Name: 생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 중추신경계 수초화 연구를 위한 렌티바이러스를 이용한 희소돌기아교세포 전구체 세포의 형질도입 방법입니다. 이 기술은 단백질 과발현을 통해 수초화 과정을 선택적으로 분석할 수 있게 합니다.

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이 작업은 호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회(NHMRC 펠로우십 #454330 to JX, 프로젝트 보조금 #628761 SM에, APP1058647 to JX), 다발성 경화증 연구 호주(MSRA #12070 to JX), 멜버른 대학교 연구 보조금 지원 제도 및 멜버른 연구 CI 펠로우십 JX에 대한 멜버른 연구 CI 펠로우십, HP 및 AF에 대한 호주 대학원 장학금의 지원을 받았습니다. 우리는 의 운영 인프라 계획에 감사드립니다. 호주 빅토리아 혁신, 산업 및 지역 개발부.

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</ol>

저자는 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

축삭의 수초는 척추 동물의 중추 및 말초 신경계 양쪽의 최적의 기능을위한 중요한 과정이다. 유수 축삭의 생성 및 유지 보수와 세포 외 기질 단백질 (슈반 세포 나 희소 돌기 아교 세포)에서 분자 신경 세포 사이의 상호 작용, 아교를 포함하는 복잡하고 조정하는 과정입니다. 이 프로토콜의 의미 및 적용은 혼합 공 배양 설정 내의 하나의 특정 세포 유형에서 단백질의 조작을 허용한다는 것이다. 여러 세포 유형은 특정한 단백질의 활성을 차단하는 무딘 약리학 도구를 사용하여 생체 내 및 시험 관내 수초 분석에서 양쪽 수초에 관여 또는 신호 전달 경로 단백질은 하나의 연결에서 수초에 가하는 것을 영향에 대한 특정 정보를 제공 할 수없는 또는 신경교 관점 단백질 고유 한 세포 유형에 의해 발현되지 않는. 따라서, 시험 관내 수초로서oligodendroglial 단백질이 수초에 발휘하는 효과를 심문 할 수있게 해준다 구체적으로 OPC를 형질 도입하는 렌티 바이러스의 사용과 함께 말한다. 우리는 ...

