Name: Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 배우세요 어린 제브라피시의 기낭 주입을 통한 점막 칸디다증 모델링 방법을. 공초점 현미경으로 병원체와 면역 체계의 실시간 상호작용을 관찰하여 진균 면역학 연구에 활용하세요.

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저자는 아낌없이 α-catenin의를 제공하기 위해 박사 르 트린 박사 토빈 감사 : 황수정 물고기 라인과 빌 잭맨 우리 자신의 실험실에서 촬영을 할 수 있도록합니다. 저자는 자금 출처 국립 보건원 (보조금 5P20RR016463, 8P20GM103423 및 R15AI094406)과 USDA 인정 (프로젝트 # ME0-H-1-00517-13). 이 원고는 주요 농업 및 임업 실험 역 게시 번호 3371로 게시됩니다.

참고 : 모든 제브라 피쉬의 치료 프로토콜과 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2012-11-03에서 NIH의 지침에 따라 수행되었다. 4 일 포스트 시비 1. Zebrafish의 양육 <ol><li> 다른 동영상 34에 도시 된 바와 같이, 제 3 시간 포스트 시비 내에 AB 제브라 피쉬, 또는 다른 형질 전환 계통 모아서. </li><li> (0.17 mM의 KCl을 0.33 mM의 염화칼슘이 0.33 mM의의 MgCl 2, 2 mM의 HEPES, pH가 6.8 5 mM의 NaCl을) 메틸렌 블루 (0.3 ㎍ / ml의 최종 E3 미디어 150 ㎖를 포함하는 15cm 페트리 접시에 120 알을 품어 12/12 / 암 광주와 33 ° C 배양기에서 농도). </li><li> E3 + PTU (1- 페닐 -2- 티오, 10 ㎍ / ml의 최종 농도)와 6 시간 후 용지를 교체하고 죽은 계란을 제거합니다. </li><li> 이일 후 신선한 E3 + PTU와 미디어를 교환, 33 ° C에서 4 일 동안 품어. </li></ol> 2.에서켜졌 마이크로 니들 준비 <ol><li> 다음 설정을 사용하여 바늘 풀러를 사용하여 미세 바늘로, 붕 규산염 모세관 (ID 0.69 mm OD 1.2 mm)를 당겨 (550 열을 0 풀을 130 속도 110 시간). 주 : 설정 필라멘트 다를 것이다 (도 1 참조)와 마찬가지로 형상의 미세 니들을 얻었다 필라멘트와 새로운 필라멘트가 설치 될 때마다 재조정 될 필요가있을 것이다. </li><li> 0.4 μm의 필터링 된 인산 완충 식염수 3 μL와 마이크로 바늘을 채우기 (137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을, PBS 10 mM의 나 2 HPO 4 1.8 mM의 KH 2 PO 4 7.4의 pH) 20 μL의 microloader 피펫을 사용하여 팁. </li><li> 압력 분사 시스템에 부착 된 미세 조작기에 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 바늘을 설정합니다. 30 PSI 및 분사 압력에서 30 msec의 펄스 지속 시간을 설정한다. </li><li> 바늘의 1/5이 될 때까지 물을 증류수로 페트리 접시를 사용하여, 미세 니들을 낮출. 마이크로 니들 위스콘신 클립그냥 물 수준 이하로 미세 핀셋을 토륨. 물 밖으로 미세 바늘을 가져오고 러스가 나타날 때까지 페달을 여러 번 누릅니다. </li><li> 한 방울 형 침지 오일 계층화 혈구에 마이크로 바늘을 하강시킴으로써 루스의 직경을 측정한다. 원하는 부피를 얻기 위해 펄스 폭을 조정한다 (표 1 참조). </li><li> 기름에 안정적으로 유지 (루스가 볼륨을 증가하면 압력을 낮추고 일시 볼륨이 감소하면 배압을 증가) 할 러스에 대한 배압을 설정합니다. 각각의 마이크로 니들의 펄스 지속 시간을 기록한다. </li><li> microloader 피펫 팁을 사용하여 흡입하여 미세 바늘에서 PBS를 제거하고 인젝터에 다시 배치하고 연속 펄스 스위치를 젖혀 왼쪽 위에 PBS를 추방. 각각의 마이크로 바늘을 보유합니다. </li></ol> 3. 