Name: T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 학습하세요 TREC와 KREC 동시 정량 방법으로 실시간 PCR을 이용하여 흉선과 골수 기능을 평가하는 면역학 연구 기법입니다. 소량 혈액 샘플로도 정확한 면역 세포 생성량 분석이 가능합니다.

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<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
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TREC 및 KREC 정량화는 몇 가지 주의 사항을 고려하는 경우 최근의 흉선 및 골수 출력에 대한 좋은 추정치로 간주될 수 있습니다. 표준 곡선을 사용하는 절대 정량 분석법은 Real-Time PCR 반응 플레이트에 더 많은 시약과 더 많은 공간이 필요하지만 알려진 양의 출발 물질을 기반으로 구축된 표준 곡선에서 알려지지 않은 샘플 양을 보간하기 때문에 매우 정확한 정량 결과를 보장합니다. 또한 이 방법은 적은 양의 표적을 감지하는 데 더 적합합니다. 방법론적 관점에서 중요한 점은 표준 곡선 점에 해당하는 냉동 플라스미드 희석액이 예상보다 빨리 분해될 수 있다는 것입니다. 이를 위해서는 각 실험 절차 전에 원래 저장된 플라스미드의 새로운 희석액, 특히 가장 희석된 플라스미드를 준비해야 합니다. 최종 계산에서 PBMC 양의 추정치로서 림프구와 단핵구 수 사이의 완전하지 않은 동등성은 106 당 표현된 값과 혈액 ml당 표현된 값 사이의 변환에 약간의 편향을 추가할 수 있습니다. 전혈에서 직접 추출한 알려진 양...

T 세포 수용체 절제 원 (TRECs) 및 K-삭제 재조합 절제 원 (KRECs)는 게놈 DNA 재조합 과정 T- 각각 B-세포의 비율로 절제되어 작은 원형으로 DNA 요​​소이다 선도 매우 다양한 레퍼토리의 T- 및 B- 세포 수용체의 형성. 이들은 어떤 기능이 없지만, 그들이 안정되고 복제 될 수 없기 때문에, 따라서 그들은 단지 두 개의 딸 세포 중 하나로 지속 각 세포 분열 후에 희석된다. 따라서, 말초 혈액에서의 수준은 흉선 및 골수의 출력 추정값으로서 가정 될 수있다. TREC 분석은 주로 흉선 출력의 정도를 평가하기 위해 지난 15 년 동안 사용되었지만, 초기에 개발 된 1 KREC 분석은 B 세포의 증식 및 건강과 질환에서의 B 세포의 항상성에 기여 2 측정 최근 골 m의 마커로서 제안되었다출력 화살표. 3,4 여기, 우리는 우리가 TRECs과 KRECs 모두의 동시 정량을 위해 개발 된 방법을 설명합니다. (4) 이 조합 된 방법으로, 실시간 PCR에 의해 DNA 정량 연관된 가변성 TRECs, KRECs 및 T 세포 수용체 알파 상수의 단편을 함유하는 트리플 삽입 플라스미드를 희석 한 고유의 표준 곡선을 사용 (TCRAC)에 의해 제거된다 1 : 1 : 1 비율의 유전자. 이것은 TREC와 KREC 카피 수의 더 정확한 평가를 할 수있다. 또한, 동일한 반응에서 두 타겟의 동시 정량 시약 비용 감소를 허용한다. 제안 된 TREC / KREC 분석은 중증 복합 면역 결핍 (SCID), 4 공통 변수 면역 결핍, 5자가 면역 질환, 6-8과 HIV 감염 어린이 또는 성인의 T-의 범위와 B 세포 신 생산을 측정하기 위해 유용 할 수 있습니다 . (9) 또한,이 사용 가능환자 KREC 정량화를 사용하여 식별 될 수 agammaglobulinemia SCID 환자 근본적인 유전 적 결함에도 불구 TREC 분석법을 인식하고 있기 때문에, 최종적. 6-8, 조혈 줄기 세포 이식, 10 효소 대체 (11)와 바이러스 9 또는 면역 요법 후에 면역 회수를 모니터링하고, , TREC / KREC 분석은 또한 신생아 스크리닝 프로그램에서 immunodeficiencies를 검출하는데 사용될 수있다. (12)이 경우, 시험 혈액 도말의 작은 반점에서 추출한 DNA에 대해 수행하고 여과지상에서 건조되어야 고도로 민감하고 특이이어야 표적 질환뿐만 아니라 재현성이 높은 비용 효율적인. 위스콘신부터 소개하는 첫번째되었을 때 시험에 KREC 정량의 도입은 일상적으로 2008 미국 (WI, MA, CA)의 일부 지역에서 수행 된 immunodeficiencies에 대한 신생아 선별 검사의 성능을 개선한다그 산후 검진 프로그램에 TRECs의 전자 분석. (13)