축삭 수초는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 활동 전위의 신속하고 효율적인 전송을 위해 중요하다. 전문화 된 세포, 슈반 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 희소 돌기 아교 세포, 랩 어라운드 및 미엘린에 ensheathe 축삭 신경 효과적으로 절연막과 도약적인 도통 한 용이. 수초의 방법은 신경절 뉴런이 설계, 나노 파이버 3 또는 4 슈반 세포 또는 희소 돌기 아교 세포 중 5-7와 공 배양 후근 신경절 신경 세포를 사용하여 시험 관내에서 연구 될 수있다. 시험 관내 분석은 수초 신경계 수초 형성을 연구 확립 모델이며 생체 5-8에서 수초 동안 발생할 근본적인 많은 프로세스를 복제. 분석은 C에 대한 개 OPC와 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 정제 인구의 공 배양을, (포함NS의 수초) 또는 슈반 세포 (PNS의 수초 용). 특정 조건에서 이러한 myelinating 세포는 생체에 존재하는 수초 특정 단백질의 같은 보완을 표현 세포막을 절연의 주문, 매우 구조적으로 검증, 다중 층상 시트 DRG 축삭을 ensheathe. 시험관 내에서 CNS의 수초 형성을 연구하는 가장 일반적으로 사용되는 셀 모델이 성공적 뉴로 같은 외인성 인자는 체외 5,6에서 CNS의 수초 형성을 발휘한다는 효과를 연구하기 위해 사용되었다 DRG 뉴런 및 OPC에의 공동 배양한다. 이러한 성장 인자 또는 소분자 저해제로서 외인성 요인이 널리 DRG-OPC 공동 배양 모델을 사용하여 7,9 수초에서 신호 전달 경로의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 뉴런 및 올리고 덴드로 사이트 모두 포함하는 혼합 된 공 배양 설정에서, 그것은 정식으로 남긴 것은 가능한 성장 인자 또는 하나의 Pharmacological 억제제는 DRG 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (OL) 모두에 따라 효과를 발휘 할 수 있었다. 이것은 특히 단백질 DRGs 의해서만 표현되거나 oligodendroglia 이중 셀이 시스템을 사용하는 것이 수초에 가하는 역할을 절개하는 능력을 제공한다. 명백하게 oligodendroglial의 신호 전달 경로가 직접 체외 수초 분석에 대한 DRG 뉴런에 파종하기 전에뿐만 아니라, 야생형과 돌연변이 단백질 모두를 과발현하는 우아한 방법이 될 입증되었습니다 수초, 개 OPC의 렌티 바이러스 전달, 조절되었는지 확인하려면 희소 돌기 아교 세포에 의해 항시 적으로 발현되는 단백질의 최저 식으로. 따라서이 방법은 특히 심문과 수초 9,10 공부 희소 돌기 아교 세포 내 신호 전달 경로 조작 할 수있는 수단을 제공합니다. 본 논문에서는, 우리는 우리가 렌티 바이러스를 통해 선택적으로 희소 돌기 아교 세포에 대한 관심의 단백질을 과발현하는 개발 방법을보고체외에서 수초를 연구하기위한 방법. 기술이 관심의 유전자를 포함하는 발현 벡터의 생성으로 시작하고 후속 pENTR 벡터 (L1-L2 pENTR pENTR4IRES2GFP) 내로 클로닝 야생형, 구성 적 활성 또는 우성 네거티브 형태로 될. (관심 유전자를 포함)이 벡터는, CMV 프로모터 공여체 (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) 및 2K7의 lentivector은 CMV 프로모터 함유 2K7 벡터, 관심있는 유전자를 생산하는 효소 반응으로 결합 내부 리보좀 진입 부위와 GFP (도 1). PMD2.G 바이러스 봉투 및 pBR8.91 바이러스 패키지와 결합이 게이트웨이 클로닝 2K7 구조체는이어서 OPC를 형질 도입하는데 사용될 수 렌티 바이러스를 생성하는 HEK293T 세포로 공동 형질 감염 될 수있다. 렌티 바이러스로 감염되면 OPC에 관심 단백질의 높은 레벨을 표현한다. 이 OPC를 다음 DRG 신경 세포 배양에 접종하고 그 효과를 발현 할 수있다목적 단백질의 높은 수준은 심문 수 수초화에 미치는. 공동 문화는 웨스턴 블롯 분석에 의해 수초 단백질 발현에 대한 평가 및 면역 세포에 의해 유수 축삭 세그먼트의 형성을 위해 시각입니다.

<table><tbody><tr><td>2K7 렌티벡터&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dr Suter의 친절한 선물9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG (H + L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG (H + L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티-토끼 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 뉴런 보충제</td><td>줄기세포 기술&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Human)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (d-Biotin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 형광 장착 매체</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산, 글루타민 없음</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘, 마그네슘</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr>프로토콜 1-2에 따라 생성 프로<td>모터 및 관심</td><td></td><td></td> 유전자에 대한 엔트리 벡터 <td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>포스콜린&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>글루코스 (D-글루코스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>화학 공급</td><td>GL010-500M</td><td>재고 솔루션 보기</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>라미닌&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>재고 솔루션 보기</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>재고 솔루션 보기</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민- 200 mM (100x) 액체</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus 효소</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, 글루타민</td><td>없음 Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha; &beta; III 튜불린&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>마우스 & 알파; MBP (monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na 피루브산염&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (마우스)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1 항체 - 마우스 anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>O1 하이브리도마 세포를 사용할 수 없는 경우 대안</td></tr><tr><td>O1 하이브리도마 세포</td><td></td><td></td><td>O4 항체 면역에 사용되는 항-O1 항체를 함유한 조건화된 배지</td></tr><tr><td>O4 항체 - 마우스 anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>O4 하이브리도마 세포를 사용할 수 없는 경우 대안</td></tr><tr><td>O4 하이브리도마 세포</td><td></td><td></td> 면역 <td>판닝에 사용되는 항-O4 항체를 함유한 컨디셔닝 배지</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl 유능 세포</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Papain Suspension</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Dr Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Human)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 100x 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>시그마</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴&nbsp;</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제 (완전한 미니)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>클로나제 효소</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit &alpha; 신경필라멘트</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>토끼 &알파; MBP (polyclonal)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 하이브리도마 세포</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>면역 판닝에 사용되는 항-Ran2 항체를 함유한 조절 배지</td></tr><tr><td>Rat anti CD140A/PDGFRa 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC 배지</td><td></td><td></td><td>유능한 박테리아</td></tr><tr><td>와 함께 공급셀렌산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제 버퍼</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE 버퍼 pH8</td><td></td><td></td><td>재고 솔루션 보기</td></tr><tr><td>TNE 용해 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트레이스 원소 B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린 (apo-트랜스페린 인간)</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 억제제 닭 달걀 흰</td>자 <td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x), 페놀 레드 (0.05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1</td><td>Vector laboratories&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

