Name: 종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 마우스 척수에 만성 광학 영상 챔버를 이식하는 방법을 통해 반복 수술 없이 장기간 세포 행동을 관찰할 수 있습니다. 다광자 형광 현미경을 활용한 이 기술은 신경과학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

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시술 개발 전반에 걸쳐 의견을 제시해 주신 Joseph R. Fetcho 박사님께 감사드립니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01 EB002019에서 C.B.S로, DP OD006411에서 Joseph R. Fetcho에게)과 캐나다 국립과학연구위원회(National Science and Research Council of Canada, M.J.F.)로부터 재정 지원을 받은 것에 감사드립니다.

참고 : 관리와이 문서에있는 모든 쥐의 실험 조작은 코넬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 수술에 대한 설정 <ol><li> 오토 클레이브 멸균하거나 승인 절차를 사용하여 필요한 모든 도구들을 소독. 최소한, 메스, 가위 바나, 남은 가위, 집게, 보석의 드라이버, 면봉, 견인기 세트, 임플란트 (그림 1A) 및 전달 시스템 (그림 1D, E)를 포함한다. </li><li> 70 % 에탄올 및 / 또는 적절한 소독제로, 어떤 입체경 노브를 포함한 모든 표면을 닦아. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)를 중첩시키고 멸균 커튼으로 벤치 탑 주변으로 멸균 필드를 만듭니다. 가열 패드 (제어 바람직 피드백) stereotax의 상단에와 멸균 커튼 아래에 배치해야합니다. </li></ol> 2. 준비수술에 대한 마우스 <ol><li> 레이트 호흡하면 약 1 호흡 / 초의 감속까지 유도 챔버 내에 5 % 이소 플루 란 / 산소 하에서 마우스를 마취. </li><li> 이소 플루 란 노출을 계속 코 콘을 사용하여 멸균 필드에서 멀리 준비 영역에 마우스를 전송합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - 근육 (29)를 사용하여 뒷다리에 0.05 ㎎ / 100g 마우스에 글리코 (항콜린 성 약물)을 관리합니다. 주 : 글리코는 마우스가 마취 상태에서 폐 유체 축적을 방지하기위한 것이다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 2cm 폭 흉부 아치를 중심으로 마우스의 등쪽면, 약 3cm 길이의 부분을 면도. 잘 떨어져 면도 영역에서 어떤 손질 머리를 청소합니다. </li><li> 면도에 피하 및 말초 다음 주사를 관리29 사용하여 패치 - 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 : 1 ㎖ / 100g 마우스 5 % 포도당 생리 식염수에 (수분 공급), 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜 (진통제에 대한 NSAID), 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 (dexamethasone)을 ( 항 염증 스테로이드)은 염증을 줄일 수 있습니다. </li><li> 면봉 사용, 세척 사이에 1 분을 기다리고, 요오드 및 70 % 에탄올의 세 가지 교류 세척을 수행합니다. </li><li> 절개 부위에 통증을 줄일 30 G 바늘과 면도 패치의 중심에 3/10 공통 주사기 - 피하 사용 29 0.125 %의 부피 바카 인 (말초 신경 블록) 100 ㎕를 관리. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)로 전송 마우스, 직장 온도계를 삽입하고 bupivicaine을 적용하려면 약 10 분을 기다립니다. </li></ol> 3. 노출 3 인접 흉부 척추의 등 박판을 청소 <ol><li> 메스 블레이드를 사용하여, 관심 (그림 2A)의 척추 위의 작은 (5mm 이하) 절개를 만듭니다. </li><li&gt; 중 집게를 사용하거나 수술 가위의 끝을 삽입하고 핸들을 확산하여, 무딘 절개하여 피부에있는 구멍의 크기를 증가. </li><li> 메스 나 수술 가위를 사용하여 부드럽게 피부와 기본 근육 사이의 결합 근막을 떼어 놓다. </li><li> 가능 (그림 2B)로 큰 작업 영역을 허용, 피부를 다시 개최하기 위해 견인기를 사용합니다. 가슴에 부하를 증가시켜 호흡을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 한 쌍의 집게 그립 상부 근육을 통해 노출 될 입쪽 가장 척추골 사용. 메스를 사용하여 멀리 3 척추 (그림 2C)에서 지느러미 프로세스의 양쪽에 조직을 잘라. </li><li> 메스 블레이드, 면봉, 및 / 또는 뼈 스크레이퍼의 조합을 사용하여, 지느러미 라미 (그림 2D)에서 모든 덮는 조직을 제거합니다. </li><li> 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 두 라 테라에 척추에 부착 된 힘줄을 절단척추 (그림 2E)의 L 가장자리. </li><li> 메스를 사용하여 부드럽게 클램핑 깨끗한 표면을 제공하기 위해 가능한 척주의 측면 에지로부터 많은 조직을 제거. </li><li> 조심스럽게 뼈 스크레이퍼 및 / 또는 면봉을 사용하여 남아있는 연부 조직의 척추 시술을 시행. 다른 곳에서 수술 가위 (그림 2 층)을 사용하는 모든 부조리 한 조직을 멀리 트림. 주 : 클램핑과 척추가 완전히 노출되는 등의 후궁 절제를 수행하는 두 필수적이다. cauterizer 이후의 출혈을 조절하는데 유용 할 수있다. </li><li> 피부 (도 2F) 이외에 척주를 둘러싼 조직을 다시 잡아 견인기 시프트. </li><li> 배달 게시물에 접지 단자에 임플란트 측면 막대를 연결합니다 (그림 1E와 동일) 이후 홀더에 이러한로드합니다. </li><li> securel를 보유 할 충분한 압력을 적용, 측면 막대를 사용하여 3 척추 클램프Y (그림 2G, H). 3 척추의 레벨 클램핑을 보장하기 위해 집게를 사용합니다. 몇 번의 시도가 필요할 수도 있습니다. 사이드 바는 레벨과 후궁 절제술을 수행 평행 이전에 모두 있는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 면봉을 사용하여 클램핑 척추의 등 표면을 건조. </li></ol> 4. 지느러미 후궁 절제술을 수행 <ol><li> 중간 클램프 척추의 경막 외 공간에 vannas 가위의 끝을 삽입하고 가볍게 핸들을 쥐어 짜기; 뼈가 건조하면 등쪽 박판의 길이를 따라 균열한다. 