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>밀도 그라디언트 분리 방법</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>DNA 추출</td></tr><tr><td>Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba 시약 S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>동결건조된 생성물을 100 pmol/&micro로 재현탁; l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA 중합효소: 10x Buffer II 및 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td> <td>포함Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>Topo TA 클로닝 키트</td><td>for Subcloning Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 서브클로닝 등급 역량 세포</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 플라스미드 미니프렙 시스템</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>퓨어일드 플라스미드 미디프렙 시스템</td><td>프로메가</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE 완충액 (1 mM TRIS 및 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba 시약 S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>동결건조된 생성물을 100 pmol/&micro로 재현탁; l</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Fast 7500 Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 염기서열 검출 소프트웨어 1.4</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (trecs)와 k-삭제 재조합 절제술 원 (krecs) 실시간 pcr에 의한

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TREC) 및 K-deleting recombination excision circles (KREC)는 T-cell 및 B-cell receptor를 생성하는 재조합 과정에서 형성되는 원형화된 DNA 요소입니다. TREC과 KREC는 복제할 수 없기 때문에 각 세포 분열 후에 희석되어 세포에 남아 있습니다. 말초 혈액 내 이들의 양은 흉선 및 골수 배출량의 추정치로 간주될 수 있습니다. 잘 정립되고 일반적으로 사용되는 TREC 분석과 수정된 버전의 KREC 분석을 결합하여 단일 분석에서 새로 생성된 T 및 B 림프구를 모두 정량화할 수 있는 이중 정량 real-time PCR을 개발했습니다. TRECs 및 KREC의 수는 박테리아 플라스미드에 복제된 TREC 및 KREC 신호 관절을 참조 유전자 역할을 하는 T 세포 수용체 알파 상수 유전자 단편과 함께 연속으로 희석하여 준비된 표준 곡선을 사용하여 얻어집니다. 결과는 TRECs 및 KRECs/106 세포 수 또는 혈액 ml당 보고됩니다. 이러한 DNA 단편의 정량화는 소아와 성인 모두에서 골수 이식 후 면역 재구성을 모니터링하고, 면역 결핍의 특성을 개선하거나, 특정 면역 조절 약물 활성에 대한 이해를 개선하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다.

분석은 87 건강한 대조군의 대표 샘플에서 수행 하였다 : (42) 어린이는 0 세 - 17 (남성 / 여성 : 17분의 25)와 24 세 (45) 성인 - 60 (남성 / 여성 : 16분의 29)을. 결과를 계산 하였다 TRECs 10 6 PBMC 당 KRECs 후 혈액 1 ㎖ 당과 TRECs KRECs로서 수득 하였다. 4 년 - TRECs의 수는 인해 0-3 매우 날카로운 방식으로 특히 흉선 퇴화, 4 세 감소한다. 그것은 여성보다 남성에게 더 빠르게 감소하기 때문 성인에서, TREC 번호도 성별에 의존한다. (5)이, 연령 및 가능 성별에 기초하여 차별화 매우 정밀한 경우되어야 적절한 참고 범위를 설정하는 문제를 생성 할 수있다 정상의 추정이 필요하다. <img alt="그림 3" src="/f...

