 정부 과학 기술부의 박사 후 연구원이 RK에 지원했습니다.

먹이 응답 1. 히드라 문화 및 측정 <ol><li> 에 포함 (1 mM 트리스 - 염산 완충액, pH를 7.6, 1 ㎜의 NaCl, 1 mM의 염화칼슘 2, 0.1 mM의 KCl을, 0.1 mM의 황산을) 아테 매일 그들을 먹이 매체를 유지하여 문화의 히드라 폴립을 유지 12 시간 빛-12 시간 어두운 사이클에서 18 ° C에서 유리 그릇은 이전 12 설명 된대로. </li><li> 급전 반응을 측정하기위한, 하나의 24- 웰 플레이트의 한 웰에 5-6 촉수를 갖는 히드라 폴립 성숙 옮긴다. 를 기울여 우물에서 잔류 매체를 제거하고 즉시 신선한 매체의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 히드라 매체에 9 μm의 글루타티온 솔루션을 준비합니다. 글루타티온 솔루션이 산화하는 경향이 있기 때문에, 항상 각 실험에 대한 새로 제조 된 글루타티온 솔루션을 사용합니다. </li><li> 화상 기록을위한 규정을 가지는 현미경의 이미징 플랫폼에 전송 플레이트. 행동 O 그 같은 어두운 배경을 사용하여F 히드라 폴립 명확하게 대비되는 배경 이미지를 만들 수 있습니다. </li><li> 방은 관찰하고 변동 강도, 공기 흐름 및 소음의 조명에서 히드라 무료의 동작을 이미징에 사용됩니다. 심지어 글루타티온의 부재 - 이러한 장애는 히드라 폴립은 촉수의 수축을 보여 발생할 수 있습니다. </li><li> 용종이 5 분 동안 휴식을 취할 수 있습니다. </li><li> 용종이 문제가 명확하게 영상화 할 수 있음을 잘 같은의 중심 지역을 따라 위치하고 있는지 확인합니다. 용종이 우물의 가장자리에있는 경우, 피펫을 사용하여 매체를 세척하여 센터로 가져가 다시 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 편안한 상태에서 히드라의 이미지를 캡처합니다. 이것은 제로 시점 관찰 될 것입니다. </li><li> 신속 웰에서 3 μM의 최종 농도에 도달하는 9 μM 글루타치온 용액을 첨가. 히드라로 나타낸 실험과 응답의 목적에 따라, 글루타티온 및 츄 상이한 농도의 범위를 테스트필요한 적절한 농도를 SE는. </li><li> 바로 4 ~ 5 분 동안 모든 15 ~ 30 초 후 글루타티온 솔루션과 캡처 이미지를 추가 한 후 타이머를 시작합니다. 시간 경과 이미징 동안 배율 설정을 변경하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 웰에 동물의 위치가 최소 현미경의 시야에 방해 될 것 같은 균일 한 흐름 글루타티온 용액을 추가한다. 용종 글루타티온 용액을 첨가 한 후에 광범위하게 이동하는 경우, 이미지 캡쳐를위한 시야에 폴립을 가지고 매우 부드럽게 플레이트를 이동. </li><li> 대조 실험에서, 동일한 모든 다른 파라미터를 유지하면서 매체 글루타티온 결여 사용. </li><li> 오후 1시 전에 먹이 반응의 정도에 일주기 리듬의 가능한 효과를 방지하기 - 오늘의 상반기 위의 실험 단계를 모두 수행해야합니다. </li><li> GNU 이미지 조작 프로그램 (GIMP)를 사용하여 촬영 된 이미지의 각을 엽니 다. </li> 촉수와 hypostome 각각의 정점 끝 사이의 거리를 결정하기 위해 측정&gt; 메뉴&gt; 도구에서 사용할 수있는 "측정"도구를 사용합니다. 입 개구가 이미지 중 관찰되는 경우, 개방 입의 중심과 정점 촉수의 단부 사이의 거리를 결정한다. 촉수 확산 등이 거리를 참조하십시오. <li> 이전과 글루타티온 노출 후 각 용종의 평균 촉수 확산을 계산합니다. 이후의 시간 포인트에 각각 것과 제로 시점에서 평균 촉수 확산의 비율을 계산한다. 이 비율은 상대적 촉수 확산 호출됩니다. </li><li> 적어도 20 폴립에 대한 측정을 반복합니다. </li></ol><img alt="식 (1)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="수학 식 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. 방법 유효성 검사를 사용하여기아 모델 <ol><li> 기아의 경우, 별도의 유리 그릇에 몇 히드라 폴립을 전송하고 5 일간을 공급하지 않습니다. 비슷한 크기의 그릇에 아테 매일 몇 폴립의 제어 그룹을 피드. 두 실험이 매체에 곰팡이 성장을 방지하기 위해 매일 그릇에서 매체를 변경합니다. </li><li> 실험 날에, 1 시간 동안 아테로 히드라의 대조군을 먹이고 매체로부터 모두 먹지 죽은 아테을 제거한 후 다음의 실험에 대해 이러한 히드라를 사용한다. </li><li> 인해 관찰 시간에 치우침을 방지하기 위해 이전의 단계 1에 기재된 방법에 의해 대조군 히드라 비해 공복 히드라의 공급 응답을 측정 결핍의 각각의 측정을 교번 및 히드라 폴립을 제어한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

