Name: 라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 마우스 귀 뒤 수술 접근법을 통해 라운드 창 멤브레인으로 바이러스를 직접 주입하는 유전자 치료 기법을. 이 방법은 출혈과 사망률을 최소화하여 청각 회복과 형질 전환 단백질 발현을 평가할 수 있게 합니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R21 보조금과 청력 연구(Hearing Research, Incorporated)의 보조금으로 지원됩니다.

참고 : NIH 윤리 지침과 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회, 샌프란시스코의 승인 프로토콜 요구 사항을 준수 모든 절차와 동물 취급. 1. 수술에 대한 동물 준비 <ol><li> 깨끗하고 전용 공간에서 수술을 수행하십시오. 수술 전에 유리 비드 살균기로 살균, 모든 수술 도구를 압력솥. 참고 :이 프로토콜에서 출생 후의 일을 10 ~ 12 (P10-12) FVB 마우스를 사용합니다. 다양한 연령 및 생쥐 균주는 특정 프로젝트의 요구를 충족시키기 위해 사용될 수있다. 수포 뼈 어렵게 가져 오기 때문에 P40보다 오래된 마우스는 어려울 수 있습니다. </li><li> 케타민 하이드로 클로라이드 (100 ㎎ / kg), 자일 라진 하이드로 클로라이드 (10 ㎎ / kg), 및 아세 프로 마진 (/ kg 2 mg)의 혼합물을 복강 내 주사로 마우스를 마취. 동물이 더 이상 이러한 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응 후에 수술 준비를 시작합니다. 만약 necessarY는 원래 평면 마취제를 복원 마취제 칵테일 접종 (1/5 원래 투여) 투여. 참고 :이 나이에 관찰 된 사망률의 대부분이 마취제 과다 복용에 의해 발생하기 때문에이 단계에서주의하십시오. </li><li> 동물의 깜빡임을 억제, 마취 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 보호 안과 연고와 동물의 눈을 감아 라. </li><li> 마우스가 완전히 깨어 때까지 마취 후 저체온증을 방지하기 위해, 절차 전반에 걸쳐 가열 패드에 확장 목 마우스를 놓습니다. </li><li> 클리퍼와 왼쪽 포스트 귀의 지역을 면도 및 수술 조작 전에 70 %의 에탄올과 포비돈 - 요오드 소독. </li></ol> 2. 수술 및 벡터 주입 <ol><li> 고막 수포를 노출 후 귀의 접근 방식을 사용합니다. 포스트 귀의 근육을 노출 작은 가위와 피하 조직을 절개. 지방 조직을 수축하는 토륨 후절개의 전자 후방 측은 측두골을 노출 수직 절개 좌우로 근육을 분리. 이 절개가 적절한 시각화 편안하게 작업 할 수있을만큼 긴 있는지 확인하십시오. </li><li> 25 G 바늘 고막 수포를 관통하고 달팽이관의 기저 차례에 액세스 할 수 있도록 다시 뼈를 박리함으로써 집게와 필요에 따라 구멍을 확장 한 다음 stapedial 동맥과 둥근 창 막을 시각화하기 위해 충분히 확대 (RWM) . </li><li> 보로 실리케이트 모세관 피펫 중앙에 부드럽게 RWM에 구멍. 이 시점에서 RWM를 통해 유체 유출을 준수; 이것은 정상입니다. 유출이 안정 될 때까지 기다립니다 (달팽이관에서 effluxed 유체는 멸균 여과지로 건조). 참고 : 잡고 RWM 천공이 가능한 한 작게되도록 유리 바늘을 전진 할 때주의하십시오. 사용되는 현미경에 따라, 피펫이 피펫을 사용하여 미세 조작기를 사용하거나 손으로 잡고홀더. </li><li> 같은 방법으로 패치 클램프 피펫을 준비 끌어 당기는 피펫을 사용하여 주입 피펫을 준비합니다. 팁 직경이 큰 (약 15 μm의 직경) 아웃 바이러스를 피펫 팅과 것은 쉽게 수행되도록 있는지 확인합니다. </li><li> 주입 피펫에 AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 또는 AAV2-GFP의 1 ~ 2 μL를 그립니다. 유출은 (5 ~ 10 분) 안정화, microinject 같은 구멍을 통해 스칼라 고실에이 고정 볼륨이 이전에 RWM에서 만든 후. </li><li> 근육의 작은 플러그 피펫을 잡아 당겨 후 신속하게 RW 틈새를 밀봉 둥근 창에서 누설을 방지하기 위해 근육에 배치 조직 접착제의 작은 방울로 고정합니다. 참고 : 아주 잘 바늘 달팽이관 -이 단계에서 어떤 외 림프 누출을 방지하기 위해 근육의 작은 플러그를 제거한 후이 구멍을 밀봉 청력을 보존하는 것이 중요합니다. 