여기에서는 T-세포 수용체 절제원(TREC)과 K-삭제 재조합 절제원(KREC)을 동시에 정량화하는 방법을 설명합니다. TREC/KREC 분석은 흉선 및 골수 배출량의 마커로 사용할 수 있습니다.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 분석에서 T 세포 수용체 절제 서클 또는 REX 및 K 삭제 재조합 절제 서클 또는 교정을 모두 정량화하여 흉선 및 골수 배출량을 추정하는 것입니다. 이는 DNA 증폭 후 3개의 표적 사이의 1:1 대 1 비율을 유지하기 위해 TRX 교정의 DNA 염기서열 단편과 단일 복제 참조 유전자의 단편을 포함하는 삼중 삽입 플라스미드를 먼저 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 삼중 삽입 플라스미드의 연속 희석을 수행하여 표준 곡선을 구축하며, 이를 통해 실시간 PCR로 3개의 타겟 염기서열을 절대 정량화할 수 있습니다.마지막으로, Realtime PCR 분석이 실행되어 트레스 및 균열의 절대 정량화가 이루어집니다. 보고된 결과는 건강한 어린이와 성인에서 연령과 성별에 따른 흉선 및 골수 배출량의 변화를 보여줍니다. 이 방법에 대한 아이디어는 신생아 또는 유아의 골수와 흉선 배출량을 모두 분석해야 했을 때 일반적으로 채혈하는 혈액의 양이 성인에 비해 부족하다는 점을 고려하여 처음 떠올랐습니다.따라서 우리는 시료 전처리 및 시약 비용을 최적화하기 위해 두 가지 추적 및 교정 정량 분석 방법을 단일 분석법으로 결합하기로 결정했습니다. 이 기술의 의미는 원발성 및 후천성 면역 결핍의 진단으로 확장되지만, 이 방법은 TMB 세포의 손실과 관련된 모든 질병뿐만 아니라 골수 이식 후 새로운 재구성을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법을 통해 인간 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 주로 림프구 항상성과 관련된 기초 연구에 적용될 수 있습니다.의 주요 장점은 트리플 잉여 미드를 사용하여 단일 표준 치료만 필요하므로 실험 변동성을 줄일 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 트리플 인서트 플라스미드 준비에 필요한 긴 절차 또는 표준 곡선 준비와 관련된 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 표준 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 EDTA 튜브에 수집된 젊고 건강한 피험자의 말초 혈액과 같이 PCR로 감지할 수 있는 TRX 및 균열이 있을 가능성이 매우 높은 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다.텍스트 프로토콜에 따라 세포에서 DNA를 추출한 후 말초혈액 단핵세포를 분리하고, 프라이머 특이적인 Fort TRX REX 및 TCR 알파 상수 유전자를 사용하여 Rex 신호, 관절 Rex 신호 관절 및 TCR 알파 상수 유전자 단편을 증폭합니다. PCR 2.1 topo 벡터의 TA 수용체 부위에 Trax 신호 접합부의 PCR 산물을 삽입하고 플라스미드 DNA를 사용하여 열 충격에 의해 XL one blue 화학적 적능 세포를 변형시키고, 베타 락타아제 보완을 잃은 암피실린 저항성 백색 콜로니를 새로운 마스터 디쉬에 분리하고, PCR을 사용하여 trek fragment를 포함하는 콜로니를 식별합니다. trek positive colonies 중 하나를 성장시키고 DNA를 분리한 후 SP one을 사용하여 플라스미드와 TCR alpha constant 유전자 증폭 산물을 분해하고 TCR alpha constant 유전자 단편을 플라스미드로 접합합니다.형질전환, 콜로니 선택 및 증식, DNA 분리를 반복하여 올바른 단편을 삽입하고, SP 1 대신 hind three를 사용하여 플라스미드와 올바른 PCR 단편을 분해하고, DNA를 접합 및 분리하는 과정을 반복합니다. 3개의 insert의 염기서열이 확인되면 colony를 확장하고 텍스트 프로토콜에 따라 MIDI prep으로 plasmid DNA를 정제하여 표준 curve를 준비합니다. 여기에 표시된 바와 같이 플라스미드의 질량과 농도를 계산한 후 플라스미드의 부분 표본을 해동하고 하나를 보여 주면 DNA의 선형화된 부분 표본으로 2마이크로그램이 선형화됩니다.