히드라의 동작을 먹이하면 후생 동물에서 가장 조상의 화학 감각 시스템 중 하나를 나타냅니다. 자포를 이용한 먹이 캡처 이후에 출시 된 갑각류 유체에서 GSH의 존재는 오래 전 일을 발견했지만, GSHR 단백질이나 추정 인코딩 유전자 / S도는 히드라에서 최신 특징으로하고있다. 몇몇 시도 GSH가 히드라 8, 14, 15에 결합 단백질을 특성화하기 위해 이루어지고있다. 그러나, 이러한 추정되는 수용체 단백질의 ID는 급전 반응에 기여할 가능성이 불분명하고 거의 다른 분자 성분은,보고 된 남아 날짜 (16), (17). 동물의 왕국에서 유일하게 특성화 GSHR 금붕어 (18)에서이다. 이러한 포로를 제공 할 수있는 GPCR 신호 캐스케이드의 다양한 단백질의 억제제뿐만 아니라 첨단 분자 생물학적 기술 (RNAi를 매개 유전자 침묵 (gene silencing) 및 CRISPR-Cas9 매개 게놈 편집)를 사용하여 클래식 기법,히드라에 캐스케이드 신호 GS...

히드라는 먹이를 잡기 위해 환원된 글루타티온(GSH)을 감지하는 신경계와 화학 감각을 가진 가장 원시적인 유기체입니다1. 선충, 갑각류, 곤충 유충, 올챙이 및 새로 부화한 물고기와 같은 다양한 동물을 먹습니다1. 이러한 피식자 유기체의 이동은 히드라의 선충(nematocyst)이라고 불리는 쏘는 캡슐의 기계감각 방전을 유발하며, 이 캡슐은 피식자2에 삽입된다. 부상당한 먹이에서 방출된 액체에 존재하는 GSH는 이후에 촉수를 말리고 먹이를 입 쪽으로 끌어올리고, 입을 벌리고, 결과적으로 먹이를 삼키는 것을 포함하는 히드라의 섭식 반응을 활성화합니다. 도파민3, 글루타메이트4, GABA, 글리신5, NMDA 수용체6 및 알라토트로핀7과 같은 여러 분자가 히드라의 섭식 반응에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한 GSH에 의해 유도된 화학감각 반응은 굶주린 히드라가 향상된 섭식 반응을 나타내도록 동물의 섭식 상태에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다1. GSH 민감도의 이러한 증가는 굶주린 상태에서 히드라가 더 높은 민감도에서 먹이를 찾아야 하기 때문에 생물학적으로 관련이 있습니다. 
GSH에 의해 유도된 공급 반응은 현미경으로 명확하게 관찰할 수 있지만 공급 반응 관찰을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 비정량적입니다. 대부분의 경우, 히드라의 입이 열려 있는 시간은 섭식 반응의 척도로 간주되었습니다8,9; 반면, 다른 경우에서는 정량화가 섭식 반응10을 보이는 개체군 중 히드라의 수를 기반으로 했습니다. 그러나 히드라 폴립의 입 열림 시간을 관찰하는 것은 번거롭고 관찰 중 입 방향과 같은 제어할 수 없는 매개변수에 의해 유발되는 변동의 영향을 받을 수 있습니다. 마찬가지로, 섭식 반응은 정량적 매개변수이기 때문에 개체군 기반 접근 방식은 개별 관찰자의 의견 또는 관찰 편향으로 인한 변동/오류의 영향을 받습니다. 이러한 문제를 피하기 위해 우리는 히드라 폴립의 입에서 촉수의 정점 끝까지의 거리를 기반으로 히드라(Hydra vulgaris Ind-Pune11)의 섭식 반응을 상대적으로 정량화하는 방법을 개발했습니다.