얇은 판을 해제 반대편에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 신중하게 얇은 판의 주동이의 꼬리 끝에서 모든 결합 조직을 절단하고 그것을 멀리 들어 올려, 집게 등의 프로세스에 의해 느슨한 얇은 판 파지. </li><li> 0.9 %의 식염수 및 / 또는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 사용하여, 철저하게 혈액 overlyi을 씻어척수 겨. 초과 액체를 흡수하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 위 vannas으로 조심스럽게 위로 임플란트 사이드 봉에 뼈의 측면 에지 트림. 다시 씻어 ​​내고 면봉 식염수 / ACSF를 사용하여 출혈을 제어 할 수 있습니다. </li><li> 30 G 바늘 - 골막의 일부가 분리 및 척수를 덮는다었을 부드럽게 면봉 및 / 또는 29을 사용하여이 조직을 제거. 절차의이 부분에서 척수를 손상하지 않도록주의하십시오. 단단히 감싸 경막과 느슨한 골막을 혼동하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 하나 치과 아크릴 및 시아 노 아크릴 레이트 (도 2I) 모두와 뼈의 나머지 노출 된 가장자리를 밀봉. 접착제가 노출 된 척수에 흘러 가지 않도록 특별한주의하십시오. </li></ol> 5. 인감 상공 회의소 <ol><li> 4 슬롯 사이드 봉 (4)에 구멍을 일렬 것을 개구 위에 놓이는 노출 된 스핀 있도록 신중 상판 놓고알 코드 (그림 1B와 2J). </li><li> 보석의 드라이버를 사용하여 조심스럽게 포셉 또 한 쌍으로 드라이버의 샤프트를 안정화, 첫 번째 나사를 시작합니다. 이 단계에서 나사를 조입니다,하지만 처음 몇 스레드가 활성화되도록 삽입하지 마십시오. 다른 나사 3 개에 대해이 과정을 반복합니다. 참고 :이 단계에서 위치를 조절 나사를 돕기 위해 티타늄 또는 다른 비 자화 집게를 사용하는 것이 유용하다. </li><li> 대신에 4 개의 나사, 나사가 단단히 (그림 2K)을 확보 할 때까지 각각의 작은 단위로 같은 양에 의해 교대로 나사를 조입니다. 상판이 과정에서 휘어 것이 특이 아닙니다. 나사 머리가 손상 될 수 있습니다 과도한 하락 압력 클램프을 제거 및 / 또는 척수 부상의 원인이되므로, 너무 많은 나사를 조이 않도록주의하십시오. </li><li> 척수 및 유리 창 사이의 공간을 채우기 위해 실리콘 엘라스토머를 사용한다. 이 미상 때문에경화시 아세트산을 생산하지 S, KwikSil 브랜드 엘라스토머 및 믹싱 팁을 사용합니다. 노출 된 척수에 실리콘의 자유 부분을 적용합니다. 믹싱 팁의 사전 척수 응용 프로그램에 기포가 포함 된 실리콘 없애주의하십시오. </li><li> 신속하게 작업을 조심스럽게 상판의 삽입에 5mm # 0 커버 슬립을 누릅니다. 점차적으로 척수를 둘러싸 액체 엘라스토머를 쥐어 짜기,하지만 척수 압축 (그림 2L)에 포함되지하기에 충분한 압력을 적용합니다. 엘라스토머 시간을 설정하면 너무 커버 슬립이 빠르게 적용되어 있는지 확인, 약 90 초입니다. </li><li> 5.5 - 실패한 밀봉의 경우, 엘라스토머가 설정 될 때까지 부드럽게 집게로 임플란트에서 제거하고 5.4을 반복 기다립니다. </li><li> 치과 아크릴 / 시아 노 아크릴 레이트와 삼출 엘라스토머 에지를 덮고 척수의 표면 위에 어긋남 엘라스토머를 방지하기 위해 가능한 한 많이 둘러싸는 뼈에 부착. </li><li> 견인기를 제거하고 임플란트의 가장자리 주위에 피부를 당기십시오. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하면, 임플란트 (도 2 M, N)의 가장자리에 부착 피부. </li><li> 삽입 # 0-80 - 1/4 &quot;상판의 날개 (그림 1C 2 O)에 나사를 설정합니다. </li><li> 치과 아크릴을 사용하여, 상부 판 (도 2P)의 나사 구멍에 틈을 밀봉. </li></ol> 6. 수술 후 케어 <ol><li> 큰 깨끗한 케이지에 마취 및 장소에서 동물을 제거합니다. 케이지는 챔버는 아무것도 걸리지 않습니다 충분히 큰지 확인 케이지에 걸쳐 정상 운동의 과정 동안 (예 : 물병 및 / 또는 식품의 V 모양의 딥 등). 주 : 표준 쥐 케이지가 이상적입니다. </li><li> 동물이 회복하면서 가열 된 표면에 케이지를 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li><li> 동물 beha 확인통증이나 고통과 임플란트 무결성의 흔적이 2 시간의 수술 후 - 1 ~ vior. 참고 : 보통 상태에서, 동물이 이동에 적당한 동요와 ambulate 할 수 있어야한다. </li><li> 무게를 측정하고 동작을 모니터링, 처음 72 시간 동안 12 시간 - 동물마다 8 확인을 계속합니다. 동물이 밤 동안 활성 및 이동되어 있는지 확인합니다. 지상의 형태로 젖은 음식은 물이나 영양 젤, 우 펠렛과 혼합 차우, 마시는 물은 바닥 수준에서 제공되어야한다. 피하 또는 intraperiotoneal 주사에 의한 추가 수화 필요에 따라 제공되어야한다. </li><li> 수술 후, 24 및 48 시간의 시점에서 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜과 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 피하 관리합니다. 또한, 0.005-0.010 ㎎ / 100g 마우스는 72 시간 동안 피하 주사로 매일 8 시간을 투여해야한다. </li></ol> 7. 생체 이미징 <ol><li> 아래 마우스를 마취호흡 속도까지 유도 챔버에서 5 % 이소 플루 란 / 산소 약 1 호흡 / 초의 감속. </li><li> 피드백 제어 가열 패드 사용자 정의 stereotax (그림 1D)에 마우스를 전송하고 직장 온도계를 삽입합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - (29)를 사용하여 뒷다리에 글리코 0.05 ㎎ / 100g 마우스 근육을 관리합니다. </li><li> 피하 식염수 1 ㎖ / (수분 공급) 100g 마우스 5 % 포도당 한 번 시간 당을 관리합니다. </li><li> 수술 (그림 1 층)에 사용되는 포스트 홀더에 나사 챔버 홀더를 삽입합니다. 높이를 조정하고 상판에 고정 나사 위에 게시물을 비틀. </li><li> 두 홀더 부착으로 가슴 자유롭게 영감에 따라 확장 할 수있을 때까지, 포스트 홀더의 홀더를 상승. 참고 : 소유자의 회사 부착하고 가슴 significan의 자유로운 확장 모두TLY 호흡에 의한 움직임 아티팩트를 줄일 수 있습니다. </li><li> 원하는대로 이미지를 수행합니다. </li><li> 이미지가 완료되면, 저급 게시물, 챔버 홀더 비틀어 복구 가​​열 된 표면에 직장 온도계 및 도시 마우스를 제거한다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 것이 없으며 경쟁하는 금전적 이해관계도 없습니다.

