종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 등쪽 척수에 이미징 챔버를 이식하여 반복적인 수술 발작 없이 종방향 광학 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 3개의 흉추를 노출시키고 척추 위의 연조직을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 방의 측면 조각을 사용하여 노출된 척추뼈를 고정하고 등쪽 후판 절제술을 수행하는 것입니다.

다음으로, 챔버의 상판을 노출된 척수 위에 단단히 부착하고 실리콘 엘라스토머와 커버 유리를 사용하여 밀봉합니다. 마지막 단계는 접착제를 사용하여 보형물 주위의 피부를 밀봉하고 동물이 회복할 수 있도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 다광자 형광 현미경 검사는 시간이 지남에 따라 세포 내 해상도로 척수의 세포 거동과 조직 구조를 이미지화하는 데 사용됩니다.

척수를 반복적으로 절개하는 수술과 같은 기존 방법에 비해 새로운 방법론의 주요 장점은 잠재적인 감염, 외과적 외상 또는 동물의 스트레스와 같은 반복적인 수술과 관련된 합병증 없이 장기간에 걸쳐 거의 임의의 수의 이미징 시점을 분산시킬 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 투명한 제브라 피쉬의 척수 손상 후 종방향 이미징의 이전 성공을 고려했을 때 처음 떠올랐습니다. 그런 다음 이 패러다임을 포유류 모델로 확장하기로 결정했습니다.

불소를 사용하여 마취된 마우스의 흉궁 부위를 면도하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 자른 머리카락을 제거합니다. 다음으로, 식염수, 케토프로펜, 덱사메타손의 혼합물을 마우스에 피하로 투여합니다.

면봉 사용. 요오드와 70% 에탄올을 교대로 3회 세척하고 세척 사이에 1분 동안 기다립니다. 그 후, 절개 부위의 통증을 줄이기 위해 면도한 패치 중앙에 0.125% 부피바카인 100마이크로리터를 피하로 투여합니다.

그런 다음 마우스를 사용자 지정 스테레오 공격으로 이동합니다. 직장 체온계를 삽입하고 현미경으로 부피바카인이 효과를 발휘할 때까지 약 10분 동안 기다립니다. 메스 날로 관심 척추 위에 5mm 절개를 만듭니다.

그 후, 둔기 해부로 피부의 개구부 크기를 늘립니다. 다음으로, 피부와 기저 근육 사이의 결합 근막을 부드럽게 해리합니다. 견인기로 더 넓은 작업 영역을 위해 피부를 뒤로 잡고 가슴에 무게가 증가하여 호흡을 방해하지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 한 쌍의 집게로 위에 있는 근육을 통해 노출될 대부분의 척추뼈를 잡습니다. 등쪽 돌기의 양쪽에 있는 조직을 세 개의 척추뼈에서 멀리 잘라냅니다. 그런 다음 등쪽 라미네이트에서 위에 있는 모든 조직을 제거합니다.

그런 다음 척추의 양쪽 측면 가장자리에 있는 척추뼈에 부착된 힘줄을 조심스럽게 잘라냅니다. 깨끗한 클램핑 표면을 제공하기 위해 척추 기둥의 측면 가장자리에서 가능한 한 많은 조직을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 남아 있는 연조직의 척추뼈를 부드럽게 제거합니다.

뼈 스크레이퍼와 면봉을 사용하여 수술용 가위를 사용하여 부적합한 조직을 잘라냅니다. 다음으로, 척추를 둘러싼 조직을 고정하도록 견인기를 조정합니다. 피부와 함께 임플란트 사이드바를 분만 포스트의 갈래에 부착하고 포스트 홀더에 놓습니다.

다음으로 세 개의 척추뼈를 고정합니다. 사이드바를 단단히 고정할 수 있을 만큼만 압력을 가하여 사이드바를 사용합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 세 척추뼈를 수평으로 고정합니다.

후판 절제술을 수행하기 전에 사이드바가 수평이고 평행한지 확인하십시오. 그런 다음 면봉을 사용하여 고정된 척추뼈의 등쪽 표면을 조심스럽게 청소하고 말리십시오. 이 절차에서는 Vana 가위의 끝을 내측 클램프 척추의 경막외 공간에 삽입하고 핸들을 가볍게 쥐십시오.

뼈가 건조하면 등쪽 얇은 판을 따라 갈라져야 합니다. 반대쪽 쪽에서 이 절차를 반복하여 느슨한 얇은 판을 잡으면서 얇은 판을 풀어줍니다. 집게로 등쪽 돌기를 부드럽게 잡고 얇은 판의 배와 코들 끝에 있는 결합 조직을 조심스럽게 잘라냅니다. 그런 다음 척수 위에 있는 혈액을 0.9% 식염수로 철저히 씻어내거나 인공 대뇌 척추 면봉으로 과도한 체액을 흡수합니다.