칸디다 준비 <ol><li> 킬 칸디다 알비 칸스 코돈 최적화 dTomato, GFP, BFP, EOS 또는 원거리로 형질 전환효모 peptine 덱 스트로스 (YPD) 한천 플레이트 (10g /의 L 효모 추출물, 20g / L 펩톤에 멸균 나무 앵커를 사용하여 냉동 주식에서 (-80 ° C 주식 25 % 글리세롤) 레드, 20g / L의 포도당 , 20g / L의 한천은, 멸균 및 배양 접시에 25 ml에 부어) 30 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 멸균 나무 앵커를 사용하여 하나의 식민지를 선택하고 YPD 액체 (10g /의 L 효모 추출물, 20g / L 펩톤, 20g / L의 포도당을 5 ml에 접종, 멸균 및 무균 16 × 150mm 유리 문화 5ml에 분주 튜브). </li><li> 60 rpm에서 롤러 드럼에서 30 ° C에서 밤새 인큐베이션. </li><li> C. 1 ㎖를 수집 1.7 ml의 멸균 원심 분리기 튜브에 알비 칸스 문화 및 전송. </li><li> 초 몇 5,000 XG에 원심 분리기. 뜨는을 비우고 철저하게 멸균 PBS, 소용돌이 1 ㎖를 추가합니다. 이 두 번 반복합니다. </li><li> 멸균 PBS에서 1,000 : 1 ml의 수량 1 개를 희석하여 혈구를 사용하여 식민지를 계산합니다. </li></ol> 4에 Zebrafish의 주입Swimbladder <ol><li> 33 ° C의 배양기에서 30 분 동안 주입 접시 (2 % 아가 로스)을 따뜻하게. </li><li> 원하는 시간에, 어떤 제브라 피쉬를 흡입하지 않고 25ml를 피펫을 사용하여 주입하는 물고기를 포함 15cm 페트리 접시에서 E3 + PTU의 150 ml의 100를 제거합니다. </li><li> 나머지 50 ㎖ 미디어 (최종 농도 200 ㎍ / ㎖)에 4 ㎎ / ㎖ 버퍼 tricaine 메탄 설포 네이트 재고 (TR) 2 ㎖를 추가하여 제브라 피쉬 DPF (4) 마취 15 분 동안 기다립니다. </li><li> 해부 현미경, 팽창 swimbladder 물고기를 선택합니다. 물고기는 또한 MPO에서 호중구 분포로, 균일 한 표현형을 위해 그 시간에 상영 할 수 있습니다 GFP 라인은 해부 현미경 표면 형광을 사용. </li><li> C. 희석 원래의 농도에서 알비 칸스의 재고 1.5 × 10 7 식민지 PBS에서 ㎖ (CFU / ㎖) 당 단위를 형성한다 (단계 3.8). </li><li> 플라스틱 전열관을 사용하여 사출 접시 (30) 상으로 전송 지브라 피쉬TTE 및 초과 용지를 제거합니다. </li><li> 낚시 선 도구 (0.012 인치 직경 낚시 줄 보로 실리케이트 모세관에 슈퍼 접착)를 사용하여, 수직 사출 접시를 들고 10 물고기의 3 선을 수직으로 물고기의 방향을. </li><li> 초과 한 용지를 제거합니다. </li><li> 철저히 1.5 × 107 CFU로 튜브 와동 / ㎖ C. 알비 칸스. </li><li> C. 3 ㎕를 하나의 마이크로 바늘을 채우기 알비 새로운 microloader 피펫 팁을 사용하여 적절한 설정으로 펄스 지속 시간을 설정한다 (단계 2.9 참조). </li><li> swimbladder (도 3a)의 후방을 향해 조준, 미세 니들 및 물고기의 머리 사이의 20 °의 각도를 만들기 위해 분사 접시 돌린다. </li><li> , swimbladder로 마이크로 바늘을 밀어 바늘의 구멍은 루멘에 확인하고, 한 번 페달을 누르십시오. </li><li> 각각의 물고기를 반복 E3와 함께 요리를 홍수에 의해 복구 접시 (25 ml의 E3 + PTU)로 전송D 복구 접시에 그것을 비우는. </li><li> 사출 접시에 다른 30 ​​물고기를 전송합니다. </li><li> 철저하게 가득 새로운 마이크로 바늘 반복 주입은 C를 와동 알비 칸스. </li><li> 필요한 경우 오염을 방지하고 별도의 복구 접시 (단계 4.10)로 전송하기 위해 다른 주사 접시를 사용하여, PBS 제어를 주입하여 마침. </li></ol> 5. 원하는 접종의 물고기 상영 <ol><li> 용해 될 때까지 레인지 작동, 37 ° C로 냉각 비등, E3의 40 ml의 0.4 % 아가로 오스 솔루션 (LMA) 낮은 용융 160 mg을 추가하여 낮은 용융 아가로 오스 40 ml의를 준비합니다. 