여기에 입증 기술은 반복, 시간 경과를 허용, 몇 주에 밖으로 지느러미 마우스 SC의 생체 내 이미징은 이후 수술 절차가 필요없이 작동 가능 게시합니다. 이 절차를 반복 수술 영상 검사를 통해 또는 휴대 역학에 대한 정보가 손실 portmortem 조직 학적 접근 방법을 통해 상당한 개선을 나타냅니다. 우리는 이전에 (30)는 생체 내에서 SCI 병리학을 공부하는이 기술의 가치를 증명하고있다. 영상의 최대 길이 범위는 SC의 등 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 결정 하였다. 시간이 지남에 따라,이 성장은 이미지 콘트라스트와 해상도의 손실의 결과. 이러한 성장은 다른 수술 준비 (31)에서 볼 수있다. 일화, 우리는주의 깊게의 표면을 밀봉, 혈액 제품을 제거하기 위해 지느러미 SC 표면을 세척하여 이러한 성장이 최소화 될 수 있음을 발견했다시아 노 아크릴 레이트와 잘라 뼈, 실리콘 엘라스토머와 잘 챔버의 가장자리를 밀봉하고, 등쪽 SC과 커버 유리 사이의 격자 공간을 최소화한다. 최근 폴리 카르 보 네이트를 사용하여 챔버 자체와 유사한 또 다른 방법 (32)을 보여왔다. 우리의 스테인레스 스틸 부품의 경우가 X 선 및 음향 영상 방식과 호환 때문에 폴리 카보네이트의 사용은 유리하다. 그러나, 3 차원 프린터의 현재 유비쿼터스, 챔버 부품은 필요에 맞는 다양한 재료로부터 제조 될 수있다. 우리는 최근에 명확한 포토 폴리머 우리의 모든 부분을 인쇄했습니다. 밀폐 된 챔버의 한 가지 중요한 단점은 약물이나 SC 영상 (34)에 적합한 외생 염료의 반복 투여 량을 관리 할 수 없다는 것입니다. 그러나, 우리의 현재 시스템의 기계적 안정성을 활용하여, 우리는 이미 성공에 우리의 현재 챔버를 사용했다LY 심지어 밀폐 챔버 방식 (출판 서적)에서 여러 시점에서 약물 전달을 허용 피하 주입 주입구에 접속 막내 카테터를, 앵커. 또한, 인해 상판의 모듈 형 특성으로 이러한 준비의 미래 버전 치료제 및 형광 라벨 모두의 반복 응용 프로그램 수 있도록 다시 봉합 할 수있는 챔버를 포함 할 것이다. 이는 약물 전달 용 전극, 광학 삽입하고, 포트를 기록하기위한 설치대 가기 판을 구상 할 수있다. 이러한 추가 가능성 Fenrich 등. (31)의 더 멀 시스템을 사용하여 구현하기가 더 어려울 수있다. 결론적으로, 우리의 챔버는 다양한 실험의 기반이 될 수있는 게이트웨이 플랫폼을 제공합니다.