밀봉하지 않으면 완전히 RWM은 시간이 지남에 따라 청력 손실을 발생합니다. </li><li> 주입 후, 커버지방 조직과 청각 수포 구멍은, 정상 위치로 포스트 귀의 근육과 지방 조직을 반환하고 6-0 이하 흡수 크롬 봉합 층에 상처를 봉합. </li><li> 포비돈 - 요오드 상처를 소독. </li></ol> 3. 수술 후 케어 <ol><li> 따뜻한 새장에 마우스를 놓고 그들이 완전히 다시 어머니와 함께으로 이동 회복이 될 때까지 방치하지 않습니다. 이 어머니와 함께 다시 새끼를 착용하기 전에 케이지에서 남성을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> 염증과 통증을 관리하는 피하 카프로 펜 수술 후 통증, 3 일에 한 번씩 24 시간 (2 ㎎ / ㎏)을 관리합니다. 고통, 이상 체중 감소, 통증, 또는 감염의 흔적을 매일 동물을 모니터링합니다. 일반적으로 모든 마우스가 정상적으로 작동해야 수술 후 3 일째에 의해. 고통 또는 질병의 흔적은 3 차 하루 마우스에 표시하는 경우, t를 안락사 고려제도적 지침에 따라 그는 마우스. </li></ol> 청성 뇌간 반응 (ABR) 녹음을 사용하여 바이러스 성 납품 후 인공 와우 기능 4. 평가 참고 : 청성 뇌간 반응 (ABR)이 청각 두피 아래에 배치 전극을 통해 뇌에 지속적인 전기 활동에서 추출 기록 잠재력을 유발합니다. 동물 소리로 자극한다. 그 결과 기록은 청각 자극의 발병 후 첫 10 밀리의 청각 경로에서 연속 점의 전기적 활동을 반영 다섯 파도로 구성되어 있습니다. <ol><li> 아세 프로 마진이없는 것을 제외하고,이 프로토콜의 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 케타민 하이드로 클로라이드 및 자일 라진 하이드로 클로라이드의 혼합물을 복강 내 주사에 의해 생쥐를 마취. </li><li> 마우스가 완전히 깨어 때까지 마취 후 저체온증을 방지하기 위해, 청력 검사를 통해 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 참고 : 사용이 실험에서 다음과 같은 소리 자극 : (31 Hz에서 프리젠 테이션 속도 5 밀리 초 시간)을 클릭합니다. </li><li> 왼쪽 귀 (참조)의 날개 아래에 정점에 피하 주사 바늘 전극을 놓고 반대쪽 귀 아래 (접지)과 이전에 방음 실 (27, 28)에 설명 된대로 기록 ABRS를 시작합니다. 아래에서 최대 진폭 5dB 음압 레벨 간격으로 기록 ABR 파형. </li><li> ABR 임계 값 수술 후 빠르면 4 일 정도의 바이러스 배달 후 결정 참고 : 임계 값 파도에 대한 피크은 응답하는 가장 낮은 자극 수준으로 정의된다 I-V 분명히했다 및 육안 검사에 반복적으로 존재. </li><li> 나는 인공 와우 신경의 활동을 분석하는 웨이브를 측정한다. ABR 검출 파형을 산출 자극 최저 레벨은 임계 값으로 정의된다. </li></ol> 면역 형광을 사용하여 5. 달팽이 형질 전환 유전자의 단백질 발현 <ol><li> intrap의 과다 복용에 의해 생쥐를 마취케타민과 염산 자일 라진 하이드로 클로라이드의 혼합물을 주입 eritoneal는 아세 프로 마진이없는 것을 제외하고,이 프로토콜의 섹션 1.2에 기재된 바와 같이. </li><li> 동물이 더 이상 이러한 발가락 핀치와 같은 고통스러운 자극에 반응 후에 머리를 목을 벨. </li><li> 26 설명 된대로 전체 마운트 면역을 위해 밖으로 및 프로세스 cochleae을 해부하다. 안티 VGLUT3 및 안티 7A 미오신 항체를 사용하여 전체 인공 실장 면역 형광 상세한 프로토콜은 에이 킬 등., 2013 (29)에 기재되어있다. </li><li> 250 희석 : GFP 라벨의 경우, 1에서 토끼 방지 GFP 항체 4 ° C에서 하룻밤 인공 와우 전체 마운트를 품어. </li><li> PBS에서 4,000 : PBS와 10 분 동안 두 번 cochleae 헹구어 낸 후 CY2에 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 2 시간 동안 배양 1 희석. </li><li> 10 분 동안 두 번 PBS와 cochleae을 씻어 15 분 동안 DAPI으로 그들을 품어. </li><li> 유리 슬라이드에 cochleae을 마운트하고 싶게을 관찰공 초점 면역 형광 현미경을 어. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