한 번 냉각 TR (최종 농도 200 ㎍ / ㎖)의 400 μl를 추가합니다. </li><li> (25 ㎖ E3 + PTU, 최종 농도 200 ㎍ / ㎖의에 TR 만 1 ml의 사용 단계 4.3) 기술로 30 분 복구 후 물고기를 마취시키다. </li><li> 무게 보트 LMA 2 ㎖에 (가능한 한 작은 매체) 전송 (30) 물고기. </li><li> 기음 개별 전송 피펫과 물고기와 만 10 × 6 중앙 우물을 사용하여, 96 웰 이미징 플레이트에 LMA 1 방울과 물고기를 접시. </li><li> 화면에 모든 물고기가 이미징 플레이트에 장착 될 때까지 반복합니다. </li><li> 미디어가 5 분 동안 실온에서 고화하자. </li><li> 그들은 유리 바닥과 접촉 확인하고, 그들의 편에서 물고기를 놓습니다. </li><li> 반전 표면 형광 / 공 초점 현미경 및 적절한 필터 20X 대물 렌즈를 사용하면, C.의 수를 기록 각 물고기의 swimbladder에 알비 칸스의 효모 세포. </li><li> , swimbladder 15-25 효모 세포와 물고기 (또는 원하는 접종)을 선택 안락사 선택되지 않은 물고기 (E3에서 TR 800 μg의 / ㎖)에 의해 E3 + PTU 50 ml로 깊은 페트리 접시에 선택한 생선을 반환 촬상 선택된 웰 플레이트 E3의 3 방울을 첨가하고, 플라스틱 전송 피펫으로 흡입 물고기. </li><li> 원하는 기간 동안 33 ° C에서 품어. </li></ol> 6. 물고기 사후 심사 이미징 <ol><li> 원하는 시간, 이미지를 포함하는 어류 깊은 페트리 접시에서 E3 + PTU 매체의 50 ㎖의 25을 제거한다. </li><li> (25 ml의 E3 + PTU 나머지, 최종 농도 200 ㎍ / ㎖의에 TR 만 1 ml의 사용 단계 4.3) 기술로 물고기를 마취시키다. </li><li> 적절하게 96 웰 이미징 플레이트와 위치로 물고기 플레이트 (5.7 - 5.3 단계). </li><li> 적절한 레이저와 방출 필터를 사용하여 공 초점 현미경을 스캔하여 이미지. 제 1 차동 간섭 대비 (DIC) 하에서 4X 목적을 사용 물고기 초점과 2 마이크로 초 / 화소 ​​속도 및 1,024 × 600 화소 종횡비 스캔 모드에서, 공 초점 레이저를 20X 대물 렌즈를 이용하여 관심 영역의 화상을 취득. 3 프레임 칼만 필터 모드를 적용, 1 ㎛의 크기를 갖는 Z-스택을 획득. </li><li> 50 ㎖ E3 + PTU 또는 individua에 깊은 페트리 접시로 돌아 가기L 우물 (24 웰 배양 접시, 3 ㎖ E3 + PTU), 33 ° C에서 품어. </li></ol> 7. Swimbladder 해부 <ol><li> 높은 진공 그리스와 10 ML의 주사기를 입력합니다. </li><li> 2 % LMA (아가로 오스 E3 8 ml의 낮은 녹는 160 MG와 단계 5.3)을 준비합니다. </li><li> 원하는 시간, 물고기 (단계 5.2)를 마취시키다. </li><li> 이전 10 E3 1 ㎖와 함께 1.7 ㎖의 원심 분리 관에 물고기와 원심 분리 튜브에 4 ㎎ / ㎖ Tricaine (최종 농도 800 ㎍ / ㎖) 200 μL를 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션에 의해 안락사. </li><li> 마이크로 슬라이드 (75 X 25mm, 그림 2)에 1cm 간격, 광장에 진공 그리스의 4 방울을 배치하여 영상 유리 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 광장의 중앙에 2 % LMA 2 방울을 놓습니다. </li><li> 해부 현미경 별도의 유리 슬라이드에 하나의 물고기를 놓고 심장이 박동을 멈 추면 확인, 여분의 수분을 제거합니다. </li><l미세 핀셋을 사용하여 난&gt; 왼쪽 핀셋으로 고정 된 위치에 머리를 유지하고 오른쪽 핀셋 (그림 4A)과 전방 장을 아래로 당겨서 swimbladder을 해부하다. </li><li> 소화 기관에서 분리, 왼쪽 핀셋 공기 덕트에 의해 swimbladder을 선택하고,이 응고되기 전에 2 % LMA의 중심에 배치합니다. </li><li> 이미징 유리 슬라이드의 상단에 커버 슬립 (18 X 18mm)를 놓고는 진공 그리스뿐만 아니라 LMA (그림 2)에 닿을 때까지 밀어 넣습니다. </li><li> 해부의 10 분 내 이미지 단계 6.4에 설명 된대로. 단계를 반복 7.7-7.11 다른 물고기와. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

