Name: 쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 쥐 심근 경색을 유도하는 최소 침습 수술 기법으로, 스테레오 현미경 하 기관 삽관과 좌하행 관상동맥 결찰을 통해 높은 생존율과 재현성을 확보합니다. 이 방법은 심혈관 질환 연구에 필수적인 동물 모델을 제공합니다.

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이 연구는 RWTH 아헨 대학교 의학부 내 Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen(E.A.L의 주니어 연구 그룹)의 지원을 받았습니다. 원고에 대한 비판적 검토를 해주신 Rusu 박사와 Ashley Christina Vourakis, 면역조직화학 염색에 대한 전문적인 도움을 주신 Roya Soltan 여사에게 감사드립니다.

참고 : 본 논문에서는 실험을 저지 독일어와 유럽 동물 관리 지침에 따라 수행된다. 동물은 교수 R. Tolba 박사 A. Teubner (동물 복지 담당관)의 감독하에, 실험 동물 과학 연구소, Universiy 병원 아헨, 독일의 동물 시설에서 사육된다. 1. 동물 관리 <ol><li> 음식과 전문 수의학 제어 및 치료에 대한 적절한 액세스를 보장, 전문 치료실에서 쥐를 유지합니다. 동물이 이동하거나 외부에서 구입하는 경우, 절차를 진행하기 전에 한 주간의 숙박 시설을 확보하시기 바랍니다. </li></ol> 2. 삽관 <ol><li> , 8-10 주 된 남성 C57BL / 6 야생형 마우스를 마취 100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사를 사용하여 25~27g. 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 수준을 모니터링합니다. 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 놓습니다. </li><l난&gt; 교육 기관의 동물 관리 지침에 따라, 수술 절차를 시작하기 전에 buprenophine 0.1 ㎎ / ㎏ 체중 피하와 통증 치료를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 멸균 물질 및기구를 사용하여 수술하는 동안 감염을 피하기 위해 무균 상태의 유지를 확신시킨다. </li><li> 가열 수술 테이블에 앙와위에서 마취 마우스를 놓습니다. 작은 면도칼을 사용하여 복부 목 영역과 흉부의 왼쪽 절반 모두에서 머리를 제거하고 절개하기 전에 70 % 알코올로 소독. <ol><li> 목의 중앙에 수술 가위를 사용하여 0.5 cm의 작은 중간 절개를 수행합니다. 피부 아래에, 살균 곡선 집게로 2 지방 기관을 통해 이동하여 피복 근육의 투명도를 통해 실체 현미경 아래에있는 기관을 시각화. </li></ol></li><li> 실체 현미경 (그림 1A)를 사용하여 구두로보기 아래 기관에 삽관 정맥을 소개합니다. 죽 금속 정맥을 구별투명한 조직을 우. 그리고 어느 순간 (그림 1B)의 운전 중, 위치 및 위치를 확인합니다. </li><li> 작은 동물 인공 호흡기에 정맥을 연결하고 환기 설정있어서를 조정 가이드 라인 (100 ~ 150 μL와 분당 100 ~ 150 사이의 호흡 속도 사이의 호흡량)를 제조하고 있습니다. </li></ol> 3. 심근 경색 유도 <ol><li> xyphoid 왼쪽 axila 라인 사이의 중간에 피부 절개 미만의 0.5 cm를 수행한다. 하부 리브에서 근육 층을 분리 집게를 사용한다. </li><li> 흉강 (17)를 개방 할 때까지 작은 가위를 사용하여 리브 사이에 작은 절개를 수행한다. 만성 경색의 경우, 4 번째 늑간 공간 (그림 1D)에서, 5 번째 늑간 공간 (그림 1C) 및 / 또는 허혈 / 재관류 모델에서 절개를 수행합니다 쉽게 접근 번호의 2 번째와 아래에서 3 일 </suP&gt; 늑간 공간, 각각). </li><li> 흉강을 엽니과 마음을 시각화하기 위해 절개로 견인기를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 과도한 섬유화 과정을 방지하기 위해 심낭을 제거합니다. </li><li> 깊은 위치 빛 붉은 혈관으로 좌측 하행 관상 동맥 (LAD)를 시각화. LAD이 가시화 할 수없는 경우, 재현성을 높이기 위해 일부 참조 점을 고려한다. <ol><li> 만성적 경색증 모델의 경우,도 1c에 도시 된 바와 같이 참조로 정맥을 갖는 (귓바퀴와 정점 사이) 심장의 복부 측면의 중간에 배치 합자. 