본 연구에서는 상세히 복원하거나 유전자 결함에 의해 훼손되어 정상 청각 기능을 구출하기위한 목적으로, 인공 유전자 치료에 사용될 수있는 기술을 설명한다. 그것은 전형적 외상성이므로,이 방법은 인공 유전자 전달 분자 또는 기타 잠재적 인 치료 (30)에 안전하다. 인공 와우 치료를위한 다른 접근 방법은 복부 접근 (24), 마우스와 기니 돼지 cochleostomy (31, 32) 및 림프 낭 배달 (33)를 포함하여 설명 하였다. 우리의 경험에 의하면, 후 귀의 접근 방식은 빠르고, 간단하고, 감소 된 부상과 동물의 사망률. 또한, 포스트 귀의 접근 방식은 외상의 가능성도 줄어들고 34,35,36 청각 관련 손실 RWM의 개선 된 시각화를 제공합니다. 이 보고서는 일에 AAV1-VGLUT3의 전달을 보여줌으로써 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 기술적 측면과 유틸리티를 문서화VGLUT3 및 GFP (그림 1과 그...

유전자 치료는 긴 유전 청력 손실에 대한 잠재적 인 치료로 제안했지만,이 지역에서의 성공은 1 애매 남아있다. 현재까지 바이러스로 매개 방법론은 상대적으로 접근 할 수없는 달팽이관 내의 특정 세포 유형을 대상으로 이론적 능력 때문에 지배적했다. 모두 아데노 바이러스 (AV) 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)는 인공 유전자 전달에 사용되어왔다. AAVs는 여러 이유로 달팽이관에서 유리하다. 그들은 복제 결핍 바이러스이고 효율적으로 신경 세포, 청력 손실의 원인의 수에 대한 중요한 목표를 포함한 다양한 종류의 세포로 형질 전환 분자를 전송할 수 있습니다. 셀에 AAV 항목은 특정 수용체 2에 의해 매개된다 세포 유형이되도록 형질 도입에 따라서, 특정 혈청 형의 선택은 호환되어야한다. AAVs 효과적으로 유모 세포를 형질 감염 3 및 TRA의 안정된 장기 발현 결과, 숙주 게놈 내로 통합 할nsgenic 단백질과 세포 4 표현형 변화. 이러한 모발 세포 재생 단기 애플리케이션에 반드시 유리한 반면, 장기적 발현 유전자 결함을 안정된 구조에 매우 중요하다. AAVs 임의의 인간 질병 또는 감염과 관련된 어떠한 5,6,7- 내이 신경 독성을 증명하지 않으므로, 손실 8 청력 상속 형태의 유전자 치료에 사용하기위한 이상적인 후보이다. 바이러스 벡터를 사용하여 포유류 내이 내로 외인성 유전 물질의 전사는 지난 10 년간 연구되어 손실 9 청력 유전자와 형태 모두 취득을 치료하기위한 유망한 기술로서 떠오르고있다. 달팽이관 잠재적 여러 가지 이유로 유전자 치료에 이상적인 대상이다 : 작은 부피 필요한 바이러스의 제한된 양을 필요 1); 다른 기관계 제한 부작용 2) 상대적 격리; 및 3)는 유체 충전식 챔버 바이러스 용이미로 10, 11,12,13,14, 15에 걸쳐 배달. 