swimbladder의 미세 주입 질환 모델의 발전과 한계 여기에 제시된 모델은 Gratacap 등에 설명 된 점막 칸디다증 침수 모델의 확장이다 (2013).; 이는 제어 된 감염 시간의 장점, 높은 재현성 감염 도즈, 따라서 효율 향상을 추가한다. 우리는 여기서 비 침습적 훌륭한 세부 사항에 감염 역학의 시간적 문서뿐만 아니라 swimbladder의 높은 해상도 생체 이미징을 허용하는 새로운 방법을 보여줍니다. 이러한 절차는 C의 연구를 촉진한다 알비 칸스 (Candida albicans)은 점막에 면역 체계의 상호 작용의 역 동성을 -innate. 점막 감염 모델의 제한된 수 제브라 설명되었지만, 모든 소화관 장해 / 감염 24,43 한정. 여기에 제시된 swimbladder 모델은 폐에 약간의 유사성을 공유하고 밀폐 된 사이트를 제공하는 기관에 감염의 사이트를 확장병원균 덜 ...

점막 감염은 병원체가 전신 환경에 접근할 수 있도록 하는 상피 장벽의 손상으로 인해 생명을 위협하는 혈류 감염으로 이어질 수 있습니다1,2. 또한 점막 감염은 외부에 격리되어 있더라도 심각한 면역 병리를 유발할 수 있습니다3-5. 공생 단세포 곰팡이 Candida albicans는 구강 및 기타 점막 부위의 대다수 개체군에 존재합니다6-9. 일반적으로 선천성 면역 및 적응 면역 반응에 의해 억제되지만, 선천성 면역 결함 및 의학적 개입은 심각한 점막 칸디다증으로 이어질 수 있습니다. 상피 장벽에 대한 공격은 면역 병리뿐만 아니라 생명을 위협하는 전파 질환의 위험을 증가시키며, 외음부-질 칸디다증의 경우, 추가로 C. albicans의 집락화는 폐 면역 항상성과 관련이 있습니다10,11. 파종성 칸디다증은 현재 중환자실12에서 네 번째로 흔한 혈류 감염이며 사망률이 40%에 달해 주요 우려 사항입니다. 자가면역 질환, 암 또는 장기 이식 환자에 대한 면역 조절 치료가 증가함에 따라 이 병원체와 점막 면역 구획 간의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적입니다.
점막 수준에서 C. albicans-cell interaction에 관한 대부분의 세포 생물학적 발전은 in vitro13-15 및 murine models16-18에서 비롯됩니다. 이 두 가지 접근 방식 모두 뚜렷한 장점이 있지만, 온전한 숙주에서 고해상도로 살아있는 세포를 이미지화할 수 있는 능력은 감염의 시간적, 공간적 특성화를 제한했습니다. 이러한 연구를 위해서는 병원체, 선천성 면역 및 상피 세포의 상호 작용을 온전한 척추 동물 숙주에서 시각화할 수 있는 생체 내 모델이 필요합니다.
제브라피쉬는 주로 유전자 조작에 대한 투명성과 편의성으로 인해 인간 질병을 이해하는 데 매우 유용한 도구로 부상했습니다. 세포와 장기 발달은 매우 세밀하게 이미지화되었으며, 이를 통해 발달 중인 흉선19 또는 세포 내 마이코박테리아와 식세포간의 전투 20-22와 같은 새로운 면역 세포 행동에 대한 설명으로 이어졌습니다. 최근 연구에서는 제브라피시의 장내 미생물-숙주 상호작용을 설명하고 장관의 미생물 집락화가 숙주 장생리학 및 다른 감염에 대한 저항력에 영향을 미친다는 것을 보여주었다23,24. 또한, 장 상피를 통한 감염은 여러 병원체에 대해 설명되었습니다.
장관과 대조적으로, 부레는 더 고립되고 보완적인 점막 모델을 나타냅니다. 이 기관은 발달 중인 장관의 연장선으로 간과 췌장 전방에서 형성됩니다25,26. 그것은 계면 활성제, 점액 및 항균 펩티드27 , 28 및 해부학 적으로뿐만 아니라 존재 유전 학적으로,이 기관은 포유류 폐29 , 30의 상동 체로 간주됩니다. 공압 덕트는 제브라피시의 장에 연결되어 있기 때문에 침수 감염이 자연적으로 발생할 수 있습니다. 놀랍게도, 칸디다균 종에 감염된 어류의 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 유일한 감염은 방광의 C. albicans 감염이다31. 우리는 최근에 C. albicans가 수영 방광을 감염시키는 실험적 침수 감염 모델을 설명했으며, 이 감염이 체외32,33에서 C. albicans-상피 상호 작용의 일부 특징을 요약한다는 것을 발견했습니다. 