전층 전후방 경색을 얻었다 0/7 실크 봉합사를 이용하여 동맥의 두 가지를 결합한다. 그레이 컬러는 봉합사의 위치를 표시하고 (도 1C) 필요하다면 반복 될 수있다. </li><li> 허혈 / 재관류 모델의 경우, LAD의 본체 (그림 1D)를 통해, 귓바퀴에서 합자를 놓습니다. LIG 손해ature는 용기의 무결성을 보호하기 위해 실리콘 튜브 위에 위치한다. 회색 색상은 경색 영역을 표시하고 전체 심장 (그림 1D)에 나타납니다. 허혈 기간 동안 리브에 시간적 봉합사를 놓고 조직의 건조를 방지하기 위해 압축을 이용하여 적셔. 허혈 후 실리콘 튜브를 분리하고 재관류를 시각화 작은 가위로 절단 봉합사. </li></ol></li><li> 절차의 시작 부분에 사용되는 마취제와 진통제가 (2.1 및 2.2 단계) 옆에, 동물의 적절한 편안함을, 또는 기관의 동물 관리 지침을 따르지 수술 중 0.5 % 이소 플루 란을 사용합니다. </li></ol> 4. 봉합 및 복구 <ol><li> 따뜻한 등장 소금 용액을 작성하여 가슴에서 잔류 공기를 제거합니다. </li><li> 3 봉합 0/6 (그림 2A와 2B 참조)와 함께 가슴을 닫습니다. 으로 보장하기 위해 90 °의 각도로 배치 내측 봉합도 2에 도시 된 바와 같이, 리브 폐쇄 ealed (도 2A, B). </li><li> 2 봉합 (그림 2C)와 3-4 봉합 0/6 (그림 2D)로 피부와 근육 층을 닫습니다. 또한 심 초음파 측정을위한 적절한 창을 얻기 위해 별도로 봉합을 수행합니다. </li><li> 인공 호흡기에서 삽관 정맥을 분리하고 자발적인 호흡을 할 수 있습니다. 나중에 식별를 들어, 로컬 시스템 (교육 기관에서 동물 복지 담당자에게 문의)를 사용하여 마우스를 표시합니다. </li><li> 이 깨어 때까지 빨간색 램프 아래 왼쪽에 마우스를 놓으십시오. 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에서 일하기 위해 수술을 한 동물을 허용하지 않습니다. </li><li> 교육 기관의 동물 관리 지침에 따라, 다음 3 일 동안 buprenophine 0.1 mg / kg 체중 피하 통증 치료 관리. </li&gt; </ol> 심근 경색의 5 분석 <ol><li> 구혈률, 분수 단축, 심 박출량과 심장 크기 : 정기적으로 심 초음파 (그림 3A)에 의해 심장 기능을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 100 밀리그램 / kg 케타민, 10 밀리그램 / kg 자일 라진의 복강 내 주사를 사용하여 동물을 마취. 반사의 부족으로 수술 전에 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 흉강을 열고 광범위하게 멸균 PBS 용액 세척 나머지 혈액에 배치, 마음을 절제. </li><li> 필요한 경우, 흉강에서, 또는 마음의 제거 후 infracted 지역의 부상을 피함으로써 심장에서 직접 혈액을 수집합니다. </li><li> 세척 후, 포화 KCl을 솔루션에 diastola의 마음을 중지 (steril는 PBS에 3M KCl을 여과). 조직 학적 분석을 위해 10 % 포르말린에 마음을 수정하고 단계 5.7를 진행합니다. </li><li> 필요한 경우, 차의 생존 능력을 측정에반스 블루 / 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색 DIAC 세포. 세척하지 않고, 초기 장소에서 합자를 재 구축 한 후, 대동맥 캐 뉼러를 사용하여 200 μL 1 % 에반스 블루 용액으로 심장을 관류 및 -20 ° C에서 작은 비닐 봉투에 마음을 동결. <ol><li> 2 시간 후, 날카로운 메스를 사용하여 5 횡으로 슬라이드를 수행함으로써 제조 된 바와 같이, 37 ° C에서 TTC 용액 중에서 10-15 분 동안이를 부화. 10 % 포르말린에 10 분 동안 슬라이드를 수정하고 추가 분석을 위해 현미경 슬라이드 사이에 넣어 두 었어요. </li><li> 횡단 단면을 수행하기 위해, 끝의 마음을 위치시킴으로써, 파라핀의 심장 조직을 포함시킵니다. 