그대로 생물 생체 현미경 시간 경과는 면역 조직 화학 염색과 같은 기존의 단일 시점 분석에 액세스 할 수없는 복잡한 생물학적 과정의 직접 시각화 할 수 있습니다. 구체적으로, 다중 광자 현미경 (MPM) (1)는 2,3- 최대 4 1mm 초과 촬상이 달성 된 설치류 신피질로, 조직을 산란 이미징을 허용한다. 하나의 절차 개월 주 동안 뇌에 광 액세스 할 수 있습니다 5-7있는 수술 준비와 결합하면, 이러한 현미경 접근 방식이 건강하고 병에 걸린 상태 8-11 뇌의 동적 프로세스를 연구하는 데 사용되었다. 또한, 분석 프로토콜은 행동 동안에 셀룰러 - 해상도 이미징 기능을 허용 웨이크 (즉, 비 마취) 동물에서 생체 내 이미징 제공 12,13 개발되었다. 이러한 프로토콜은 comparis 사용되어왔다신경 활성 상관 (14)의 기능은, 마취 된 동물에서 깨어 15 시그널링 성상 세포는 칼슘, 작업 별 신경 클러스터 (16)의 식별 및 신경 세포의 능력은 휘스커 자극 17에 객체 위치를 판별한다. 질병기구 (18)와 같은 급성 축삭 변성의 식별 (AAD)를 허용 마우스 척수 (SC)에인가 된 건강 및 병리 기전, 생체 내 이미징 경과 해명이 접근법의 전위를 부여. 후속 연구는 후근 신경절 (DRG) 축삭 재생 (19), 축삭 재생 (20)에 혈관의 역할, 부상 (21)에 대응 아교 화성, 실험자가 면역 뇌척수염의 T - 세포 이동 (EAE) (22), 활동에 주변 병변의 효과를 조사 amyotroph에 대한 응답으로 미세 아교 세포의 23, 24 및 성상 세포 (25)IC 측삭 경화증 (ALS), SC 손상 (SCI) 26 후 축삭 발아에서 STAT-3의 역할 및 EAE 27 축삭 손실 및 복구 메커니즘. 이러한 방법의 성공에도 불구하고, 이러한 모든 연구 시점 액세스에게의 수를 제한하는 모든 촬상 시점에서 동물의 수술 개구 반복 필요한 다른 이에 단기 역학 연구를 제한 한 촬상 세션 중 하나에 한정하거나시켰다 혼동 및 실험적 인공물의 가능성을 증가시킨다. 이러한 수술에 대한 프로토콜은 이전에 28,29 발표되었다. 최근에, 우리는 반복 수술이 필요없이 여러 주 동안 마우스 SC에서 시간 경과 MPM 이미징을 활성화 만성 척추 챔버의 주입하는 기술 (30)을 발표했다. 간단히 말해서,이 수술 준비는 낮은 흉부 척추 후궁 절제술 및 네 부분으로 된 챔버의 주입을 수행 포함되어 있습니다. 챔버 포함후궁 절제술을 둘러싼 척추 및 유리 커버 슬립 위에 배치 SC 실리콘 엘라스토머를 클램프로 고정 세 맞춤 스테인리스 가공 부품. 이 기술은 반복 수술이 필요없이 건강하고 부상당한 상태에서 수술 후 이상 오주 밖으로 루틴 이미징 허용. 촬상 시점의 개수는 동물이 마취 유도를 허용 할 수있는 주파수로 제한되었다. 이미징 수명 SC의 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 제한되었다. 또, 외과 용 임플란트가 운동 기능에는 장기적인 효과를 가지고 있다는 것을 확인. 당초 발행 된 이후에, 또한 SC 장기 이미징을 가능 대안 적 방법은 다른 장소 31-33 설명되었다. 이 프로토콜은 우리가 개발 한 척추 실을 주입에 대한 우리의 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Vannas 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>집게, 가위, 메스 등</td><td>고급 과학 도구</td><td>다중&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>견인기 키트 -자기 고정기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>견인기 키트 -견인</td>기 <td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>다른 견인기도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>견인기 키트 -엘라스토머</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>피드백 제어 난방 담요</td><td>CWE Inc.</td><td>모델: TC-1000 마우스&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>참조 Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple 공급 업체</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI 수의학 공급</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil 믹싱 팁</td><td>World Precision Inc.</td><td>퀵믹스</td><td></td></tr></tbody></table>