수초가 뉴런 및 신경교 세​​포 미엘린 형성을 모두 포함 복잡한 과정이며, 말초 신경계 (PNS)의 중추 신경계 (CNS) 및 희소 돌기 아교 세포에 슈반 세포. 우리는 시험 관내 수초 분석, 시험 관내에서 중추 신경계 수초를 연구하기위한 설립 된 모델을 사용하고 있습니다. 이를 위해서는, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC)는 myelinating 공동 배양을 형성하는 정제 된 차 설치류 후근 신경절 (DRG) 뉴런에 추가된다. 희소 돌기 아교 세포에 의해 발현 특정 단백질이 수초에 가하는 것을 구체적 역할을 심문하기 위해 우리는 선택적 DRG 뉴런 상에 파종 전에 야생형, 구성 적으로 활성 또는 우성 네거티브 단백질을 과발현하는 렌티 바이러스를 사용하여 OPC를 형질 도입 프로토콜을 개발했다. 이것은 우리가 구체적으로 수초를 조절하는 이러한 oligodendroglial 단백질의 역할을 심문 할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 OT의 연구에 적용 할 수있다그녀의 세포 유형은, 이와 같은 시그널링 및 보상 메커니즘의 연구를위한 표적 올리고 덴드로 사이트 등의 원하는 세포 유형에 의해 발현 된 단백질의 선택적 조작을 허용하는 방법을 제공한다. 결론적으로, 렌티 바이러스 감염과 OPC에 수초 관내 분석을 결합하는 수초 형성에 관여하는 분자 메커니즘의 분석을위한 전략적인 도구를 제공한다.

플래그 태그가 세포 외 신호 관련 키나제 1 (플래그-ERK1) 효소 2K7의 구조와 바이러스 생산에 필요한 포장 및 액세서리 구조를 모두 포함하여 사용하는 구조,의 소화 제한에 의해 확인 렌티 바이러스 생산에 사용되는 구조 (그림 3) . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> 그림 3 : DNA 구조 확인. 렌티 바이러스 생산을 위해 필요한 모든 DNA 작 제물은 세균 Stbl3 정제하고 제한 효소 다이제스트에 의해 확인되었다. 액세서리 및 패키징 벡터를 표시하고, 도련 플라스미드 (A)에 비하여,을 NcoI 및 EcoRI로 분해 하였다. 2K7-GFP를 SpeI와 SacII은 (A)로 절단 하였다....