5 μm의 직렬 섹션을 수행합니다. 처음 20 절을 수집하고 다음 300 μm의 폐기합니다. 승모판 레벨에 도달 할 때까지 부분 프로토콜을 계속 (도 3A, B). 직렬 부분은 떨어져 전체의 마음을 따라 400 μm의를 수집하고 F를 염색 할 수있다또는 정량적 분석. </li></ol></li><li> Gomori의 한 단계 6-8를 염색하여 경색 크기를 측정한다. </li><li> 보통의 면역 조직 염색을 사용하여 시리얼 부분에서 혈관 신생, 콜라겐 내용이나 염증 세포 모집을 분석합니다. </li></ol>

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절차를 수행하는 동안, 몇 가지 중요한 점은 주목해야 할이 있습니다 : 삽관, 개방 흉강과 LAD의 합자. 첫 번째 중요한 단계는 experiements 전에 동물의 삽관입니다. 많은 그룹은 기관에 직접 캐 뉼러를 삽입 마우스 및 빛의 소스에 고정하기위한 수직 지지대를 사용하고있다. 이 방법은 불확실성 기관에 정맥의 정확한 삽입 관한 정보를 가지고 있으며, 초보자에 의해 실패에 가장 경향이있다. 작은 절개 전진 뉼러의 위치는 그러므로 기본 속도 감소, 전체 기동시에 제어 될 수있다. 또한, 기관 절개 따라서 합병증을 감소시키고 작동 시간을 단축 능가한다. 다음으로 중요한 단계는 흉강의 개구이다. 중간 흉골 절개술은 동물의 회복을 지연 위험이 높은 기동을 나타냅니다. 2-3 리브 (15)의 절단을 의미 측면 왼쪽 절개 </SUP&gt;, 부족한 복구 및 사망률 증가로 이어집니다. 우리는 최소한의 부담을 제공 갈비뼈 사이의 작은 모델, 이산 절개에 사용됩니다. 동물은 수술 후 매우 신속하게 복구와 현재의 결함이나 방해를 치유하지. 하부 늑골 간 공간 기준점으로서 취해진 다. 이 고려, 만성 허혈 / 재관류 모델의 합자 장소에 적절하고 차별화 된 접근이 심각한 문제를 발생시키지 않습니다. 합자 자체가 가장 중요한 단계를 나타냅니다. 왼쪽 내림차순으로 관상 동맥이 가시화 될 어렵다, 자주보기없이 결합 될 필요가있다. 따라서 일부 해부학 적 기준점 올바른 결찰을 수행하기 위해 의사를 도와 지적된다. 만성적 경색증 모델의 경우, 결찰은 주요 전방 정맥 (도 2b)의 끝보다도 귓바퀴와 정점 사이, 심장의 복부 측면의 중간에 배치된다. 효율 contro 수피해 지역의 회색 색상의 모양을 시각화하여 채워. 경색 영역을 전방 나타나고 후벽을 포함하지 않는 경우, 새로운 봉합사는 봉합사 제의 왼쪽에 배치 될 수있다. LAD의 주요 루트는이 부분을 검출에 심각한 문제를 표시하지 않는 때문에 귓바퀴 (18)에서 항상 볼 수 있습니다합니다. 그러나, 귓바퀴 출혈 주요 위험을 제시하고, 신중하게 처리 될 필요가있다. 절차는 해당 기기의 존재에 의해 제한된다. 작은 동물 인공 호흡기와 적절한 마취 시스템은 비용이 많이 들고 공간의 가스 및 환기 시스템에 연결이 필요합니다. 또한, 동물의 가까운 감독은 프로 시저가 가능한 임상을 감지 한 후 첫 주에 필요하다. 실험 기간 동안 심장 기능을 검사하기 위해, 고해상도 초음파 복잡한 LANGENDORF 관류 시스템, 소형 또는 뇌 실내 카테터 측정이 요구되는, INV높은 비용과 추가로 전문 지식을 olving. 심근 경색 감안 체외에서 이벤트의 복잡도를 재현 가능한 다른 방법이 없다. 관심 지점에 따라, 랑겐 돌프 시스템에서 고립 된 심장의 생체 관류는 다른 자극이나 약물에 반응하여 수축, 심장 기능과 심근 생존 능력에 대한 정보를 제공합니다. 그러나, 혈액 성분과 면역 체계의 모든 간섭을 배제하며, 심근 경색 후 재 형성 및 치유의 장기 연구에 표시되지 않는다. 심근 경색 절차를 수행 한 후, 모든 다른 기능적 분석은 심 실내 압력 측정치, 초음파 (작은 동물 초음파 시스템) 또는 격리 랑겐 돌프 심장 재관류 같이 수행 될 수있다. 또한, 모든 분자 생물학적 분석, GE를 세포, 단백질, mRNA를, 마이크로 RNA를 식별하기 위해 수행 될 수있다NES 또는 심근 경색에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 치료 표적으로 사용될 수있는 다른 바이오 마커.