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

포유류의 신피질에 대한 연구는 살아있는 설치류에서 반복적인 시간 경과 생체 내 이미징을 통해 피질 구조, 활동 및 신경 퇴행성 모욕에 대한 반응을 전례 없이 해결할 수 있게 했습니다. 이러한 연구는 반복적인 수술 절차 없이 장기간 광학적 접근을 가능하게 하는 간단한 수술 절차를 통해 가능했습니다. 이와는 대조적으로, 척수에 대한 유사한 연구는 이전에는 몇 번의 영상 촬영으로 제한되었으며, 각 영상은 침습적 수술이 필요했습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 당사는 8주 이상 지속적인 광학 접근이 가능하고, 척추의 기계적 안정성을 보존하며, 영상 촬영 중 외부에서 쉽게 안정화되고, 단 한 번의 수술만 필요한 척추 챔버를 개발했습니다. 여기에서는 관련 수술 도구와 함께 척추 챔버의 설계를 검토하고 수술 절차를 자세히 시연합니다. 간략하게, 이 비디오는 수술을 위한 수술 부위와 마우스의 준비, 척추 및 적절한 조직 괴사조직 제거, 임플란트 전달 및 척추 클램핑, 챔버 완성, 전달 시스템 제거, 피부 밀봉, 마지막으로 수술 후 관리. 비선형 현미경을 사용한 만성 생체 내 이미징 절차도 시연됩니다. 마지막으로 결과, 제한 사항, 일반적인 변동성 및 문제 해결 가이드에 대해 설명합니다.