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

이 절차의 전반적인 목표는 희소돌기아교세포 전구체 세포 또는 OPC를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과도하게 발현하는 것입니다. CNS Myelination Nation의 체외 연구의 경우, 이는 먼저 렌티바이러스 벡터를 클로닝하여 수행됩니다. 다음 단계는 렌티바이러스를 생성하고 실험을 위한 최적의 바이러스 농도를 결정하는 것입니다.그 후, 절개 및 배양된 OPC를 렌티바이러스로 형질도입합니다. 마지막 단계는 DRG에서 절개된 배양된 뉴런에 형질도입된 OPC를 시딩하는 것입니다. 궁극적으로, 수초화 공동 배양은 웨스턴 블롯 분석을 통해 수초화 단백질 발현을 평가하고 면역 염색에 의한 수초화된 축삭 분절의 형성을 시각화합니다.약리학적 도구와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 렌티바이러스 접근법을 통해 원하는 세포 유형에서 야생형 또는 돌연변이 단백질을 선택적으로 과발현할 수 있다는 것입니다(예: 이 경우, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 준비하면서 transfection 당일 아침에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 2K 7개의 lent 벡터를 클론화하고, 25ml의 배지를 포함하는 T 1 75 플라스크에 3,200만 개의 HEK 2 93 T 세포를 준비합니다. 결정적으로, 이러한 세포는 transfection 전에 고정되어야 하므로 필요한 경우 더 빨리 플레이트를 부착해야 합니다. 50ml Falcon 튜브에서 표 1에 자세히 설명된 대로 T 1 75 플라스크 형질 주입을 위한 마스터 믹스를 준비하고, DNA를 DMEM 와류를 가열하기 위해 추가한 다음, 조기 침전을 방지하기 위해 마지막으로 멸균 PEI를 추가합니다.튜브를 서너 번 뒤집어 잘 섞은 다음 벤치에서 약 15분 동안 혼합물을 배양합니다. 세포의 배지를 변경한 다음 transfection 혼합물을 추가합니다. DROPWISE는 배지를 세포 위에 부드럽게 혼합한 다음 밤새 세포를 배양합니다.다음 날. GFP 발현은 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다. 형질주입 48시간 후, 바이러스 상등액의 첫 번째 배치를 수집하고 세포에 25ml의 신선한 배지를 추가합니다.바이러스 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 140Gs에서 원심분리합니다. 세포 파편 펠릿이 없는 바이러스 상등액을 새 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음 날 transfection 후 72시간 후에 바이러스 상층액 원심분리기의 마지막 배치를 수집하여 세포 파편을 제거하고 세척된 바이러스 상층액의 첫 번째 배치로 풀링합니다.다음 170, 90 분 동안 000 GS에 바이러스성 상등액을 매우 원심분리해서 바이러스를 집중시키십시오. 섭씨 4도에서. 울트라 원심분리기를 내리고 상층액을 부어 침전된 PEI와 30ml 튜브 바닥에서 볼 수 없는 바이러스의 입천장을 남깁니다.이 과정을 반복합니다. 동일한 30 밀리리터 튜브에 모든 바이러스 상층을 배치로 원심분리하여 바이러스를 농축하여 각 초원심분리기 튜브에 바이러스를 재현탁시킵니다. 500마이크로리터의 Sato 매체를 넣고 튜브를 필름으로 덮습니다.그런 다음 튜브를 30초 동안 소용돌이치고 피펫 팁으로 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 이 와류 제거 주기를 약 6회 반복하여 펠릿이 Sato 매체에 완전히 부유하도록 합니다. 이제 Sato에 재부유한 모든 바이러스를 새 마이크로 튜브에 모으십시오.1분 동안 최대 속도로 웅덩이가 된 상등액을 짧게 회전시킵니다. PEI를 펠릿화하려면 바이러스가 포함된 상층액을 수집하고 주사기를 사용하여 용액을 0.45미크론 필터에 통과시켜 마무리합니다. 세디아에서 정제된 바이러스를 2050 및 100마이크로리터 부피로 분취하고 모두 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.