여기에 제시된 방법에서, 원래의 침지 감염 모델은 수정 4일 후(dpf) 제브라피쉬의 부레에 C. albicans를 직접 주입하여 개선되었습니다. 이를 통해 감염을 정확하게 시간적으로 제어할 수 있을 뿐만 아니라 재현성이 높은 접종을 할 수 있습니다. 이를 통해 제브라피시 모델의 다양성과 함께 상세한 생체 내 이미징이 가능합니다. 이 방법으로 수행할 수 있는 작업의 예로, 감염 부위에 대한 호중구 동원과 함께 C. albicans 성장의 시공간 역학을 제시합니다. 제브라피시 수영 부레는 생체 내 이미지화가 어렵기 때문에 형광 신호와 미세한 해상도를 향상시키는 신속한 수영 방광 해부 기술도 제시합니다. 이러한 방법은 곰팡이, 면역학 및 양식 연구를 위한 도구 상자를 확장할 뿐만 아니라 점막 표면의 다른 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스 감염을 모델링하기 위해 번역될 수 있는 새로운 감염 경로를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.7ml 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>딥 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>파인 트위저 (Dumont Dumoxel #5)</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>나무 다웰</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>플레이밍 브라운 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세관</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 주입 시스템</td><td>응용 과학 계측</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>배압 장치</td><td>응용 과학 계측</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더 키트</td><td>응용 과학 계측</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>풋 스위치</td><td>응용 과학 계측</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>응용 과학 계측</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>자기베이스</td><td>응용 과학 계측</td><td>마그네틱 베이스</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 메탄 설포네이</td>트 <td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>올림푸스</td><td>SZ61 상단 SZX-ILLB2-100 기본</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX-81 FV-1000 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템</td><td></td></tr><tr><td>20X 현미경 대물</td>렌즈 <td>올림푸스</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>롤러 드럼</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tube (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (코닝)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>어린이 점토 (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 ( Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A immersion oil</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>낚싯줄</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 웰 이미징 플레이트(Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스(다우코닝)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>마이크로슬라이드(25 x 75mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립(18 x 18mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15cm 페트리 접시(올림푸스 플라스틱)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤(EMD 화학)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24웰 배양 접시(올림푸스 플라스틱)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>웨이트 보트 (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

