T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 분석에서 T 세포 수용체 절제 서클 또는 REX 및 K 삭제 재조합 절제 서클 또는 교정을 모두 정량화하여 흉선 및 골수 배출량을 추정하는 것입니다. 이는 DNA 증폭 후 3개의 표적 사이의 1:1 대 1 비율을 유지하기 위해 TRX 교정의 DNA 염기서열 단편과 단일 복제 참조 유전자의 단편을 포함하는 삼중 삽입 플라스미드를 먼저 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 삼중 삽입 플라스미드의 연속 희석을 수행하여 표준 곡선을 구축하며, 이를 통해 실시간 PCR로 3개의 타겟 염기서열을 절대 정량화할 수 있습니다.

마지막으로, Realtime PCR 분석이 실행되어 트레스 및 균열의 절대 정량화가 이루어집니다. 보고된 결과는 건강한 어린이와 성인에서 연령과 성별에 따른 흉선 및 골수 배출량의 변화를 보여줍니다. 이 방법에 대한 아이디어는 신생아 또는 유아의 골수와 흉선 배출량을 모두 분석해야 했을 때 일반적으로 채혈하는 혈액의 양이 성인에 비해 부족하다는 점을 고려하여 처음 떠올

따라서 우리는 시료 전처리 및 시약 비용을 최적화하기 위해 두 가지 추적 및 교정 정량 분석 방법을 단일 분석법으로 결합하기로 결정했습니다. 이 기술의 의미는 원발성 및 후천성 면역 결핍의 진단으로 확장되지만, 이 방법은 TMB 세포의 손실과 관련된 모든 질병뿐만 아니라 골수 이식 후 새로운 재구성을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법을 통해 인간 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 주로 림프구 항상성과 관련된 기초 연구에 적용될 수 있습니다.

의 주요 장점은 트리플 잉여 미드를 사용하여 단일 표준 치료만 필요하므로 실험 변동성을 줄일 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 트리플 인서트 플라스미드 준비에 필요한 긴 절차 또는 표준 곡선 준비와 관련된 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 표준 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 EDTA 튜브에 수집된 젊고 건강한 피험자의 말초 혈액과 같이 PCR로 감지할 수 있는 TRX 및 균열이 있을 가능성이 매우 높은 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 세포에서 DNA를 추출한 후 말초혈액 단핵세포를 분리하고, 프라이머 특이적인 Fort TRX REX 및 TCR 알파 상수 유전자를 사용하여 Rex 신호, 관절 Rex 신호 관절 및 TCR 알파 상수 유전자 단편을 증폭합니다. PCR 2.1 topo 벡터의 TA 수용체 부위에 Trax 신호 접합부의 PCR 산물을 삽입하고 플라스미드 DNA를 사용하여 열 충격에 의해 XL one blue 화학적 적능 세포를 변형시키고, 베타 락타아제 보완을 잃은 암피실린 저항성 백색 콜로니를 새로운 마스터 디쉬에 분리하고, PCR을 사용하여 trek fragment를 포함하는 콜로니를 식별합니다. trek positive colonies 중 하나를 성장시키고 DNA를 분리한 후 SP one을 사용하여 플라스미드와 TCR alpha constant 유전자 증폭 산물을 분해하고 TCR alpha constant 유전자 단편을 플라스미드로 접합합니다.

형질전환, 콜로니 선택 및 증식, DNA 분리를 반복하여 올바른 단편을 삽입하고, SP 1 대신 hind three를 사용하여 플라스미드와 올바른 PCR 단편을 분해하고, DNA를 접합 및 분리하는 과정을 반복합니다. 3개의 insert의 염기서열이 확인되면 colony를 확장하고 텍스트 프로토콜에 따라 MIDI prep으로 plasmid DNA를 정제하여 표준 curve를 준비합니다. 여기에 표시된 바와 같이 플라스미드의 질량과 농도를 계산한 후 플라스미드의 부분 표본을 해동하고 하나를 보여 주면 DNA의 선형화된 부분 표본으로 2마이크로그램이 선형화됩니다.