그런 다음 뼈의 측면 가장자리를 다듬고 임플란트의 사이드바로 진행합니다. 그런 다음 면봉과 식염수를 사용하여 출혈을 조절합니다. 골막의 일부가 분리되어 척수 위에 덮인 경우 면봉과 29-30 게이지 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 제거합니다.

척수를 다치지 않도록 주의하고 느슨한 골막을 단단히 감싼 다이터와 혼동하지 마십시오. 끝에. 뼈의 나머지 노출된 가장자리를 치열, 아크릴 및 시아노아크릴레이트로 밀봉합니다.

접착제가 노출된 척수에 묻지 않도록 특히 주의하십시오. 이제 4개의 슬롯이 사이드바에 있는 4개의 구멍과 정렬되고 구멍이 노출된 척수 위에 놓이도록 동물의 상판을 조심스럽게 배치합니다. 보석상 드라이버를 사용하여 첫 번째 나사부터 조심스럽게 시작하여 다른 집게로 드라이버의 샤프트를 고정합니다.

이 단계에서 나사를 조이지 말고 처음 몇 개의 나사산이 맞물리도록 삽입하십시오. 다른 세 개의 나사에 대해 이 과정을 반복합니다. 4개의 나사를 모두 제자리에 놓고 모든 나사가 단단히 고정될 때까지 각 나사를 동일한 작은 증분으로 번갈아 조입니다.

다음으로, 퀵 실 브랜드의 실리콘 엘라스토머를 사용하여 척수와 유리창 사이의 공간을 채우고 노출된 척수에 적용합니다. 적용하기 전에 혼합 팁에서 기포가 포함된 실리콘을 제거하십시오. 그런 다음 5mm 커버 슬립을 상판의 인서트에 빠르게 놓습니다.

척수를 둘러싸기 위해 액체 엘라스토머를 점차적으로 짜낼 수 있도록 충분한 압력을 가하되 척수 압박을 일으키지 않습니다. 그 후, 삼출액이 나오는 엘라스토머의 가장자리를 치과, 아크릴 및 시아노아크릴레이트로 덮고, 접착제를 사용하여 엘라스토머를 주변 뼈에 최대한 접착시켜 엘라스토머가 척수 표면 위로 이동하는 것을 방지합니다. 다음으로, 견인기를 제거하고 임플란트 가장자리 주위의 피부를 위로 당깁니다.

시아노아크릴레이트를 사용하여 피부를 임플란트 가장자리에 부착합니다. 그런 다음 상판의 날개에 나사를 삽입하십시오. 그런 다음 동물을 회수를 위해 케이지에 다시 넣기 전에 치과용 아크릴을 사용하여 상판의 나사 구멍에 있는 틈을 밀봉합니다.

이미징 세션 전에 마우스를 다시 마취하고 임플란트의 노출된 나사를 나사산 포스트에 부착하여 안정화합니다. 이 수치는 만성 척추 방이 몇 주에 걸쳐 광학적으로 투명하게 유지된다는 것을 보여줍니다. 이것은 수술 후 몇 분에서 3주에 이르는 척수의 백색에서 광까지의 이미지입니다.

혈관 랜드마크는 모든 시점에서 식별할 수 있습니다. 수술 후 하루는 거의 변화가 보이지 않습니다. 빽빽한 섬유질 과다 증식은 빠르면 3일 전부터 창의 일부에 나타나며 이미징 영역이 부분적으로 혼독화됩니다.

경미한 혈관 신생술도 존재하지만 백색광 또는 두 개의 PEF 영상에서 원래 혈관 구조를 가리지는 않습니다. 만성 척추실은 반복적인 수술 없이 반복적인 다광자 이미징을 가능하게 합니다. 다음은 척수의 등쪽 fii에 있는 DRG 축삭의 하위 집합에서 YFP를 발현하는 형질전환 마우스의 이미지입니다.

혈관 구조는 빨간색으로 표시된 혈관 내 염료 주입으로 표지되었습니다. 미세아교세포의 활성은 축삭돌기와 미세아교세포가 계속 보이는 동안 허벅지 1개, YFP CX 3개, CR 1개, GFP 이중 형질전환 마우스에서 시간이 지남에 따라 추적할 수도 있습니다. 대비와 해상도는 시간이 지남에 따라 완만하게 감소합니다.

일단 마스터하면. 이 기술은 개발 후 적절하게 수행되면 약 1 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 기술은 척수 손상 후 축삭 다이백의 시간적, 공간적 이질성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

그리고 생쥐.