swimbladder 주입에 의해 애벌레 zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

점막 병원균에 대한 초기 방어는 상피 장벽과 선천성 면역 세포로 구성됩니다. 모두의 immunocompetency, 그들의 상호는 감염에 대한 보호를 위해 매우 중요하다. 병원체와 상피 및 선천성 면역 세포의 상호 작용은 가장 복잡한 문제는 시간과 공간에 펼쳐지는 생체 내에서 조사하고 있습니다. 그러나, 기존 모델은 점막 수준에서 병원균과 전투의 쉬운 공간 - 시간 영상을 허용하지 않습니다. 여기에 개발 된 모델은 청소년 제브라 피쉬의 swimbladder에 곰팡이 병원균, 칸디다 알비 칸스의 직접 주입하여 점막 감염을 만듭니다. 얻어진 감염 질환의 점막 상피에 걸쳐 개발 및 선천성 면역 세포 행동의 고해상도 영상화를 가능하게한다. 이 방법의 다양성은 산도로 이어지는 면역 이벤트의 상세한 순서를 조사하기 위해 호스트의 심문을 허용agocyte 모집 특정 세포 유형과 보호 분자 경로의 역할을 조사하고. 또한, 면역 공격의 함수로서 병원체의 동작은 형광 단백질 발현을 C. 동시에 사용하여 묘화 될 수 알비 칸스. 호스트 병원체 상호 작용의 증가 된 공간 해상도는 설명 빠른 swimbladder 해부 기술을 사용하는 것도 가능하다. 여기에 기재된 점막 감염 모델은 점막 칸디다증의 연구를위한 가치있는 도구 만드는 간단하고 높은 재현성이다. 이 시스템은 또한 일반적으로 상피 표면을 통해 감염, 마이코 박테리아 세균 또는 바이러스 성 미생물로 다른 점막 병원균에 광범위하게 번역 될 수있다.

후방 swimbladder에 미세 주입 여기에 제시된 실험 방법은 C의 일관된 용량의 주입을 설명 제브라 피쉬 DPF 4의 swimbladder에서 알비 칸스의 효모 세포. 침지 모델과 이전 작업 제안이 C.에 swimbladder 면역 반응 알비 칸스 (Candida albicans)는 포유류의 점막 칸디다증 (32)와 유사하다. 여기에서 우리는 더 간단 재현하고 빠르다 수정 감염 방법을 보여; 제브라 피쉬의 수백 주입하고 몇 시간 내에 검사를 할 수 있습니다. swimbladder의 정확하고 재현성있는 감염은 미세 주입하여 기관의 후방 지역을 대상으로하여 수행됩니다. swimbladder에 주입 애벌레 또는 배아 제브라 피쉬 (예를 들어, 정맥 또는 후뇌 뇌실)에 대한 대부분의 다른 미세 주입 경로보다 배우기 쉽다. 주입 전에 ...