선천성 청각 장애의 마우스 모델은 체계적, 복제 방법으로 내이의 개발을 모니터링하는 연구의 많은 방법을 사용 할 수 있습니다. 마우스 cochleae의 작은 크기는 약간의 수술 어려움을 제시 않지만, 마우스가 다른 종 (16)에 비해 여러 가지 실험적인 장점 유전 청력 손실의 연구에 매우 중요한 모델 역할을합니다. 마우스 모델은 유전자 연관 분석, 상세한 형태 학적 관찰의 수집 및 병원성 시나리오를 시뮬레이션을 통해 특성의 범위의 평가를 허용; 같은, 그들은 바이러스로 매개 유전자 치료에 대한 좋은 후보입니다. 기술적 진보와 함께 생쥐에서의 광범위한 유전 연구는 실험실 가능한 17,18, 19, 20, 21에 걸쳐 재현 가능한 방식으로 유전자 변형 마우스를 생성하도록 만들었다. Furthermor모두 취득이 동물 모델 22, 23, 24에서 엄격한 테스트를 허용, 마우스의 청력 손실 표현형을 상속에 대한 전자, 다양한 모델이 존재한다. 따라서, 마우스 모델에서 바이러스로 매개 유전자 치료를 사용하여 청력을 보정하는 것은 인간의 질병에 대한 치료법에 대한 검색에 적절한 첫 번째 단계입니다. 우리는 이전에 수 포성 글루타메이트 트랜스 포터 3 (VGLUT3를) 부족 형질 전환 마우스 인해 IHC 리본 시냅스 (25)에서의 글루타메이트 방출의 부족으로 청각 장애인을 태어나는 것으로 나타났습니다. 이 돌연변이는 감각 유모 세포의 주요 퇴보로 이어질하지 않기 때문에, 이러한 돌연변이 생쥐는 잠재적으로 선천성 난청 인공 유전자 치료를 테스트하기에 훌륭한 모델입니다. 현재까지, 인공 유전자 치료 용 바이러스 전달 다수의 기술을 통해 라운드 cochleostomy 윈도우 확산 막, 둥근 막 윈도우 주입 및 전달을 포함하여 설명되었다. 강력한있다원점이라 장점들 및 이러한 방법 (9)의 각각의 단점. 여기에서 우리는 둥근 창 막 (RWM)를 통해 VGLUT3 KO 마우스 내 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법을보고한다. 포스트 귀의 RWM 주입 방법은 우수한 청각 보존과 최소 침습적이며, 비교적 빠르다. 우리가 이전에 게시 한 바와 같이,이 마우스 모델에서 청각 복원하기위한 노력의 일환으로, VGLUT3 유전자 (AAV1-VGLUT3)를 들고 AAV1 벡터는 출생 후 12 일에이 청각 장애 생쥐의 달팽이관에 도입되었다 (P! @), 결과 26 청력의 회복. 트랜스 유전자의 단백질 발현이 면역 형광 (IF)를 사용하여 확인하면서 VGLUT3 KO 마우스에서 보청기는 청각 뇌간 반응 (ABR)에 의해 확인되었다. 따라서이 방법론은 바이럴 - 매개 유전자 치료하고자 달리 난청 결과 유전자 결함을 보정 할 수 있다는 점을 입증 해 보여준다.