이 프로토콜의 경우 1차 희소돌기아교세포 전구세포가 있어야 합니다. 10cm 플레이트에서 10ml의 세디아로 배양된 OPC는 C-N-T-F-P-D-G-F-N NT 3 성장 인자를 함유하고, 세포에 대해 8%의 이산화탄소 하에서 24시간 동안 배양되어야 합니다. 미디어를 흡인하는 것으로 시작하여 완전히 제거하십시오.그런 다음 성장 인자와 동일한 매체 10 밀리리터로 교체하십시오. OPC를 렌티바이러스로 감염시키고, 필요한 양의 바이러스를 배지에 적방울로 첨가하여 관심 단백질을 발현합니다. 또한 별도의 OPC 플레이트에서 GFP만 발현하는 대조군 렌티바이러스를 배지 배양액에 혼합하고 세포를 48시간 더 혼합합니다.그런 다음 플레이트에서 OPC를 수집하여 배양된 GRG 뉴런에 파종합니다. 먼저 각 플레이트에 8ml의 EBSS를 두 번 헹굽니다. 1ml의 트립신 EDTA 0.05%를 9ml의 따뜻한 EBSS로 구성합니다.각 플레이트에 희석된 트립신 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 최대 2분 동안 배양합니다. EBSS에 30%FBS의 5 밀리리터를 추가해서 트립신을 중화하십시오.그런 다음 10 밀리리터 피펫을 사용합니다. 플레이트 표면에서 OPC를 세척합니다. 모든 세포를 수집하기 위해 매번 플레이트를 1/4 바퀴씩 돌립니다.세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 180 Gs.Now에 15 분 동안 실내 온도에 세포를 원심분리기 상층액 및 소생액을 흡인하십시오. 성장 인자가없는 따뜻한 saddo 배지의 밀리리터에 세포 펠릿을 현탁시키고 세포를 계수합니다.다음으로, 플레이트에서 배지를 완전히 흡인하여 22mm 커버 슬립에서 배양된 DRG 뉴런을 준비합니다. 그런 다음 부드럽게 200, 000 OPC를 각 커버 슬립에 떨어뜨립니다. 파종 부피는 커버 슬립당 200마이크로리터 미만이어야 합니다.플레이트를 움직이지 않고 세포가 가라앉도록 합니다 10분 후 각 웰 위에 따뜻한 오메드 1밀리리터를 얹습니다. 이제 나머지 자매 OPC를 다시 재생합니다. 성장 인자를 함유하고 있는 s omed를 사용하면 나중에 관심 단백질의 발현을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.세포외 신호와 관련된 키나아제(kinase)에 태그가 지정된 플래그. 하나의 작제물은 렌티바이러스 생산 제한에 사용되었고, 효소는 포장 작제물을 검증하기 위해 사용되었고, 보조 작제물은 OPC에 사용할 최적의 바이러스 희석을 결정하기 위해 사용되었다. IR one 렌티바이러스는 HEK 2 93 T 세포에서 HEK 2 93 T 세포에 대한 바이러스 희석 범위에서 적정되었습니다.관심 유전자의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 다음으로, 형질전환 유전자 발현을 보장하기 위해 정제된 OPC를 감염시키고 최소 2일 동안 배양했습니다. FLAG 및 GFP 수준은 자매 OPC에서 확인되었습니다.그런 다음 OPC를 DRG 뉴런에 안착시켰습니다. 그런 다음 OPC는 희소돌기아교세포로 분화했고, 서양인에 의해 평가된 바와 같이 미엘린 단백질을 발현하기 시작했습니다. MBP 염색으로 시각화된 일부 성숙한 희소돌기아교세포는 축삭돌기아교 밀도가 고려되었는지 확인하기 위해 뉴로필라멘트 또는 베타 3 튜불린으로 염색했습니다.수초화 수준을 분석할 때 OPC를 시드한 후에는 배양하는 것이 중요합니다. 자매 APC. 이런 식으로, 관심 단백질 또는 관심 단백질의 태그, 해당 발현은 공동 배양에서 확인할 수 없는 경우 자매 APC에서 확인할 수 있습니다.

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.

저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달

배우세요 중추신경계 수초화 연구를 위한 렌티바이러스를 이용한 희소돌기아교세포 전구체 세포의 형질도입 방법입니다. 이 기술은 단백질 과발현을 통해 수초화 과정을 선택적으로 분석할 수 있게 합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

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