심근 경색은 선진국에서 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 진단 및 치료 방법의 부정 할 수없는 진전에도 불구하고, 심혈관 질환은 여전히​​ 사망의 주요 원인이다. 향상된 수명과 삶 리스크를 감안할 때, 심혈관 질환의 발생의 지속적인 증가는 미래에 예상된다. 따라서, 심혈관 질환의 치료를위한 신규 한 접근법을 확립하고 검증하는 강한 요구가있다. 인간 연구의 내용이 제한 고통, 이러한 연구는 일반적으로 설명하고, 이들 주요 건강 문제에 대한 해결책을 제공 할 수 없게되고, 분자 수준의 메커니즘을 이해하기에 불충분하다. 또한, 기초 연구는 실험실에서 심혈관 질환의 메카니즘을 재현하기 위해 복잡하고 어려움으로 인해 제한되어왔다. 따라서, 심장의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 증가혈관 질환, 그것은 동물 모델 1, 2를 확인하는 것이 필수적이다. 그러나, 동물 실험의 많은 원인 필요한 다른 시점에서 심근 경색, 분석 후 치유에 관여하는 분자의 모든 이벤트 캐스케이드의 동정을 행 하였다. 심근 경색은 종종 실험 동물 모델을 이용하여 수행된다. 작은 동물 3-11 심근 경색을 유도하는 큰 동물 모델보다 세포 및 분자 사건을 조사하기 위해 사용되는 가장 적합하고 효율적인 모델이다. 또한, 다른 종은 마우스 (12) 형질 전환 또는 녹아웃 균주의 가용성을 제공합니다. 이 마우스 모델은 13, 14 (스텐트 재 협착에, 죽상 동맥 경화증 등) 심장 혈관 병변을 포함한 다른 질환에 매우 유용하다. 또한, 낮은 임신 기간과 자손들의 수가 많으면 심근 INFA의 분자 메커니즘을 연구하는 가장 매력적인 시스템으로 마우스 모델을 한정rction (12). 그럼에도 불구하고, 쥐의 심장의 크기가 미세 동안 조작의 높은 정밀도를 기대하고있다. 이러한 자격을 갖춘 숙련 된 수술 인력을 교육하는 것은 시간이 많이 소요되는 작업 집약적 인 과정이다. 따라서, 우리는 여기에 같은 마우스의 복잡한 심근 경색 모델을 수행하는 학생이나 기술자 심지어 평균 자격과 공동 작업자를 안내하는 팁과 트릭을 포함하여 상세한 미세 절차를 제시한다. 우선, 삽관은 절개술을 사용하지 않고 짧은 뉼러 의해 수행된다. 흉부 절개 리브 및 / 또는 주변 조직의 손상을 방지, 늑간 지역에 위치해 있습니다. 이 하위 단계는 빠른 회복과 치유 (15)을 보장하기 위해 매우 관련이있다. 여전히 상당한 경색 크기를 유지하면서, 합자 높은 생존율, 만성 허혈 및 허혈 / 재관류 모델을 미분한다. 우리의 경험은 그쪽을 보여줍니다실크 봉합사를 이용하여 t는 극저온 부상 16에 비해 더 높은 재현성을 보장한다. 결론적으로, 여기에 기재된 방법은 작은 동물 모두 만성 허혈 및 허혈 / 재관류 모델에서 적용 가능하다. 이 절차에 제시된 팁과 트릭은 작은 동물 모델에 적용하기에도 부족하거나 평균 자격을 가진 직원을 가능하게하기위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>스테레오현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>마우스 인공호흡기</td><td>하버드 장치</td><td>730043</td><td>모델 Minient 845</td></tr><tr><td>이중 마취 시스템 (탁상용 버전)</td><td>하버드 장치</td><td></td><td>자체 포함된 이소플루란 기반 마취 장치는 실험실 테이블에서 사용되며, 크기는 컴팩트하며, 크기는 8" x 11"입니다.</td></tr><tr><td>삽관 캐뉼라</td><td>하버드 장치</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>FST, 독일</td><td>9119700</td><td>표준 팁 곡선 0.17mm x 0.1mm</td></tr><tr><td>가위</td><td>FST, 독일</td><td>9146011</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 Vannas 가위</td><td>Aesculap, 독일</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>견인기</td><td>FST, 독일</td><td>1820010</td><td>2.5mm 너비</td></tr><tr><td>견인</td>기<td>FST, 독일</td><td>1820011</td><td>5mm 너비</td></tr><tr><td>의 와이어 핸들</td><td>FST, 독일</td><td>1820005</td><td>&nbsp; 