공식 C를 사용하십시오: 1, V, 1은 C, 2, V, 2입니다. 여기에 표시된 대로 계열의 첫 번째 표준 곡선점을 준비하는 데 필요한 희석 부피를 계산하려면 1-10개의 일련의 희석을 준비하여 나머지 표준 곡선점을 얻습니다. 플라스미드 희석액을 사용할 때까지 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오.realtime PCR을 위한 샘플을 준비하기 위해 Rex 및 크랙에 대한 튜브와 TCR 알파 상수에 대한 두 개의 별도 튜브를 사용하여 다음과 같은 방식으로 분석할 각 샘플에 대해 최소 2개의 반복을 포함하는 PCR 플레이트를 준비합니다.

필요한 총 웰 수에 대해 마스터 믹스를 준비합니다. 플레이트의 웰에 20 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 말초 혈액 단핵 세포 또는 P BMC에서 추출한 5마이크로리터의 게놈 DNA를 추가합니다.

반응 플레이트를 밀봉하기 위해 광학 접착 커버를 사용하기 전에 템플릿이 없는 제어 웰에 5마이크로리터의 물을 추가합니다. 그런 다음 플라스미드 DNA 표준 곡선 희석을 해동하고 가장 높은 희석액을 준비합니다. 행 A부터 H까지와 열 1부터 4까지 사이에 있는 웰만 찾아냅니다.

그리고 짧은 와류 후에, 각 희석 점의 5 마이크로 리터를 지정된 것에 추가하십시오. 글쎄, 우물 바닥에 거품이 없고 시약이 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. Real-Time PCR 시스템을 사용하여 다음 프로토콜로 분석을 실행합니다.

섭씨 50도에서 2분간 가열하고 섭씨 95도에서 10분 동안 처음 가열한 후 섭씨 95도에서 15초 동안 45회 변성합니다. 그리고 결합 된 프라이머 프로브 e 무릎 꿇고 섭씨 60도에서 1 분 동안 신장합니다. 실시간 PCR 데이터를 분석하려면 소프트웨어에서 저장된 결과 파일을 열고 창 상단의 결과 탭을 클릭합니다.

분석 메뉴를 클릭하고 분석 설정을 선택합니다. 소프트웨어가 모든 검출기를 선택하고 임계값 주기에 대한 자동 CT를 선택하여 임계값을 자동으로 결정하도록 합니다. 소프트웨어가 기본적으로 배경 제거를 위한 자동 기준선을 설정하도록 합니다.

amplification plot이라는 탭을 클릭하고 창의 가장 오른쪽에 있는 해당 드롭다운 메뉴에서 세 개의 검출기 중 하나를 선택합니다. 바로 아래, 수동 CT를 선택하여 창 하단에서 임계값을 수동으로 설정하고, 선택한 검출기의 표준 곡선 희석점에 해당하는 웰을 선택하고 테이블의 해당 셀 위로 마우스를 클릭하고 드래그하여 증폭 플롯을 표시합니다. 임계값을 수동으로 조정하려면 빨간색 임계값 선을 위아래로 끈 다음 analyze(분석)를 클릭하여 결과를 다시 분석합니다.

임계값 설정이 결과에 어떤 영향을 미치는지 확인하려면 보고서 탭을 선택하고 각 표준 곡선 희석점의 결과 CT를 확인하십시오. 증폭 플롯 탭에서 최적의 배치를 얻기 위해 임계값을 이동할 때 임계값이 배경 노이즈보다 충분히 높지만 고원 위상 아래에 있는 지수 증폭 영역에 있는지 확인합니다. 증폭 플롯이 로그 스케일로 표시되지 않으면 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 그래프 설정을 불러오고 실행 후 Y ais 설정을 로그로 설정합니다.