점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

이 절차의 전반적인 목표는 어린 제브라피시를 사용하여 점막 칸디다증을 모델링하는 것입니다. 이것은 먼저 살아있는 albicans가 포함된 용액을 마이크로니들에 로드하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 정의된 부피의 효모 세포를 어린 제브라 물고기의 수영 방광에 주입합니다.다음으로, 물고기를 균질한 접종물에 대해 선별하고 원하는 시간 동안 배양합니다. 마지막 단계에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 병원체와 제브라피시 면역 체계의 동적 상호 작용을 추적합니다. 또한, 수영 부레는 더 높은 해상도의 공초점 이미지를 얻기 위해 마이크로 절부될 수 있습니다.여기에서 제시하는 방법은 곰팡이 병원체에 대한 면역 반응 실패로 이어지는 정확한 사건 순서와 점막 표면의 칸디드 비콘과 같은 곰팡이 면역학 및 미생물학의 주요 질문에 답합니다. 절차를 시작하기 전에 섭씨 2도의 인큐베이터에서 33%aros가 함유된 주입 접시를 데우십시오. 30분 후 25ml 피펫을 사용하여 4일째 접시에서 E 3 매체와 PTU 100ml를 제거하고 수정 후 얼룩말 물고기를 흡입하지 않도록 주의하고 밀리리터당 4밀리그램 2밀리리터를 추가합니다.Trica 메탄 설포 네이트 주식을 동물을 마취하기 위해 미디어에 판매합니다. 15분 후, 해부 현미경을 사용하여 부풀어 오른 부레가 있는 물고기를 식별하고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 30마리의 제브라 피시를 예열 주입 접시에 옮깁니다. 여분의 매체를 제거한 다음 접시를 비스듬히 잡고 보로 규산염 모세관에 접착 된 0.012 인치 직경의 낚싯줄을 사용하여 수직으로 정렬 된 10 개의 물고기로 구성된 3 개의 줄을 만들고 각각 1.5 곱하기 10에서 밀리리터 당 7 번째 CFU의 농도로 갓 준비된 바다 알비 칸 튜브를 철저히 소용돌이칩니다.그런 다음 3 마이크로 리터의 효모 용액을 EC 절단 마이크로 니들에 로드합니다. 펄스 지속 시간을 적절한 설정으로 설정합니다. 그런 다음 주입 접시를 회전하여 마이크로 니들과 물고기 머리 사이의 각도가 20도가 되도록 하여 부레의 뒤쪽을 조준합니다.이제 마이크로 니들을 수영 방광에 밀어 넣고 바늘의 구멍이 내강에 있는지 확인하고 웅덩이를 누릅니다. 어떤 물고기가 주입되었는지 확인하는 것이 비교적 쉬우면 볼루스가 기포를 대체하고 부레의 뒤쪽이 미디어로 채워지기 때문에 볼루스와 페놀 레드를 공동 주입하면 성공적인 주입의 시각화를 더욱 용이하게 할 수 있습니다. 30마리의 물고기를 모두 주입한 후 접시에 E 3 매체를 주입한 다음 물고기를 회수 접시에 비웁니다.10마리의 동물을 1.7밀리리터의 E 3 배지가 들어 있는 1.7밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 200마이크로리터의 트리카로 물고기를 안락사시킵니다. 다음으로, 각 동물에 대해 마이크로 슬라이드에서 1cm 떨어진 정사각형에 진공 그리스 4방울을 배열하고 사각형 중앙에 갓 준비한 2% 저용융 2방울을 추가합니다. 그런 다음 물고기 한 마리를 별도의 유리 슬라이드에 올려 놓고 해부 현미경 아래 동물의 심장 박동이 멈췄는지 확인하고 여분의 물을 제거합니다.이제 한 쌍의 가는 핀셋을 사용하여 머리를 고정된 위치에 고정하고 다른 핀셋을 사용하여 앞쪽 내장을 당깁니다. 공압 덕트로 수영 부레를 들어 올려 소화관에서 분리하고 어그로가 응고되기 전에 준비된 마이크로 슬라이드 중 하나의 중앙에 놓습니다. 마지막으로, 진공 그리스와 아가로스에 닿을 때까지 부드럽게 아래로 밀어 조직 위에 커버 슬립을 놓고 채취 후 10분 이내에 수영 방광을 이미지화합니다.4 나노 리터의 바다 알비 칸스를 1에서 1.5 곱하기 10 일곱 번째에 주입합니다. 밀리리터당 CFU는 가장 일관된 데이터를 제공하여 물고기당 10-50개의 효모 세포 범위를 제공합니다. 접종물을 15-25개의 효모 세포로 좁히면 훨씬 더 촘촘한 표현형과 반응을 얻을 수 있습니다.호중구는 생쥐와 인간의 칸디다증에 대한 저항성에 중요한 역할을 하며, 살아있는 알비칸스에 대한 얼룩말 물고기 수영 방광의 감염은 호중구의 빠르고 지속적인 동원으로 이어집니다. 열을 죽이는 효모 세포를 주입할 때는 발생하지 않습니다. 필라멘트는 효모 세포를 주입한 후 주입 후 처음 24시간 동안 필라멘트 성장이 계속되면서 빠르게 발달하며, 그 후 이 수치가 감소하기 시작하고, 개별 물고기를 비침습적으로 추적할 수 있는 능력이 이러한 종단 연구를 가능하게 하며, 질병 진행 및 숙주 반응의 개인 간 차이를 강조합니다.마우스 이미징에서 비실용적으로 남아 있는 실험 프로토콜인 면역 또는 상피 세포와 c 알비칸스의 상호 작용은 여기에 제시된 모델에서 비교적 쉽습니다. 그러나 방금 시연된 것처럼 부레를 해부하면 이미징의 품질이 크게 향상됩니다. 이는 형광이 어디에나 발현되는 형질전환 어선을 시각화할 때 특히 유용하며, 알파 카틴 황수정 피쉬 라인에서 해부된 부레의 이미지에서 관찰된 것처럼 주변 조직에 외부 형광이 있습니다.이 절차를 따릅니다. 모프 기술 또는 화학적 억제 치료와 같은 다른 방법은 점막 칸디다증에서 특정 면역 세포 또는 신호 경로의 역할이 무엇인지와 같은 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