<table><tbody><tr><td>냉각 인큐베이터</td><td>파나소닉&nbsp;</td><td>MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경용 카메라</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>저감 글루타치온</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>4°C</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>에서 보관</tbody></table>

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

히드라는 먹이를 잡기 위해 감소된 글루타티온(GSH)을 감지하는 신경계와 화학 감각을 가진 가장 원시적인 유기체 중 하나입니다. 먹이 유기체의 움직임은 히드라의 선충(nematocyst)이라고 하는 쏘는 세포의 기계 감각 방전을 일으켜 먹이에 삽입됩니다. 먹이를 입 쪽으로 데려오기 위해 촉수를 말리고, 입을 벌리고, 결과적으로 먹이를 삼키는 것을 포함하는 히드라의 먹이 반응은 부상당한 먹이에서 방출된 액체에 존재하는 GSH에 의해 유발됩니다. 현재까지 알려지지 않은 히드라에서 섭식 반응의 분자 메커니즘을 확인할 수 있으려면 섭식 반응을 측정하기 위한 분석을 확립해야 합니다. 여기에서는 촉수의 정점 끝과 히드라의 입 사이의 거리를 측정하고 GSH 첨가 전후의 거리의 비율을 결정하는 섭식 반응의 정량화를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 상대적 촉수 퍼짐(relative tentacle spread)이라고 불리는 이 비율은 섭식 반응을 측정하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 분석은 굶주린 히드라가 매일 먹이를 주는 히드라에 비해 향상된 섭식 반응을 보이는 기아 모델을 사용하여 검증되었습니다.

글루타티온은 히드라가 먹이를 집어 삼키고의 목적을 위해 입으로 촉수의 컬링을 전시됩니다. 촉수의 이러한 컬링 가까이 hypostome에 촉수의 혀끝의 끝을 제공합니다. 이것은 촉수 확산의 감소, 또는 촉수와 hypostome (도 1)의 말단 치근단 간의 직선 거리 초래한다. 상대 촉수 확산 또는 평균 촉수의 비율은 이전에 확산 및 글루타티온을 추가 한 후, 시간이 지남에 따라 감소 여러 폴립 걸쳐 평균화. 상대 촉수 확산 글루타티온 결핍 배지 첨가 후, 단, 일시적으로 감소시키고 약 분 (도 2)의 단위 값을 달성한다. 기아 글루타티온 1,13 의해 유도 급전 동작의 향상을 일으키는 것으로 알려져있다. 여기에 설명 된 급전 동작의 측정 방법은 기아 모델에 의해 확인되었다. 추가 글루타티온이 significantl 후 촉수는 1 분 확산y를 만족 시키게 그룹 (P = 1 X 등분 두 꼬리 t 테스트를 적용하여 10 -16)...

여기에서는 글루타티온의 환원된 형태에 의해 유도된 히드라의 섭식 반응을 정량화하기 위한 간단한 분석을 설명합니다. 이 분석은 촉수의 정점 끝과 히드라의 입 사이의 거리를 측정하는 데 의존합니다.

