생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

이 절차의 전반적인 목표는 희소돌기아교세포 전구체 세포 또는 OPC를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과도하게 발현하는 것입니다. CNS Myelination Nation의 체외 연구의 경우, 이는 먼저 렌티바이러스 벡터를 클로닝하여 수행됩니다. 다음 단계는 렌티바이러스를 생성하고 실험을 위한 최적의 바이러스 농도를 결정하는 것입니다.

그 후, 절개 및 배양된 OPC를 렌티바이러스로 형질도입합니다. 마지막 단계는 DRG에서 절개된 배양된 뉴런에 형질도입된 OPC를 시딩하는 것입니다. 궁극적으로, 수초화 공동 배양은 웨스턴 블롯 분석을 통해 수초화 단백질 발현을 평가하고 면역 염색에 의한 수초화된 축삭 분절의 형성을 시각화합니다.

약리학적 도구와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 렌티바이러스 접근법을 통해 원하는 세포 유형에서 야생형 또는 돌연변이 단백질을 선택적으로 과발현할 수 있다는 것입니다(예: 이 경우, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 준비하면서 transfection 당일 아침에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 2K 7개의 lent 벡터를 클론화하고, 25ml의 배지를 포함하는 T 1 75 플라스크에 3,200만 개의 HEK 2 93 T 세포를 준비합니다. 결정적으로, 이러한 세포는 transfection 전에 고정되어야 하므로 필요한 경우 더 빨리 플레이트를 부착해야 합니다. 50ml Falcon 튜브에서 표 1에 자세히 설명된 대로 T 1 75 플라스크 형질 주입을 위한 마스터 믹스를 준비하고, DNA를 DMEM 와류를 가열하기 위해 추가한 다음, 조기 침전을 방지하기 위해 마지막으로 멸균 PEI를 추가합니다.

튜브를 서너 번 뒤집어 잘 섞은 다음 벤치에서 약 15분 동안 혼합물을 배양합니다. 세포의 배지를 변경한 다음 transfection 혼합물을 추가합니다. DROPWISE는 배지를 세포 위에 부드럽게 혼합한 다음 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날. GFP 발현은 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다. 형질주입 48시간 후, 바이러스 상등액의 첫 번째 배치를 수집하고 세포에 25ml의 신선한 배지를 추가합니다.

바이러스 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 140Gs에서 원심분리합니다. 세포 파편 펠릿이 없는 바이러스 상등액을 새 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음 날 transfection 후 72시간 후에 바이러스 상층액 원심분리기의 마지막 배치를 수집하여 세포 파편을 제거하고 세척된 바이러스 상층액의 첫 번째 배치로 풀링합니다.

다음 170, 90 분 동안 000 GS에 바이러스성 상등액을 매우 원심분리해서 바이러스를 집중시키십시오. 섭씨 4도에서. 울트라 원심분리기를 내리고 상층액을 부어 침전된 PEI와 30ml 튜브 바닥에서 볼 수 없는 바이러스의 입천장을 남깁니다.

이 과정을 반복합니다. 동일한 30 밀리리터 튜브에 모든 바이러스 상층을 배치로 원심분리하여 바이러스를 농축하여 각 초원심분리기 튜브에 바이러스를 재현탁시킵니다. 500마이크로리터의 Sato 매체를 넣고 튜브를 필름으로 덮습니다.

그런 다음 튜브를 30초 동안 소용돌이치고 피펫 팁으로 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 이 와류 제거 주기를 약 6회 반복하여 펠릿이 Sato 매체에 완전히 부유하도록 합니다. 이제 Sato에 재부유한 모든 바이러스를 새 마이크로 튜브에 모으십시오.

1분 동안 최대 속도로 웅덩이가 된 상등액을 짧게 회전시킵니다. PEI를 펠릿화하려면 바이러스가 포함된 상층액을 수집하고 주사기를 사용하여 용액을 0.45미크론 필터에 통과시켜 마무리합니다. 세디아에서 정제된 바이러스를 2050 및 100마이크로리터 부피로 분취하고 모두 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

이 프로토콜의 경우 1차 희소돌기아교세포 전구세포가 있어야 합니다. 10cm 플레이트에서 10ml의 세디아로 배양된 OPC는 C-N-T-F-P-D-G-F-N NT 3 성장 인자를 함유하고, 세포에 대해 8%의 이산화탄소 하에서 24시간 동안 배양되어야 합니다. 미디어를 흡인하는 것으로 시작하여 완전히 제거하십시오.