전술 한 절차에 따라, 수술의 각 단계는도 2에서 설명한 수술의 각 단계에 대한 결과를 모방한다. 특별한주의가 유리 아래 기포를 제거하는 실리콘 엘라스토머를 도포 할 때 수행되거나 적어도 이들이 있는지 확인해야 관심 영역 (도 2L)의 주변에 위치. 숙련 된 외과 의사의 경우, 수술 중 또는 최초의 24 시간 postsurgery 내에서 하나 안락사를 요구하는 수술 합병증에 작업의 약 20 %를 발생합니다. 이러한 합병증은 가장 자주 과도한 연조직 출혈 또는 안전하게 척추에 실을 부착 실패에 발생한다. 성공적으로 이식 실에서, 창은 일반적으로 여러 주 (그림 3)에 대한 광학적으로 투명 남아있다. 최선의 노력에도 불구하고, 불투명, 섬유, 종양 성장은 종종 부분 obscuri 결과, 몇 일 이내에 형성윈도우의 NG (그림 3C - F, 검은 점선). 형광 구조는 섬유 조직이 밑에 2PEF 현미경을 사용하여 참조하기 어렵다. 우리는 성공적으로 이식 윈도우의 약 50 %가 수술 후 5 개 이상의 주 동안 분명 남은, 결과의 바이 모달 분포를 발견하고, 약 50 %는 1에서 난독 화되는 것을 - 3 주. 2PEF 영상을 방해하지 않습니다 -보기 창의 경험 또는 경질 (F, 녹색 별표 그림 3D) 위의 신생 혈관 만 적당한 수준 내에서 분명, 대부분의 장소로 남아 창하십시오. 우리의 이전 연구 (30)는 두개 창 제제 5에서 본 것과 유사한 가벼운 염증을 나타내는 창에 인접 척추골의 밑에 미세 아교 세포의 증가하지만 성상 세포 밀도를 나타냈다. 후근 gangl의 서브 세트에 옐로우 형광 단백질 (YFP)를 발현하는 트랜스 제닉 마우스에서IA (DRG) 뉴런 (YFPH 라인; 잭슨 연구소), 축삭 명확 수술후 주간 구별되었다 (도 4A 및 B) 및 하나만큼 동물에서 몇 달 같이 (데이터는 미도시). 혈관 (도 4A 및 B)은 혈장에 표지 된 덱스 트란 레트로 공전 주입 텍사스 레드 형광에 의해 가시화 하였다. 미세 아교 세포는 CX3CR1 녹아웃 마우스에 GFP를 발현하는 생쥐에서 가시화되었다 (CX3CR1-GFP, 잭슨 연구소)가 YFPH 라인 (그림 4C)을 건넜다. 대비와 해상도로 인해 이전에 30 설명 섬유질과 성장의 형성에 시간 (그림 4C)을 통해 겸손하게 악화되었다. 우리는 일상적으로 매일 12 시간만큼 자주 사망하지 않고 단일 세션에서 3 시간 동안 몇 군데. 세션 지속 시간 및 주파수는 실험 동물에 통증과 고통을 수반하는 윤리적 고려 사항 마취 유도, 수반에 대한 동물의 허용 오차에 의해 제한된다. &lt; 유지-together.within 페이지를 = "항상"&gt; : FO P 클래스 = "jove_content" <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg"> 그림 1. 커스텀 수술실는 주입 중에 챔버 전달을 용이하게하고 후속 이미징 세션 동안 챔버를 안정화시킨다. 두 사이드 바 천판 (A)는 척추 챔버 (C)에 작은 나사를 사용하여 (B) 조립된다. 연장 포스트 (D)와 수술대 구금 핀을 사용하여 척추 (E)에 사이드 바의 클램핑 전달을 허용한다. 이후 영상 세션 대신 임플란트 (F)의 날개에 고정 나사를 통해 챔버에 연결하기 위해 내부적으로 스레드 게시물을 사용합니다. 이 그림의 패널 B는 자연 출판 그룹의 허가 파라 외., 자연 방법 2012 년 30에서 수정되었습니다.96 / 52196fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg"> 도 2는 등쪽 후궁 절제술이 수행되고 만성 촬상 챔버 척수 광학 접근을 제공하기 위해 주입된다. 몽타주 절차에 대하여 설명한다. 먼저, 피부 (패널 A는, B, 프로토콜 절 3.1-3.4) 및 근육 (C; 3.5) 세 하부 척추를 노출 시키도록 후퇴된다. 이들 세 개의 척추를 덮는 조직이 제거된다 (D, E, F, 3.6-3.10)가 양면 (; 3.12 G, H)에 고정되기 전에 처리 및 횡 깨끗 긁어. 조심스럽게 척추 중앙의 등쪽 라미 제거하고, 뼈의 가장자리 (I 봉인 (J; 5.1)를 적용하고 나사 위치 (K 5.3)에 고정 실리콘 엘라스토머 및 커버 유리 (; 5.5 L)와 챔버를 밀봉하기 전에 실을 확보. 전달 핀 (M; 5.8)가 제거 된 후, 피부는 챔버의 측면에 접착된다 (M, N 5.8) 및 세트 스크류는 날개 (O 5.9)에 삽입된다. (P, 5.10) 마지막으로, 나사 슬롯이 치과 아크릴로 밀봉된다. 마우스가 복구하는 깨끗한 케이지에 위치 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg"> 그림 3. 만성 척추 챔버는 광학적으로 투명 오븐을 유지여러 주 어. 몇 분 (A)에서 수술 후 삼주 (F)에 이르기까지 척수의 백색광 이미지. 혈관 랜드 마크는 모든 시점 (노란색 화살표)에서 식별 할 수 있습니다. 작은 변화는 하루 postsurgery (B)에서 볼 수있다. 조밀 한 섬유 자라 (C - 오른쪽 아래에 점선으로 경계 F는) 선물로 초기 세 가지로 일 이미징 영역의 부분 난처 결과입니다. 가벼운 혈관 신생 (D, E, F, 녹색 별표)도 존재하지만. 백색광 또는 2PEF 영상의 원본 혈관을 가리지 않는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg">그림 만성 척추 챔버는 반복 수술이 필요없이 반복 다중 광자 이미징을 허용 4.. 척추의 등 funiculi에서 DRG 축삭 (녹색)의 부분 집합에 YFP을 표현 형질 전환 마우스를 반복 영상 코드 및 혈관 내 주입 염료 (A, B)에 의해 표지 된 혈관 (빨간색). 미세 아교 세포 (자주색)의 활동도 Thy1-YFP / CX3CR1-GFP 형질 전환 마우스 더블 (C)에서 시간 경과를 추적 할 수있다. 축삭과 미세 아교 세포가 계속 볼 수 있지만, 시간이 지남에 따라 적당한 콘트라스트와 해상도 감소 (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 등쪽 척수에 이미징 챔버를 이식하여 반복적인 수술 발작 없이 종방향 광학 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 3개의 흉추를 노출시키고 척추 위의 연조직을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 방의 측면 조각을 사용하여 노출된 척추뼈를 고정하고 등쪽 후판 절제술을 수행하는 것입니다.다음으로, 챔버의 상판을 노출된 척수 위에 단단히 부착하고 실리콘 엘라스토머와 커버 유리를 사용하여 밀봉합니다. 마지막 단계는 접착제를 사용하여 보형물 주위의 피부를 밀봉하고 동물이 회복할 수 있도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 다광자 형광 현미경 검사는 시간이 지남에 따라 세포 내 해상도로 척수의 세포 거동과 조직 구조를 이미지화하는 데 사용됩니다.