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

이 비디오에서는 Hydra의 섭식 행동을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 글루타티온의 감소된 형태에 대한 반응으로 히드라는 다양한 동물, 선충류, 갑각류 및 갓 부화한 물고기를 먹습니다. 이 두 개의 세포층을 이룬 동물의 바깥층에는 선충(nematocyst)이라고 불리는 특수한 세포가 있습니다.선충에는 방아쇠가 있는데, 이 방아쇠는 주변 유체에서 먹이의 움직임에 의해 활성화될 때 끈을 묶는 실의 방전을 유발합니다. 쏘는 실이 먹이에 삽입됩니다. 다친 먹이는 대포도당을 방출합니다.이온 하이드로는 주변 액체에서 글루타티온을 검출하는 화학 감각을 가지고 있습니다. 이것은 신경계와 관련된 섭식 행동을 유발합니다. 히드라의 먹이 행동에는 촉수를 말리는 것, 먹이를 하이퍼스코프 쪽으로 데려오기, 입을 벌리고 먹이를 삼키는 것이 포함됩니다.사실, 주변에 과잉 이온을 추가하면 먹이가 없는 경우에도 히드라에서 섭식 반응을 일으킵니다. 화학 감각과 신경계의 상호 작용을 이해하려면 행동을 양자화하고 정확하고 신뢰할 수 있는 측정을 만들어야 합니다. 몇 가지 초기 보고서에서는 입이 수력 호흡이 열려 있는 시간을 섭식 반응의 척도로 간주하지만, 수력 폴립에서 입이 열리는 시간을 관찰하는 것은 지루하며 관찰로 인한 입의 방향과 같은 제어할 수 없는 매개변수에 의해 유도되는 변동의 영향을 받습니다.행동을 정량화하는 또 다른 방법은 섭식 반응을 보여주는 개체군의 히드라 수를 기반으로 하는 것입니다. 그러나 섭식 반응은 개별적인 정량적 매개변수이기 때문에 개체군 기반 접근 방식은 개별 관찰자의 의견에 의해 발생하는 주관적인 변동입니다. 여기에서 설명하는 대체 방법의 주요 장점은 실행이 매우 쉽고 재현성이 높다는 것입니다.히드라를 12시간 조명 아래에서 섭씨 18도로 유지하십시오.매체에서 12시간 암흑 주기를 유리 그릇에 담고 섭식 반응을 측정하기 위해 매일 EMIA를 공급합니다. 하나의 성숙한 하이드로 폴립을 24웰 플레이트의 웰로 옮기고 피벗을 사용하여 웰에서 잔류 매체를 제거합니다.이것은 플레이트를 기울이고 여분의 매체를 버린 다음 즉시 500 마이크로 리터의 새로운 배지를 추가함으로써 촉진됩니다.글루타티온 용액 준비. 글루타티온의 9마이크로몰 용액은 수력 매체를 사용하여 준비됩니다. 글루타티온 용액은 산화되기 쉬우므로 항상 갓 준비한 글루타티온 용액을 사용하십시오.각 실험에 대해 플레이트를 현미경의 이미징 플랫폼으로 옮깁니다. 이미지 기록을 위한 준비는 대조되는 배경에 대해 수력 용종의 거동을 명확하게 이미지화할 수 있도록 어두운 배경을 사용합니다. 폴립이 웰의 중앙 부분을 따라 위치하는지 확인하고, 편안한 상태의 히드라 이미지를 캡처했습니다.이것은 0 시점 관찰이 될 것입니다. 9 마이크로 몰 글루타티온 용액을 빠르게 첨가하여 3 마이크로 몰의 최종 농도에 도달합니다. 글루타치온 용액을 첨가한 직후 타이머를 시작하고 배율 설정을 변경하지 않고 4-5분 동안 15초 또는 30초마다 이미지를 캡처합니다.측정을 위해 gim 버전 2인 gim을 사용합니다. GNU 이미지 조작 프로그램은 인터넷에서 무료로 다운로드할 수 있는 소프트웨어입니다. 캡처된 각 이미지를 gim에서 엽니다.이 프로그램에는 메뉴 도구에서 사용할 수 있는 측정 도구가 있습니다. 각 촉수의 고관절, 장루, 정점 끝 사이의 거리를 이 도구를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 거리를 촉수 퍼짐이라고 합니다.글루타티온 전후의 각 용종에 대한 평균 촉수 퍼짐을 계산합니다. 0 시간에서 평균 촉수 퍼짐의 비율을 계산합니다. 이후의 각 시점을 가리킵니다.이 상대적인 촉수 스프레드라고 부르겠습니다. 기아를 위해 최소 20개의 폴립에 대해 이러한 측정을 수행합니다. 하이드로 폴립 몇 개를 별도의 유리 그릇에 옮기고 5일 동안 먹이지 마십시오.실험 당일에 대조군 폴립에 매일 artia를 공급합니다. 