출처: Li, J. et al. Clostridioides difficile에 대한 유충 제브라피쉬 감염 모델 개발. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 형광 표지된 Clostridioides difficile 을 마취된 제브라피쉬 유충의 장 내강으로 미세 주입 기반 전달을 보여줍니다. 유충 준비, 박테리아 주입 및 형광 현미경 기반 장 내 박테리아 국소화 확인과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

미세 주입을 사용하여 제브라피쉬 유충의 장 내강으로 박테리아의 국소 전달

출처: Flores, E. 외 제브라피시 유충의 식중성 감염 매개체로 원생동물 파라메시움 카우다툼을 이용하기. J. Vis. 경험 (2019년).이 영상은 형광성 대장균에 감염된 파라미시아를 먹여 제브라피시 유충에서 식중성 박테리아 장 감염 모델을 구축하는 방법을 시연합니다.

식중성 박테리아를 이용한 제브라피시 유충의 장 감염 모델링

출처: Li, J. 외.  클로스트리디오이데스 디피실에 대한 유충 얼룩말고기 감염 모델 개발. J. Vis. Exp. (2020).이 영상은 마취된 제브라피시 유충을 아가로스에 고정시키고 추적자 유도 바늘을 이용해 병원성 박테리아를 경구 주입하는 마이크로가비지 시술을 시연합니다. 비침습적 전달은 자연 감염을 모방하여 박테리아 복제, 독소 방출, 장 상피 손상 분석을 가능하게 합니다.

마이크로가비지를 이용한 제브라피시 유충 감염 모델 개발

인간 인플루엔자 A 바이러스에 대한 전신 및 국소 제브라피시 감염 모델을 보여줍니다. 전신 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 항바이러스제를 스크리닝할 수 있습니다. 국소 감염 모델을 사용하여 제브라피시를 사용하여 숙주 면역 세포 반응을 특성화할 수 있습니다.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

여기서, 우리는 대식세포 혈통 세포에 대한 약물 전달을 표적으로 하기 위한 목적으로 약물로드 리포좀과 그들의 미세 주입을 애벌레 얼룩말어로 합성하는 것을 기술한다.

약물이 탑재된 리포좀을 주입하여 애벌레 얼룩말 대식세포에 약물을 타겟팅

여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.

클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

배우세요 어린 제브라피시의 기낭 주입을 통한 점막 칸디다증 모델링 방법을. 공초점 현미경으로 병원체와 면역 체계의 실시간 상호작용을 관찰하여 진균 면역학 연구에 활용하세요.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

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