Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링
November 27th, 2014
점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 어린 제브라피시를 사용하여 점막 칸디다증을 모델링하는 것입니다. 이것은 먼저 살아있는 albicans가 포함된 용액을 마이크로니들에 로드하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 정의된 부피의 효모 세포를 어린 제브라 물고기의 수영 방광에 주입합니다.
다음으로, 물고기를 균질한 접종물에 대해 선별하고 원하는 시간 동안 배양합니다. 마지막 단계에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 병원체와 제브라피시 면역 체계의 동적 상호 작용을 추적합니다. 또한, 수영 부레는 더 높은 해상도의 공초점 이미지를 얻기 위해 마이크로 절부될 수 있습니다.
여기에서 제시하는 방법은 곰팡이 병원체에 대한 면역 반응 실패로 이어지는 정확한 사건 순서와 점막 표면의 칸디드 비콘과 같은 곰팡이 면역학 및 미생물학의 주요 질문에 답합니다. 절차를 시작하기 전에 섭씨 2도의 인큐베이터에서 33%aros가 함유된 주입 접시를 데우십시오. 30분 후 25ml 피펫을 사용하여 4일째 접시에서 E 3 매체와 PTU 100ml를 제거하고 수정 후 얼룩말 물고기를 흡입하지 않도록 주의하고 밀리리터당 4밀리그램 2밀리리터를 추가합니다.
Trica 메탄 설포 네이트 주식을 동물을 마취하기 위해 미디어에 판매합니다. 15분 후, 해부 현미경을 사용하여 부풀어 오른 부레가 있는 물고기를 식별하고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 30마리의 제브라 피시를 예열 주입 접시에 옮깁니다. 여분의 매체를 제거한 다음 접시를 비스듬히 잡고 보로 규산염 모세관에 접착 된 0.012 인치 직경의 낚싯줄을 사용하여 수직으로 정렬 된 10 개의 물고기로 구성된 3 개의 줄을 만들고 각각 1.5 곱하기 10에서 밀리리터 당 7 번째 CFU의 농도로 갓 준비된 바다 알비 칸 튜브를 철저히 소용돌이칩니다.
그런 다음 3 마이크로 리터의 효모 용액을 EC 절단 마이크로 니들에 로드합니다. 펄스 지속 시간을 적절한 설정으로 설정합니다. 그런 다음 주입 접시를 회전하여 마이크로 니들과 물고기 머리 사이의 각도가 20도가 되도록 하여 부레의 뒤쪽을 조준합니다.
이제 마이크로 니들을 수영 방광에 밀어 넣고 바늘의 구멍이 내강에 있는지 확인하고 웅덩이를 누릅니다. 어떤 물고기가 주입되었는지 확인하는 것이 비교적 쉬우면 볼루스가 기포를 대체하고 부레의 뒤쪽이 미디어로 채워지기 때문에 볼루스와 페놀 레드를 공동 주입하면 성공적인 주입의 시각화를 더욱 용이하게 할 수 있습니다. 30마리의 물고기를 모두 주입한 후 접시에 E 3 매체를 주입한 다음 물고기를 회수 접시에 비웁니다.
10마리의 동물을 1.7밀리리터의 E 3 배지가 들어 있는 1.7밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 200마이크로리터의 트리카로 물고기를 안락사시킵니다. 다음으로, 각 동물에 대해 마이크로 슬라이드에서 1cm 떨어진 정사각형에 진공 그리스 4방울을 배열하고 사각형 중앙에 갓 준비한 2% 저용융 2방울을 추가합니다. 그런 다음 물고기 한 마리를 별도의 유리 슬라이드에 올려 놓고 해부 현미경 아래 동물의 심장 박동이 멈췄는지 확인하고 여분의 물을 제거합니다.
이제 한 쌍의 가는 핀셋을 사용하여 머리를 고정된 위치에 고정하고 다른 핀셋을 사용하여 앞쪽 내장을 당깁니다. 공압 덕트로 수영 부레를 들어 올려 소화관에서 분리하고 어그로가 응고되기 전에 준비된 마이크로 슬라이드 중 하나의 중앙에 놓습니다. 마지막으로, 진공 그리스와 아가로스에 닿을 때까지 부드럽게 아래로 밀어 조직 위에 커버 슬립을 놓고 채취 후 10분 이내에 수영 방광을 이미지화합니다.
4 나노 리터의 바다 알비 칸스를 1에서 1.5 곱하기 10 일곱 번째에 주입합니다. 밀리리터당 CFU는 가장 일관된 데이터를 제공하여 물고기당 10-50개의 효모 세포 범위를 제공합니다. 접종물을 15-25개의 효모 세포로 좁히면 훨씬 더 촘촘한 표현형과 반응을 얻을 수 있습니다.