공식 C를 사용하십시오: 1, V, 1은 C, 2, V, 2입니다. 여기에 표시된 대로 계열의 첫 번째 표준 곡선점을 준비하는 데 필요한 희석 부피를 계산하려면 1-10개의 일련의 희석을 준비하여 나머지 표준 곡선점을 얻습니다. 플라스미드 희석액을 사용할 때까지 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오.realtime PCR을 위한 샘플을 준비하기 위해 Rex 및 크랙에 대한 튜브와 TCR 알파 상수에 대한 두 개의 별도 튜브를 사용하여 다음과 같은 방식으로 분석할 각 샘플에 대해 최소 2개의 반복을 포함하는 PCR 플레이트를 준비합니다.필요한 총 웰 수에 대해 마스터 믹스를 준비합니다. 플레이트의 웰에 20 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 말초 혈액 단핵 세포 또는 P BMC에서 추출한 5마이크로리터의 게놈 DNA를 추가합니다.반응 플레이트를 밀봉하기 위해 광학 접착 커버를 사용하기 전에 템플릿이 없는 제어 웰에 5마이크로리터의 물을 추가합니다. 그런 다음 플라스미드 DNA 표준 곡선 희석을 해동하고 가장 높은 희석액을 준비합니다. 행 A부터 H까지와 열 1부터 4까지 사이에 있는 웰만 찾아냅니다.그리고 짧은 와류 후에, 각 희석 점의 5 마이크로 리터를 지정된 것에 추가하십시오. 글쎄, 우물 바닥에 거품이 없고 시약이 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. Real-Time PCR 시스템을 사용하여 다음 프로토콜로 분석을 실행합니다.섭씨 50도에서 2분간 가열하고 섭씨 95도에서 10분 동안 처음 가열한 후 섭씨 95도에서 15초 동안 45회 변성합니다. 그리고 결합 된 프라이머 프로브 e 무릎 꿇고 섭씨 60도에서 1 분 동안 신장합니다. 실시간 PCR 데이터를 분석하려면 소프트웨어에서 저장된 결과 파일을 열고 창 상단의 결과 탭을 클릭합니다.분석 메뉴를 클릭하고 분석 설정을 선택합니다. 소프트웨어가 모든 검출기를 선택하고 임계값 주기에 대한 자동 CT를 선택하여 임계값을 자동으로 결정하도록 합니다. 소프트웨어가 기본적으로 배경 제거를 위한 자동 기준선을 설정하도록 합니다.amplification plot이라는 탭을 클릭하고 창의 가장 오른쪽에 있는 해당 드롭다운 메뉴에서 세 개의 검출기 중 하나를 선택합니다. 바로 아래, 수동 CT를 선택하여 창 하단에서 임계값을 수동으로 설정하고, 선택한 검출기의 표준 곡선 희석점에 해당하는 웰을 선택하고 테이블의 해당 셀 위로 마우스를 클릭하고 드래그하여 증폭 플롯을 표시합니다. 임계값을 수동으로 조정하려면 빨간색 임계값 선을 위아래로 끈 다음 analyze(분석)를 클릭하여 결과를 다시 분석합니다.임계값 설정이 결과에 어떤 영향을 미치는지 확인하려면 보고서 탭을 선택하고 각 표준 곡선 희석점의 결과 CT를 확인하십시오. 증폭 플롯 탭에서 최적의 배치를 얻기 위해 임계값을 이동할 때 임계값이 배경 노이즈보다 충분히 높지만 고원 위상 아래에 있는 지수 증폭 영역에 있는지 확인합니다. 증폭 플롯이 로그 스케일로 표시되지 않으면 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 그래프 설정을 불러오고 실행 후 Y ais 설정을 로그로 설정합니다.플롯의 선형 부분에서 임계값을 중간에 설정하고 서로 거의 평행한 증폭 곡선을 관찰합니다. 보고서 탭을 클릭하면 CT 결과를 볼 수 있습니다. 분계점 배치가 각 표준 곡선의 두 반복실험의 정밀도를 최대화하는 결과를 생성했는지 확인합니다.희석 점. 임계값이 보고서 탭 아래에 있는 표준 곡선 희석점의 극한 크기 순서를 가장 잘 반영하는 지점에 배치되어 있는지 확인합니다. 창의 아래쪽 부분에 있는 표에서 마우스를 다시 드래그하여 표준 곡선의 웰에 해당하는 셀을 선택합니다.모든 검출기에 대해 세 표적의 결과 CT가 동일한 희석 지점에서 매우 유사한지 확인합니다.예를 들어, 0.5 CT 이하의 차이는 필요한 경우 임계값을 재조정하고 창 아래쪽의 보고서 탭에서 다시 확인합니다. NTC 웰을 선택하고 CT가 결정되지 않음에 해당하는 NTC 웰에 증폭이 없는지 확인합니다. 