대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

다음 실험의 전반적인 목표는 작용제 또는 길항제의 첨가에 따른 식세포 과정의 변화 또는 중합 작용의 변화를 정량화하는 것입니다. 이는 형광 표지된 입자를 식세포 세포에 추가하고 식세포작용이 일어날 수 있는 충분한 시간을 허용함으로써 달성됩니다. 식세포작용(phagocytosis)을 막기 위한 두 번째 단계로, 세포는 내재화되지 않은 입자의 형광을 소멸시키기 위해 트리암 블루(triam blue)로 처리하고, 세척한 후 파라알데히드로 고정합니다.

다음은 염색 및 정량화입니다. DPI 또는 actin으로 유지되는 세포와 입자의 형광 검출을 용이하게 하기 위해 결과는 형광 측정을 기반으로 녹색 적색 형광과 청색 비율을 통해 정량화된 대로 식균작용 및 액틴 중합에 대한 처리의 효과를 보여줍니다. 기존 방법에 비해 fluoro metric technique의 주요 장점은 phagocytosis를 평가하기 위한 고처리량 비용 효율적인 방법이라는 것입니다.

이를 통해 시료 조작을 최소화하고 세포당 형광 강도를 빠르게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 면역학 및 세포 생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 이 병원체 제거가 얼마나 효과적이며 얼마나 빠른지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 작용 중합은 식세포작용 중 변화하며 식세포작용 또는 축삭 중합은 작용제 또는 길항제에 의해 어떻게 조절됩니다.

절차 플레이트를 시작하기 위해, 바닥이 투명하거나 검은색인 96웰 플레이트에 있는 Murine J 7 74 세포주에서 추출한 대식세포는 부착 세포를 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양하여 플레이트에 아디온이 도달할 수 있도록 합니다. 그런 다음 원하는 작용제 또는 길항제 또는 비히클 제어를 50마이크로리터의 PBS 또는 보충된 배지에 2배 농도로 세포에 추가하고 원하는 시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 형광 입자와 라벨이 가공, 세척 및 배양 중에 항상 빛으로부터 보호되는지 확인합니다.

광표백을 방지하기 위해 형광 표지된 dextra 비드와 같은 현탁액의 입자를 1분 동안 원액을 오렉스합니다. 다음으로, 형광 입자에 동일한 양의 옵소니징 시약을 넣고 1분 더 격렬하게 소용돌이칩니다. 그 후, 입자를 5분 동안 배양 원심분리 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 혼합물을 배양했다.

500 회 G. 과도한 옵소니징 시약을 포함하는 S 상등액을 제거합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS로 입자를 씻으십시오. 펠릿을 refuse에 검체를 refuse 및 times에 500의 5 분 동안 원심 분리하십시오 G. 결합되지 않은 항체의 적당한 최적화 그리고 제거를 확신하기 위하여 이 단계를 2 번 더 반복하십시오.

이온화 된 입자의 작업 용액을 준비하려면 입자를 5 밀리리터의 매체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 더 사용할 때까지 빛에서 멀리 보관하십시오. 이제 입자의 작업 용액을 멸균 시약 저장소에 놓습니다.

50마이크로리터의 옵소니즈 입자를 이전에 준비한 세포에 최종 농도인 밀리리터당 15나노그램으로 추가하고 표준 세포 배양 조건에서 식세포작용이 일어나도록 합니다. 연속 식균작용 방법의 경우 형광 입자가 웰 바닥에 도달하여 세포와 접촉할 때까지 30분에서 1시간 정도 기다립니다. 시간 경과 실험을 수행하는 경우 다른 시간 간격으로 박테리아를 추가하고 동시에 전체 반응 플레이트를 중지합니다.

부착 세포의 처리 속도를 높이려면 세넷을 제거하고 PBS가 함유된 희석된 트리암 블루 50마이크로리터를 첨가하여 트라이안 배양 후 내재화되지 않은 박테리아의 형광을 소멸시킵니다. PBS로 플레이트를 두 번 세척하여 잔류 트리안을 제거합니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 4 % 파라 알데히드로 세포를 고정하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS로 접시를 씻으십시오. 모든 액체를 제거하고 50마이크로리터의 DPI를 추가합니다.5분 동안 염색한 후 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 PBS를 추가하고 파라알데히드 고정 후 식세포작용을 기록합니다.

각 세척에 대해 웰당 100마이크로리터의 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS의 0.1%Triton X 100 50마이크로리터를 투과를 위해 세포에 첨가하고 실온에서 3-5분 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 0.1% Triton X를 두 번 씻어냅니다.

그런 다음 라벨의 비특이적 결합을 방지하기 위해 20분 동안 1% BSA로 셀을 차단합니다. 이제 PBS 5밀리리터에 메탄올 원액 100마이크로리터를 첨가하여 로드 도민 염색의 작업 용액을 준비합니다. 차단 후에는 BSA 용액을 즉시 제거하십시오.

각 웰에 50마이크로리터의 반추위 포이드와 작업 용액을 추가하고 실온에서 20분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다. 식세포작용(phagocytosis)을 정량화하려면 플레이트를 형광 플레이트 리더에 배치하고, 488나노미터 파장의 여기 필터와 518나노미터 파장의 방출 필터를 사용하여 녹색 형광을 기록하고, 355나노미터 파장의 여기 필터와 460나노미터 파장의 방출 필터를 사용하여 청색 형광을 기록합니다. 형광판 리더를 사용하여 액틴 중합을 정량화하기 위해 584나노미터 파장의 여기 필터와 620나노미터 파장의 방출 필터 및 청색 형광을 통해 적색 형광을 기록합니다.

355 나노 미터 파장의 화재 및 여기 필터와 460 나노 미터 파장의 방출 필터. 다음으로, 녹색 또는 적색 형광의 총 RFU를 입자 라벨 또는 높은 플레이트로 인한 식세포 대 액틴 정량화에 따라 파란색 형광 판독값으로 나눕니다. 분산을 파악하려면 상대 인덱스를 사용하여 관찰된 추세를 가장 잘 설명하고 보다 신뢰할 수 있는 통계 분석을 용이하게 합니다.

이 이미지는 억제제 첨가에 따른 액틴 중합의 변화를 보여줍니다. 이것들은 pseudopodia formation이고 다음은 membrane ruffling의 변화입니다. 이 이미지에서 세포는 60분 동안 20:1 비드 대 세포 비율로 fitzy conjugated X beads를 내재화할 수 있었습니다.

그런 다음 세포는 파라 알데히드로 고정 된 trian 및 PBS로 세척되며 아세톤과 F actin에 대한 얼룩으로 투과성이 있습니다.로드 도민, F 허리 및 dpi를 사용하여 opsonize 및 unoxidized 입자의 연속 phagocytosis는 상당히 비슷합니다. 여기서 J 7 74 세포는 dextra beads를 내재화하고 있습니다. 흥미롭게도, 식세포작용(phagocytosis)에 따른 액틴 중합(actin polymerization)은 나중에 느려지는 것을 증가시키는 반면, unop 입자의 내재화(internalization)에 따른 액틴 중합(actin polymerization)은 dextra 입자를 사용하는 식세포분석법(phagocytic method) 중 어느 것도 세포 생존력의 변화를 초래하지 않습니다. 이 기법은 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 한 번에 여러 플레이트를 사용하여 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 식균작용 및 기타 세포 과정을 분석하는 효율적이고 비용 효율적인 고처리량 방법으로 Fluor metric 분석을 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.