<table><tbody><tr><td>케타민</td><td>버틀러 Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제공 Carprofen 진통제</td><td>UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제공 Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손 안과 연고 (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>발열 패드</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세관 피펫</td><td>World Precision Instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 PDS*plus 항균</td><td>에티콘</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>조직 접착제 (Vetcode)</td><td>버틀러 샤인</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티-GFP 항체</td><td>인비트로젠</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>플레밍/브라운 마이크로피펫&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>풀러 모델 P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT BioSig III 시스템&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; 터커-데이비스 테크놀로지스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

감각 신경성 난청의 기능 회복을 달성하기 위해 사용되는 유전자 치료는 청력 손실에 기여하는 기본 분자 유전 메커니즘의 이해를 부여 할 것을 약속드립니다. 내이 (內耳)에 벡터의 도입은 기존의 구조에 손상을 최소화하면서 널리 달팽이관을 통해 에이전트를 배포하는 방법으로 수행해야합니다. 이 원고는 분자, 약물 및 마우스 출생 후의 일 10 라운드 창 막 (RWM)를 통해 이전에 바이러스 성 전달을 사용하여 마우스 와우 치료에 사용할 수있는 포스트 귀의 수술 방법을 설명합니다. 혈액 손실을 최소화하고 동물의 사망률을 피하면서이 수술 방법은 스칼라 고실에 신속하고 직접 전달할 수 있습니다. 이 기술은 필수적인 내부 및 중이의 구조뿐만 아니라 목 근육 완전히 청력을 유지하면서 무시할 또는 전혀 손상을 포함한다. 이 수술 기법, 소낭 glutam의 효능을 설명하기 위해3 녹아웃 (VGLUT3 KO) 마우스가 아데노 관련 바이러스 (AAV-1)를 사용하여 내 귀에 VGLUT3의 출산 후 청각 복구 선천성 청각 장애의 마우스 모델의 예로서 사용되는 수송을 먹었다.

기술적 특징과 인공 분자 치료 후 귀의 접근 방식의 유틸리티를 확인하려면 AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP 및 AAV2-GFP는 RWM를 통해 P10-12 마우스 내이 (內耳)에 전달했다. 이 방법은 내부 유모 세포 내에서 성공적으로 유전자 발현을 보여줍니다 (IHC) (VGLUT3 그림 1과 GFP 그림 2와 GFP 그림 3A), 외부 유모 세포 (OHC) (GFP 그림 2)와 지원 세포 (GFP 그림 2와 그림 3A) (26) 코르티 손상의 중요한 기관이없는. 인공 전체 마운트 면역 형광 이미지 (도 2 및도 3a)에서 본 GFP를 발현하는 다른 형태의 세포 관찰 한 AAV 혈청 형의 선택은 형질 도입되는 세포 유형과 호환 가능해야한다는 것을 보여준다.도 2 및도 3a도 1을 (2...

설명된 귀 후 수술 접근법은 출혈과 동물 폐사를 최소화하면서 쥐의 달팽이관 스칼라 고막으로 빠르고 직접 전달할 수 있습니다. 이 방법은 둥근 창막을 통해 출생 후 마우스에게 분자, 약리학 및 바이러스 전달을 사용하는 달팽이관 치료에 사용할 수 있습니다.