플롯의 선형 부분에서 임계값을 중간에 설정하고 서로 거의 평행한 증폭 곡선을 관찰합니다. 보고서 탭을 클릭하면 CT 결과를 볼 수 있습니다. 분계점 배치가 각 표준 곡선의 두 반복실험의 정밀도를 최대화하는 결과를 생성했는지 확인합니다.

희석 점. 임계값이 보고서 탭 아래에 있는 표준 곡선 희석점의 극한 크기 순서를 가장 잘 반영하는 지점에 배치되어 있는지 확인합니다. 창의 아래쪽 부분에 있는 표에서 마우스를 다시 드래그하여 표준 곡선의 웰에 해당하는 셀을 선택합니다.모든 검출기에 대해 세 표적의 결과 CT가 동일한 희석 지점에서 매우 유사한지 확인합니다.

예를 들어, 0.5 CT 이하의 차이는 필요한 경우 임계값을 재조정하고 창 아래쪽의 보고서 탭에서 다시 확인합니다. NTC 웰을 선택하고 CT가 결정되지 않음에 해당하는 NTC 웰에 증폭이 없는지 확인합니다. 표준 곡선 탭을 선택하고 그림 창 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 검출기를 선택하고 보고된 표준 곡선 기울기 범위가 91에서 100%의 PCR 효율에 해당하는 음수 3.55에서 음수 3.32 사이인지 확인합니다. 기울기 및 절편 바로 아래의 값을 확인하여 결정 계수 또는 R 제곱이 0.998보다 높은지 확인합니다.

보고서 탭을 클릭하고 차트 아래 표의 해당 셀에서 양성 대조군의 CT가 동일한 알려진 양성 대조군에 대한 이전 분석 결과와 일치하는지 확인합니다. 파일 메뉴를 클릭하고 저장한 다음 CSV 파일로 내보내 쉼표로 구분된 값이 포함된 텍스트 파일의 모든 웰 수량을 내보냅니다. 마지막으로 스프레드시트 소프트웨어에서 CSV 파일을 가져오고 다음 공식을 적절하게 설정하여 6개의 PBM에 대한 10당 트랙 수 또는 수정 수를 계산합니다.

이 비디오에 설명된 분석은 87개의 건강한 대조군의 대표 샘플에 대해 수행되었습니다. 0세에서 17세 사이의 어린이 42명과 24세에서 60세 사이의 성인 45명. 여기에서 볼 수 있듯이, 성인의 경우 흉선 침범으로 인해 나이가 들면서 트레킹 횟수가 0년에서 3년에서 4년으로 급격히 감소했습니다.

트레킹 횟수는 여성보다 남성에서 더 빠르게 감소하기 때문에 성별에 따라 달라지며, 이는 적절한 참조 범위를 설정하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 이 그래프는 나이가 들면서 균열 수가 감소했음을 보여주는데, 이는 T TREX에서 볼 수 있는 패턴과 유사하게 어린이에서만 볼 수 있습니다. 반면 성인의 경우 골수 배출량은 평생 동안 상당히 안정적이며 성별에 의존하지 않습니다.

인서트 플라스미드 준비에서 트리플은 약 2-3주가 소요되지만, 그 후 저장된 플라스미드 할당은 3년 동안 지속됩니다. 이 기술의 나머지 부분은 적절하게 수행되면 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 교차 오염을 피하기 위해 전용 영역에서 모든 플라스미드 관련 조작을 수행하는 것이 매우 중요합니다.

또한 개발 후 결과를 분석할 때 표준 튜브의 안정성을 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 임상 면역학 또는 혈액학 분야의 연구자들에게 골수 이식 후 면역 재구성의 결과를 모니터링하거나 단순히 림프구 항상성을 연구하기 위해 원발성 면역 결핍을 식별하기 위한 개선된 도구를 제공했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 플라스미드에서 트리플을 얻고, 표준 곡선을 준비하고, Realtime PCR 실험을 실행하고, trax 및 균열의 재현 가능한 절대 정량화를 얻는 데 필요한 계산을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.