호중구는 생쥐와 인간의 칸디다증에 대한 저항성에 중요한 역할을 하며, 살아있는 알비칸스에 대한 얼룩말 물고기 수영 방광의 감염은 호중구의 빠르고 지속적인 동원으로 이어집니다. 열을 죽이는 효모 세포를 주입할 때는 발생하지 않습니다. 필라멘트는 효모 세포를 주입한 후 주입 후 처음 24시간 동안 필라멘트 성장이 계속되면서 빠르게 발달하며, 그 후 이 수치가 감소하기 시작하고, 개별 물고기를 비침습적으로 추적할 수 있는 능력이 이러한 종단 연구를 가능하게 하며, 질병 진행 및 숙주 반응의 개인 간 차이를 강조합니다.
마우스 이미징에서 비실용적으로 남아 있는 실험 프로토콜인 면역 또는 상피 세포와 c 알비칸스의 상호 작용은 여기에 제시된 모델에서 비교적 쉽습니다. 그러나 방금 시연된 것처럼 부레를 해부하면 이미징의 품질이 크게 향상됩니다. 이는 형광이 어디에나 발현되는 형질전환 어선을 시각화할 때 특히 유용하며, 알파 카틴 황수정 피쉬 라인에서 해부된 부레의 이미지에서 관찰된 것처럼 주변 조직에 외부 형광이 있습니다.
이 절차를 따릅니다. 모프 기술 또는 화학적 억제 치료와 같은 다른 방법은 점막 칸디다증에서 특정 면역 세포 또는 신호 경로의 역할이 무엇인지와 같은 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
개요
본 연구는 어린 젤리피쉬를 사용하여 점막 캔디다증을 모델링하는 방법에 대해 제시합니다. 위창자포로가 감염 부위 역할을 하여 병원체-면역 상호 작용의 실시간 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역학
- 감염병
배경
- 점막 캔디다증은 살아있는 척추동물에서 연구하기 어렵습니다.
- 어린 젤리피쉬는 이미징을 위한 투명한 모델을 제공합니다.
- 점막 수준에서의 병원체 상호 작용에 대한 이해는 치료법 개발에 매우 중요합니다.
- 형광 현미경은 면역 반응의 상세한 관찰을 가능하게 합니다.
연구 목적
- 살아있는 젤리피쉬에서 점막 캔디다증을 연구하기 위한 플랫폼을 개발합니다.
- 병원체와 면역 체계 간의 역동적인 상호 작용을 시각화합니다.
- 곰팡이 감염에 대한 면역 반응에 대한 이해를 높입니다.
사용된 방법
- microneedle에 살아있는 Candida albicans을 포함하는 용액을 로딩합니다.
- 어린 젤리피쉬의 위창자포에 효모 세포를 주사합니다.
- 균질한 접종을 위해 물고기를 선별하고 배양합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 병원체-면역 상호 작용을 관찰합니다.
주요 결과
- 젤리피쉬에서 점막 캔디다증을 성공적으로 모델링했습니다.
- 병원체에 대한 면역 반응의 실시간 이미징을 수행했습니다.
- 위창자포의 micros dissection을 통해 더 높은 해상도의 이미지를 얻었습니다.
- 감염의 시공간적 역학에 대한 통찰력을 얻었습니다.
결론
- 젤리피쉬 모델은 점막 캔디다증 연구에 효과적입니다.
- 형광 현미경은 병원체 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
- 이 방법은 추가 연구를 위해 다른 점막 감염에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish via swimbladder injection enables high-resolution, in vivo analysis of host-pathogen interactions at mucosal surfaces. This approach provides predictive confidence for early-stage target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery pipelines. The model's reproducibility and imaging capabilities support translational continuity from discovery through preclinical research for mucosal pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell and epithelial barrier function in response to mucosal infection.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing the sequence of immune events and cell recruitment.
- Facilitates functional validation of candidate targets and pathways involved in mucosal defense.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of immune modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible infection model for quantitative assessment of host-pathogen dynamics.
- Enables high-content imaging readouts for screening immune or pathogen-modulating compounds.
- Supports assay scalability and platform reuse for diverse mucosal pathogens beyond Candida albicans.
- Allows for robust evaluation of compound effects on immune cell recruitment and pathogen behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mucosal infection models for translational biomarker discovery.
- Enables longitudinal, non-invasive tracking of disease progression and host response heterogeneity.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into protective immunity.
- Supports preclinical validation of immune-modulating interventions in a vertebrate system.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish swimbladder infection model bridges early discovery and preclinical research by enabling real-time, quantitative analysis of mucosal host-pathogen interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell roles and pathway contributions to mucosal defense.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of immune cell recruitment, pathogen proliferation, and spatio-temporal dynamics.
- Translational Research: Offers continuity for biomarker alignment and disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Adaptable for studying other mucosal pathogens and immune-modulating strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mucosal infection research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and confocal imaging.
- Needs access to high-resolution microscopy and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of inoculum size and imaging protocols.
- Adaptable to various transgenic lines and pathogen types with protocol optimization.
- Imaging quality may be limited by tissue fluorescence and requires careful dissection for optimal results.