그런 다음 성장 인자와 동일한 매체 10 밀리리터로 교체하십시오. OPC를 렌티바이러스로 감염시키고, 필요한 양의 바이러스를 배지에 적방울로 첨가하여 관심 단백질을 발현합니다. 또한 별도의 OPC 플레이트에서 GFP만 발현하는 대조군 렌티바이러스를 배지 배양액에 혼합하고 세포를 48시간 더 혼합합니다.

그런 다음 플레이트에서 OPC를 수집하여 배양된 GRG 뉴런에 파종합니다. 먼저 각 플레이트에 8ml의 EBSS를 두 번 헹굽니다. 1ml의 트립신 EDTA 0.05%를 9ml의 따뜻한 EBSS로 구성합니다.

각 플레이트에 희석된 트립신 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 최대 2분 동안 배양합니다. EBSS에 30%FBS의 5 밀리리터를 추가해서 트립신을 중화하십시오.

그런 다음 10 밀리리터 피펫을 사용합니다. 플레이트 표면에서 OPC를 세척합니다. 모든 세포를 수집하기 위해 매번 플레이트를 1/4 바퀴씩 돌립니다.

세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 180 Gs.Now에 15 분 동안 실내 온도에 세포를 원심분리기 상층액 및 소생액을 흡인하십시오. 성장 인자가없는 따뜻한 saddo 배지의 밀리리터에 세포 펠릿을 현탁시키고 세포를 계수합니다.

다음으로, 플레이트에서 배지를 완전히 흡인하여 22mm 커버 슬립에서 배양된 DRG 뉴런을 준비합니다. 그런 다음 부드럽게 200, 000 OPC를 각 커버 슬립에 떨어뜨립니다. 파종 부피는 커버 슬립당 200마이크로리터 미만이어야 합니다.

플레이트를 움직이지 않고 세포가 가라앉도록 합니다 10분 후 각 웰 위에 따뜻한 오메드 1밀리리터를 얹습니다. 이제 나머지 자매 OPC를 다시 재생합니다. 성장 인자를 함유하고 있는 s omed를 사용하면 나중에 관심 단백질의 발현을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

세포외 신호와 관련된 키나아제(kinase)에 태그가 지정된 플래그. 하나의 작제물은 렌티바이러스 생산 제한에 사용되었고, 효소는 포장 작제물을 검증하기 위해 사용되었고, 보조 작제물은 OPC에 사용할 최적의 바이러스 희석을 결정하기 위해 사용되었다. IR one 렌티바이러스는 HEK 2 93 T 세포에서 HEK 2 93 T 세포에 대한 바이러스 희석 범위에서 적정되었습니다.

관심 유전자의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 다음으로, 형질전환 유전자 발현을 보장하기 위해 정제된 OPC를 감염시키고 최소 2일 동안 배양했습니다. FLAG 및 GFP 수준은 자매 OPC에서 확인되었습니다.

그런 다음 OPC를 DRG 뉴런에 안착시켰습니다. 그런 다음 OPC는 희소돌기아교세포로 분화했고, 서양인에 의해 평가된 바와 같이 미엘린 단백질을 발현하기 시작했습니다. MBP 염색으로 시각화된 일부 성숙한 희소돌기아교세포는 축삭돌기아교 밀도가 고려되었는지 확인하기 위해 뉴로필라멘트 또는 베타 3 튜불린으로 염색했습니다.

수초화 수준을 분석할 때 OPC를 시드한 후에는 배양하는 것이 중요합니다. 자매 APC. 이런 식으로, 관심 단백질 또는 관심 단백질의 태그, 해당 발현은 공동 배양에서 확인할 수 없는 경우 자매 APC에서 확인할 수 있습니다.