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

이 절차의 전반적인 목표는 둥근 창막을 통해 쥐 달팽이관 S 비늘 timi로 바이러스를 빠르고 직접 전달할 수 있는 이삭후 수술 방법을 설명하는 것입니다. 이것은 먼저 고막 수포를 노출시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 조직에 천공을 하고 부동맥과 둥근 창막을 시각화합니다.그런 다음 둥근 창문 막에 구멍을 뚫고 바이러스를 스폰에 주입합니다. 마지막 단계에서 구멍이 밀봉됩니다. 궁극적으로, 전이유전자 단백질의 발현과 동물의 청력 회복은 각각 면역형광 현미경 검사와 청각 뇌간 반응의 측정으로 평가할 수 있습니다.달팽이관, 장루, 복부 접근법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 사후 원형 창막 주입이 상대적으로 빠르고 최소 침습적이며, 더 많은 양의 주입이 가능하며, 달팽이관 전체에 걸쳐 다양한 세포의 광범위한 transfection을 촉진한다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 절차가 달팽이관의 해부학적 구조에 대한 철저한 이해에 크게 의존하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 발가락으로 마취를 확인한 후 왼쪽 귀 후 부위를 꼬집어 면도하고 산후 일의 피부를 소독하고 10-12 마리의 마우스를 70 % 에탄올과 포비돈 요오드로 소독합니다.그런 다음 보호용 안과 연고로 눈을 가리고 목을 뻗은 동물을 발열 패드에 올려 놓습니다. 수술 준비가 완료되면 작은 가위로 피하 조직을 절개하여 이강후 근육을 노출시킵니다. 지방 조직을 절개 부위 뒤쪽으로 후퇴시킨 후 절개 부위에 수직으로 오른쪽과 왼쪽 근육을 분리합니다.측두골을 노출시키려면 25게이지 바늘을 사용하여 고막에 구멍을 뚫고, 필요에 따라 집게로 뼈를 벗겨내어 구멍을 확장하고 달팽이관의 기저부 회전에 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 스테드 동맥과 둥근 창 막을 시각화할 수 있도록 구멍을 충분히 넓힙니다. 둥근 창 막의 중앙을 burro silicate, 모세관 피펫으로 부드럽게 뚫습니다.멸균 여과지로 둥근 창 멤브레인을 말리십시오. 그런 다음 이 단계에서 유체 e 플럭스가 안정화될 때까지 5-10분 동안 기다립니다. 피펫을 잡고 전진시킬 때 둥근 창 멤브레인 천공을 가능한 한 작게 만들도록주의하십시오.현미경 사용에 따라 피펫은 손으로 잡거나 미크론 조작기로 잡을 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 현미경이 마우스에 너무 가까워 마이크로 매니퓰레이터를 사용할 수 없기 때문에 피펫을 손으로 잡고 있습니다. 이제 1-2 마이크로 리터의 바이러스를 15 마이크로 미터 직경의 팁이있는 당겨진 유리 피펫에 넣고 이전에 둥근 창 막에 만든 것과 동일한 구멍을 통해 티모니 스케일에 바이러스를 마이크로 주입합니다.그런 다음 피펫을 꺼내고 작은 근육 플러그로 둥근 창 틈새를 빠르게 밀봉하고 작은 조직 접착제 한 방울로 고정합니다. 이치수포의 구멍을 지방 조직으로 덮고 이치후 근육과 지방 조직을 정상 위치로 되돌립니다. 그런 다음 6.0 이하의 흡수성 크롬 봉합사를 사용하여 상처를 봉합하고 절개 부위를 포비돈 요오드로 소독합니다.그런 다음 마우스를 따뜻한 케이지에 넣고 매일 모니터링하여 완전히 회복된 후 팝을 어미에게 돌려줍니다. 바이러스 전달 후 빠르면 4일 후에 달팽이관 기능을 평가하려면 진정제를 투여한 동물을 발열 패드에 올려 놓은 다음 왼쪽 귀의 귓바퀴 아래 꼭지점과 반대쪽 귀 아래의 꼭지점에 피하 바늘 전극을 놓습니다. 마지막으로, 앞서 설명한 대로 방음실에서 청각 뇌간 반응 또는 BR을 기록하기 시작하고, 달팽이관 구멍 마운트에서 볼 수 있는 달팽이관 신경의 활동을 분석하기 위해 1파를 측정합니다.이 접근법은 COR T 손상의 심각한 장기가 없는 내부 유모 세포, 외부 유모 세포 및 지지 세포 내에서 성공적인 이식유전자 발현을 보여주며, 달팽이관 구멍에서 GFP를 발현하는 다양한 세포 유형을 관찰할 수 있습니다. 마운트는 아데노 관련 바이러스 혈청형의 선택이 형질도입할 세포 유형과 호환되어야 함을 보여줍니다. 형질 주입되는 세포의 수는 농도와 바이러스가 주입한 양에 따라 다릅니다.이 경우, 0.6에서 1마이크로리터로의 증가는 야생형 V 둔근 3 전이유전자 발현과 유사한 수준으로 형질주입된 세포의 수를 증가시키는 결과를 낳았고, 여기 에서 볼 수 있듯이, V gl three 녹아웃 마우스의 내이로의 V GL 3 바이러스의 귀후 원형 창 막 전달의 효과가 청력 구조에 미치는 영향이 입증되었습니다. 그래프. A BR 흔적은 VLU에서 복원되었으며, 야생형 마우스에서 볼 수 있는 것과 유사한 임계값에 도달한 구조된 녹아웃 마우스 3마리가 복원되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 목 근육뿐만 아니라 내이 및 중이 구조의 손상을 방지하기 위해 각 단계에 시간을 할애하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 둥근 바람막을 통해 MAs re 골격 팬에 분자 약리학적 바이러스 실험 치료를 전달하기 위한 수술 후 접근 방식을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