히드라의 대조군에 1R에 대한 artia를 공급하고 이 히드라를 후속 실험에 사용합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 방법으로 대조군의 히드라와 비교하여 굶주린 히드라의 섭식 반응을 측정하여 교대 시간으로 인한 편향을 피하기 위해 굶주린 수종 용종과 통제된 수력 용종 각각의 측정을 수행합니다.글루타티온은 히드라가 촉수를 입 쪽으로 말리게 합니다. 이러한 말림은 촉수의 정점 끝을 하이포 스톰에 더 가깝게 만듭니다. 그 결과 촉수의 정점 끝과 하이퍼 스톰 또는 촉수 확산 사이의 선형 거리가 감소합니다.상대적인 촉수는 매체를 추가한 후 퍼졌습니다. 글루타치온이 부족하면 일시적으로만 감소합니다. 약 1분 안에 1로 다시 튀어 오릅니다.굶주림은 글루타티온에 의해 유발되는 섭식 행동을 향상시키는 것으로 알려져 있습니다. 글루타티온을 첨가한 후 1분 후에 퍼진 촉수는 포만감을 느낀 그룹에 비해 직원 그룹에서 유의하게 낮았습니다. 모든 동물은 음식을 감지하기 위해 화학 감각을 사용합니다.히드라는 다친 먹이에서 방출되는 글루타티온 형태의 화학 신호를 사용하며, 뇌와 같은 구조가 없는 단순한 신경계를 가지고 있기 때문에 화학감각의 분자 메커니즘과 섭식 상태에 따른 조절도 단순할 가능성이 높습니다. 이 메커니즘을 이해하면 고등 동물의 사료 섭취 규정의 진화에 대한 실마리를 얻을 수 있습니다. 그러나, glutathione를 결합할 수 있는 수용체나 downstream 신호 연쇄 반응의 다른 어떤 분대도 현재까지 Hida에서 보고되지 않았다.일반적인 화학요법의 약리학적 억제제, 감각 신호 경로, 그리고 이러한 신호 전달 단백질과 글루타티온 수용체의 발현을 변화시키기 위한 첨단 분자 생물학 기술의 사용은 영양의 분자 메커니즘을 이해하는 데 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그러나 Hydra에서는 이러한 실험적 조사로 인한 변화의 정도를 이해하기 위해 변화된 섭식 행동에 대한 신뢰할 수 있는 측정이 필요합니다. 여기에서는 신뢰할 수 있을 뿐만 아니라 수행하기 쉽고 재현성이 높은 방법을 제시했습니다.

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Microglia를 대리 바이오센서로 사용하여 뉴런에서 나노입자 유도 독성 측정

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

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colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다.

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산화된 글루타치온과 환원된 형태의 글루타치온(각각 GSSG 및 GSH)의 정량화는 오르토프탈알데히드(OPA)를 사용하여 달성되었습니다. OPA는 GSH에 접합되면 고농도 형광성이 되지만 감소될 때까지 GSSG를 접합할 수 없습니다. 여기에서는 정규화를 위해 단백질 정량을 사용하여 두 가지를 모두 정량화하는 다중 파라메트릭 분석에 대해 설명합니다.

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타임랩스 영상을 이용해 히드라 구형의 완전한 재생 과정을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜은 히드라 구형 생성을 설명하고, 다양한 장착 전략을 논의하며, 회전 디스크 공초점 현미경과 광판 형광 현미경을 이용한 장기 실시간 영상 수행 방법을 상세히 설명합니다.

재생 중인 히드라 구형의 준비 및 실시간 영상 촬영

학습하세요 히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응 정량화 방법을 통해 신경과학 및 행동생물학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 검정법은 촉수와 입 사이 거리 측정을 통해 먹이 행동을 정확히 분석할 수 있습니다.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

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