척수를 반복적으로 절개하는 수술과 같은 기존 방법에 비해 새로운 방법론의 주요 장점은 잠재적인 감염, 외과적 외상 또는 동물의 스트레스와 같은 반복적인 수술과 관련된 합병증 없이 장기간에 걸쳐 거의 임의의 수의 이미징 시점을 분산시킬 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 투명한 제브라 피쉬의 척수 손상 후 종방향 이미징의 이전 성공을 고려했을 때 처음 떠올랐습니다. 그런 다음 이 패러다임을 포유류 모델로 확장하기로 결정했습니다.불소를 사용하여 마취된 마우스의 흉궁 부위를 면도하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 자른 머리카락을 제거합니다. 다음으로, 식염수, 케토프로펜, 덱사메타손의 혼합물을 마우스에 피하로 투여합니다.면봉 사용. 요오드와 70% 에탄올을 교대로 3회 세척하고 세척 사이에 1분 동안 기다립니다. 그 후, 절개 부위의 통증을 줄이기 위해 면도한 패치 중앙에 0.125% 부피바카인 100마이크로리터를 피하로 투여합니다.그런 다음 마우스를 사용자 지정 스테레오 공격으로 이동합니다. 직장 체온계를 삽입하고 현미경으로 부피바카인이 효과를 발휘할 때까지 약 10분 동안 기다립니다. 메스 날로 관심 척추 위에 5mm 절개를 만듭니다.그 후, 둔기 해부로 피부의 개구부 크기를 늘립니다. 다음으로, 피부와 기저 근육 사이의 결합 근막을 부드럽게 해리합니다. 견인기로 더 넓은 작업 영역을 위해 피부를 뒤로 잡고 가슴에 무게가 증가하여 호흡을 방해하지 않도록 주의하십시오.그런 다음 한 쌍의 집게로 위에 있는 근육을 통해 노출될 대부분의 척추뼈를 잡습니다. 등쪽 돌기의 양쪽에 있는 조직을 세 개의 척추뼈에서 멀리 잘라냅니다. 그런 다음 등쪽 라미네이트에서 위에 있는 모든 조직을 제거합니다.그런 다음 척추의 양쪽 측면 가장자리에 있는 척추뼈에 부착된 힘줄을 조심스럽게 잘라냅니다. 깨끗한 클램핑 표면을 제공하기 위해 척추 기둥의 측면 가장자리에서 가능한 한 많은 조직을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 남아 있는 연조직의 척추뼈를 부드럽게 제거합니다.뼈 스크레이퍼와 면봉을 사용하여 수술용 가위를 사용하여 부적합한 조직을 잘라냅니다. 다음으로, 척추를 둘러싼 조직을 고정하도록 견인기를 조정합니다. 피부와 함께 임플란트 사이드바를 분만 포스트의 갈래에 부착하고 포스트 홀더에 놓습니다.다음으로 세 개의 척추뼈를 고정합니다. 사이드바를 단단히 고정할 수 있을 만큼만 압력을 가하여 사이드바를 사용합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 세 척추뼈를 수평으로 고정합니다.후판 절제술을 수행하기 전에 사이드바가 수평이고 평행한지 확인하십시오. 그런 다음 면봉을 사용하여 고정된 척추뼈의 등쪽 표면을 조심스럽게 청소하고 말리십시오. 이 절차에서는 Vana 가위의 끝을 내측 클램프 척추의 경막외 공간에 삽입하고 핸들을 가볍게 쥐십시오.뼈가 건조하면 등쪽 얇은 판을 따라 갈라져야 합니다. 반대쪽 쪽에서 이 절차를 반복하여 느슨한 얇은 판을 잡으면서 얇은 판을 풀어줍니다. 집게로 등쪽 돌기를 부드럽게 잡고 얇은 판의 배와 코들 끝에 있는 결합 조직을 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 척수 위에 있는 혈액을 0.9% 식염수로 철저히 씻어내거나 인공 대뇌 척추 면봉으로 과도한 체액을 흡수합니다.그런 다음 뼈의 측면 가장자리를 다듬고 임플란트의 사이드바로 진행합니다. 그런 다음 면봉과 식염수를 사용하여 출혈을 조절합니다. 골막의 일부가 분리되어 척수 위에 덮인 경우 면봉과 29-30 게이지 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 제거합니다.척수를 다치지 않도록 주의하고 느슨한 골막을 단단히 감싼 다이터와 혼동하지 마십시오. 끝에. 뼈의 나머지 노출된 가장자리를 치열, 아크릴 및 시아노아크릴레이트로 밀봉합니다.접착제가 노출된 척수에 묻지 않도록 특히 주의하십시오. 이제 4개의 슬롯이 사이드바에 있는 4개의 구멍과 정렬되고 구멍이 노출된 척수 위에 놓이도록 동물의 상판을 조심스럽게 배치합니다. 보석상 드라이버를 사용하여 첫 번째 나사부터 조심스럽게 시작하여 다른 집게로 드라이버의 샤프트를 고정합니다.이 단계에서 나사를 조이지 말고 처음 몇 개의 나사산이 맞물리도록 삽입하십시오. 다른 세 개의 나사에 대해 이 과정을 반복합니다. 4개의 나사를 모두 제자리에 놓고 모든 나사가 단단히 고정될 때까지 각 나사를 동일한 작은 증분으로 번갈아 조입니다.다음으로, 퀵 실 브랜드의 실리콘 엘라스토머를 사용하여 척수와 유리창 사이의 공간을 채우고 노출된 척수에 적용합니다. 적용하기 전에 혼합 팁에서 기포가 포함된 실리콘을 제거하십시오. 그런 다음 5mm 커버 슬립을 상판의 인서트에 빠르게 놓습니다.척수를 둘러싸기 위해 액체 엘라스토머를 점차적으로 짜낼 수 있도록 충분한 압력을 가하되 척수 압박을 일으키지 않습니다. 그 후, 삼출액이 나오는 엘라스토머의 가장자리를 치과, 아크릴 및 시아노아크릴레이트로 덮고, 접착제를 사용하여 엘라스토머를 주변 뼈에 최대한 접착시켜 엘라스토머가 척수 표면 위로 이동하는 것을 방지합니다. 다음으로, 견인기를 제거하고 임플란트 가장자리 주위의 피부를 위로 당깁니다.시아노아크릴레이트를 사용하여 피부를 임플란트 가장자리에 부착합니다. 그런 다음 상판의 날개에 나사를 삽입하십시오. 그런 다음 동물을 회수를 위해 케이지에 다시 넣기 전에 치과용 아크릴을 사용하여 상판의 나사 구멍에 있는 틈을 밀봉합니다.이미징 세션 전에 마우스를 다시 마취하고 임플란트의 노출된 나사를 나사산 포스트에 부착하여 안정화합니다. 이 수치는 만성 척추 방이 몇 주에 걸쳐 광학적으로 투명하게 유지된다는 것을 보여줍니다. 이것은 수술 후 몇 분에서 3주에 이르는 척수의 백색에서 광까지의 이미지입니다.혈관 랜드마크는 모든 시점에서 식별할 수 있습니다. 수술 후 하루는 거의 변화가 보이지 않습니다. 빽빽한 섬유질 과다 증식은 빠르면 3일 전부터 창의 일부에 나타나며 이미징 영역이 부분적으로 혼독화됩니다.경미한 혈관 신생술도 존재하지만 백색광 또는 두 개의 PEF 영상에서 원래 혈관 구조를 가리지는 않습니다. 만성 척추실은 반복적인 수술 없이 반복적인 다광자 이미징을 가능하게 합니다. 다음은 척수의 등쪽 fii에 있는 DRG 축삭의 하위 집합에서 YFP를 발현하는 형질전환 마우스의 이미지입니다.혈관 구조는 빨간색으로 표시된 혈관 내 염료 주입으로 표지되었습니다. 미세아교세포의 활성은 축삭돌기와 미세아교세포가 계속 보이는 동안 허벅지 1개, YFP CX 3개, CR 1개, GFP 이중 형질전환 마우스에서 시간이 지남에 따라 추적할 수도 있습니다. 대비와 해상도는 시간이 지남에 따라 완만하게 감소합니다.일단 마스터하면. 이 기술은 개발 후 적절하게 수행되면 약 1 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 기술은 척수 손상 후 축삭 다이백의 시간적, 공간적 이질성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.그리고 생쥐.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서...