출처: Kozin, E. D., et.al. 청각 경로의 광유전학적 자극을 위한 쥐 등쪽 달팽이관 핵의 직접 시각화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 빛 유도 청각 자극을 가능하게 하기 위해 마우스 등쪽 달팽이관 핵(DCN)으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 보여줍니다. 빛에 민감한 이온 채널인 옵신을 암호화하는 바이러스 벡터는 직접 접근을 위해 개두술 및 소뇌 흡인 후 DCN에 주입됩니다. 발현된 옵신은 뉴런이 빛에 의해 활성화될 수 있도록 하여 광유전학을 사용하여 청각 경로 반응을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

빛 유도 청각 자극을 위한 마우스 등쪽 달팽이관 핵으로의 바이러스 매개 유전자 전달

이 비디오는 청력과 전정 기능의 손상을 최소화하면서 반고리관을 통해 쥐의 내이로 국소 약물을 전달할 수 있는 절차인 이관절개술을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 바이러스 벡터, 의약품 및 소분자를 마우스의 내이에 접종할 수 있습니다.

성체 쥐의 내이(inner ear of a adult mouse)로의 국소 약물 전달을 위한 관절개술(canalostomy for local drug delivery into the inner ear of a adult mouse)

출처: Akil, O., et al., 둥근 창막을 통해 마우스 내이에 바이러스 매개 유전자 전달을 위한 수술 방법. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 유전적 난청이 있는 쥐 강아지의 내이에 치료 유전자를 전달하는 절차를 보여줍니다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 유전자를 둥근 창막을 통해 주입하여 바이러스 입자가 유모 세포에 들어가 글루타메이트 수송체 생성을 회복하고 뇌에 대한 소리 신호를 재설정할 수 있도록 합니다.

마우스 모델에서 청력 회복을 위한 바이러스 벡터 기반 유전자 치료

동물 모델의 달팽이관에 이독성 물질을 도입하는 다양한 방법이 있습니다. 제시된 것은 이독성 물질을 둥근 창 틈새에 전달하기 위한 수술 프로토콜입니다. 이 절차는 신뢰할 수 있고, 표적화된 달팽이관 내 병변을 생성하며, 마이크로아키텍처에 대한 기계적 손상을 방지합니다. 달팽이관 자가 수리/재생에 대한 검사가 가능합니다.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

내이로의 국소 약물 전달을 위한 두 가지 미세수술 접근법이 여기에 설명되어 있으며 청력 매개변수, 달팽이관 세포 구조 및 염증 마커 발현에 미치는 영향 측면에서 비교됩니다.

마우스 내부 귀를 대상으로 약물 전달 방법의 비교 연구 : Bullostomy 대 Transtympanic 주입

우리는 둥근 창 막 통해 비 인간 영장류, 일반적인 마모 셋 (Callithrix jacchus)의 내가 약물을 관리 하는 수술 방법을 보고 합니다.

비 인간 영장류 일반 비단 (Callithrix jacchus)에서 내가 의약품의 관리에 대 한 수술

이 연구에서 우리 신생아 쥐에 있는 내가 유전자 납품에 대 한 신뢰할 수 있는 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다.

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

여기는 청각 및 vestibular 함수에 최소 손상 반원의 운하를 통해 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달 수 있는 canalostomy 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 마우스 내가 바이러스 성 벡터, 제약, 그리고 작은 분자를 접종을 사용할 수 있습니다.

성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

배우세요 마우스 귀 뒤 수술 접근법을 통해 라운드 창 멤브레인으로 바이러스를 직접 주입하는 유전자 치료 기법을. 이 방법은 출혈과 사망률을 최소화하여 청각 회복과 형질 전환 단백질 발현을 평가할 수 있게 합니다.

라운드 창 멤브레인을 통해 마우스 내부 귀에 바이러스로 매개 유전자 전달을위한 수술 방법

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