표준 곡선 탭을 선택하고 그림 창 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 검출기를 선택하고 보고된 표준 곡선 기울기 범위가 91에서 100%의 PCR 효율에 해당하는 음수 3.55에서 음수 3.32 사이인지 확인합니다. 기울기 및 절편 바로 아래의 값을 확인하여 결정 계수 또는 R 제곱이 0.998보다 높은지 확인합니다.보고서 탭을 클릭하고 차트 아래 표의 해당 셀에서 양성 대조군의 CT가 동일한 알려진 양성 대조군에 대한 이전 분석 결과와 일치하는지 확인합니다. 파일 메뉴를 클릭하고 저장한 다음 CSV 파일로 내보내 쉼표로 구분된 값이 포함된 텍스트 파일의 모든 웰 수량을 내보냅니다. 마지막으로 스프레드시트 소프트웨어에서 CSV 파일을 가져오고 다음 공식을 적절하게 설정하여 6개의 PBM에 대한 10당 트랙 수 또는 수정 수를 계산합니다.이 비디오에 설명된 분석은 87개의 건강한 대조군의 대표 샘플에 대해 수행되었습니다. 0세에서 17세 사이의 어린이 42명과 24세에서 60세 사이의 성인 45명. 여기에서 볼 수 있듯이, 성인의 경우 흉선 침범으로 인해 나이가 들면서 트레킹 횟수가 0년에서 3년에서 4년으로 급격히 감소했습니다.트레킹 횟수는 여성보다 남성에서 더 빠르게 감소하기 때문에 성별에 따라 달라지며, 이는 적절한 참조 범위를 설정하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 이 그래프는 나이가 들면서 균열 수가 감소했음을 보여주는데, 이는 T TREX에서 볼 수 있는 패턴과 유사하게 어린이에서만 볼 수 있습니다. 반면 성인의 경우 골수 배출량은 평생 동안 상당히 안정적이며 성별에 의존하지 않습니다.인서트 플라스미드 준비에서 트리플은 약 2-3주가 소요되지만, 그 후 저장된 플라스미드 할당은 3년 동안 지속됩니다. 이 기술의 나머지 부분은 적절하게 수행되면 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 DNA 교차 오염을 피하기 위해 전용 영역에서 모든 플라스미드 관련 조작을 수행하는 것이 매우 중요합니다.또한 개발 후 결과를 분석할 때 표준 튜브의 안정성을 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 임상 면역학 또는 혈액학 분야의 연구자들에게 골수 이식 후 면역 재구성의 결과를 모니터링하거나 단순히 림프구 항상성을 연구하기 위해 원발성 면역 결핍을 식별하기 위한 개선된 도구를 제공했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 플라스미드에서 트리플을 얻고, 표준 곡선을 준비하고, Realtime PCR 실험을 실행하고, trax 및 균열의 재현 가능한 절대 정량화를 얻는 데 필요한 계산을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

Synthetic Yeast Genome 프로젝트인 Sc2.0의 디자이너 염색체는 존재/부재 종말점이 있는 PCRTagging이라는 PCR 기반 유전형 분석 분석을 사용하여 네이티브 염색체와 구별할 수 있습니다. 여기에서는 PCRTag 유전형 분석을 위한 고처리량 Real-Time PCR 검출 방법에 대해 설명합니다.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

여기에서 우리는 정량적 PCR (qPCR)를 사용하여 검출된 후생유전학 서명을 통해 면역 세포 정체성 및 순도를 결정하는 강력한 방법을 기술합니다. 특정 궤적에서의 DNA 탈메틸화는 특정 세포 유형에 대한 고유 식별자역할을 하며 CD8+, 조절 또는 Th17 T 세포의 식별을 허용합니다.

후성유전학 기반 정량적 PCR을 이용한 면역 세포 정체성 및 순도 측정

현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.

차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

학습하세요 TREC와 KREC 동시 정량 방법으로 실시간 PCR을 이용하여 흉선과 골수 기능을 평가하는 면역학 연구 기법입니다. 소량 혈액 샘플로도 정확한 면역 세포 생성량 분석이 가능합니다.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

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