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

척수로 (유전자 및 세포) 요법의 전달에 사용되는 수술 기술과 장치의 짧은 영상 설명입니다. 이 기술은 동물에 보여하지만, 완전히 번역 현재 인간 응용 프로그램에 사용되는입니다.

치료의 척추 배달을위한 수술 기법 : 괴팅겐 Minipigs의 절차의 데모

출처: Pietruczyk, E. A., et al. 마우스의 추궁 절제술 및 척수 창 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 척수 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 붕규산 커버 유리와 3D 프린팅 백플레이트를 사용하여 노출된 척수를 안정화합니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 2광자 현미경을 사용하여 혈액-뇌 장벽 역학 및 신경혈관 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

생체 내 이미징을 위한 마우스의 척수 창 이식

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

탈수초 질환은 리솔레시틴을 중추신경계에 국소적으로 적용하여 동물에서 모델링할 수 있습니다. 쥐의 척수에 리솔레시틴을 한 번 주입하면 시간이 지남에 따라 자발적으로 복구되는 병변이 생성됩니다. 목표는 탈수초화 및 재수초화와 관련된 요인을 연구하고 수리를 강화하기 위한 에이전트를 테스트하는 것입니다.

리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

이 프로토콜은 척수 수술을 수행하고 설치류의 척수 위에 광학 생크를 이식하고 고정하기 위한 수술 절차를 자세히 설명합니다.

설치류 척수에 광전자 장치 이식

이 프로토콜은 깨어 있는 마우스에서 척수의 초음파 자극을 위해 특별히 설계된 초음파 변환기 고정 시스템을 설명합니다. 이 방법은 고정 시스템을 사용하여 초음파 변환기의 정확한 위치를 보장하는 동시에 실험 대상자가 자극의 정밀도를 손상시키지 않고 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.

마우스의 척수 신경조절을 위한 초음파 변환기의 고정

배우세요 마우스 척수에 만성 광학 영상 챔버를 이식하는 방법을 통해 반복 수술 없이 장기간 세포 행동을 관찰할 수 있습니다. 다광자 형광 현미경을 활용한 이 기술은 신경과학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

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