10cm</td></tr><tr><td>와이어 핸들</td><td>FST, 독일</td><td>1820006</td><td>&nbsp; 14cm</td></tr><tr><td>케타민 10%</td><td>CEVA, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자일라진 2%</td><td>Medistar, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene 눈과 코 크림</td><td>바이엘, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>IFK 이소플루오르, 독일</td><td>맞춤형&nbsp; 제품</td><td>직경 500 &마이크로; m</td></tr><tr><td>단면 두께 100 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌 카테터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROLENE 봉합사 6/0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>폴리프로필렌 모노필라멘트 봉합사, 비흡수성, 바늘 CC1, 13 mm, 3/8 원형</td></tr><tr><td>7/0 실크</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>초음파&nbsp;</td><td>베보, 캐나다</td><td>770 베보</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

심근 경색은 여전히​​ 지난 수십 년 동안 스텐트 개발 분야에서 상당한 진전에도 불구하고, 서방 국가에서 사망의 주요 원인이 남아있다. 기본 메커니즘의 해명과 새로운 치료 전략의 개발을위한 유효한 동물 모델의 가용성은 필수입니다. 우리가 심근 경색에 대처하기 위해 생체 내 조건 하에서 pathomechanisms 심혈관 질병에 대한 새로운 통찰력을 필요로하기 때문에, 동물 모델의 타당성은 중요한 측면이다. 그러나 동물의 보호는 이러한 맥락에서 매우 적합하다. 따라서, 우리는 높은 재현성과 동물의 생존율을 보장 마우스에서 심근 경색의 최소 침습과 간단한 모델을 확립한다. 따라서,이 모델은 동물 실험의 3R 원칙의 요구 사항 (교체, 정제 및 축소)을 충족하고 cardiov에 대한 치료 전략의 추가 개발에 필요한 과학적 정보를 보장ascular 질환.

심근 경색 절차는 25-30 분 내에 발생하고, 10 %의 사망률을 나타낸다. 수술 후, 마우스는 다음 15 분 이내에 마취에서 회복. 물리적 손상이 운영하는 마우스에 관찰되지 않았다. 복구 프로세스가 염증 단계에서 방해하는 경우에는 이후 만성 심근 경색 후 심장 파열의 위험이 높은 일주이있다. 심장 펌핑 중에 그 크기를 크게 변화시킬 수 있기 때문에 모든 수집 하트 diastola, 예를 들어, 동일한 위치에서 정지 할 수있는 것이 중요하다. 이 포화의 KCl 수용액으로 심장을 관류에 의해 달성 될 수있다. 세포 외 K + 농도 블록들 이온 펌프 증가 심장 활동의 이완기 구속의 결과로, 심장 세포의 막 쉬고 가능성을 감소시킨다. 경색 영역 초음파 분석 (도 3a, 하부 패널)에서 볼 수있다. 비교하여정상 심근은 허혈 영역은 얇고 hypokinetic (그림 3A, 상단 패널)가 나타납니다. 사용하는 모델에 따라 경색 크기는 다를 수 있습니다. 허혈 / 재관류는 얇고 중간 벽을 유도하고 모든 심장 (도 3c)에 걸쳐있는 동안 만성적 경색증 모델은, 정점 (도 3b)의 원형 전층 경색을 유도한다. 경색 크기를 결정하는 많은 방법이있다. 목적은 심장 생존에 직접적인 영향을 분석하는 경우, (18)를 염색 에반스 블루 / TTC는 심근에 변화를 볼 수 있도록, 2 시간 이상 재관류 후에 수행되도록 표시된다. 섹션은 염색 후 즉시 (그림 3B, 가운데 패널)을 분석 할 수 있습니다 또는 2-3일 (그림 3C, 가운데 패널)에 대한 포르말린에 유리 슬라이드 사이에 유지 될 수있다. 파란색 영역은 허혈에 의해 영향을받지 않는 건강한 심근를 나타냅니다. 빨간색 영역은 일 안에 가능한 심근을 나타냅니다전자 허혈성 지역 (위험 심근), 그리고 흰색 영역은 죽은 조직을 나타냅니다. 일반적으로, 경색 크기는 위험 지역으로부터의 퍼센트로서 표현된다. 프로세스 리모델링 후 얻어진 성숙한 흉터 용이 Gomori의 한 단계를 사용하여 염색 immunohistolgy에 의해 측정 될 수있다. 블루 염색 경색과 빨간색 염색 건강한 심실 영역 (그림 3B와 C, 오른쪽 패널) 승모판 막까지 각 레벨에서 첫 번째 섹션에서 결정된다. 인해 다른 레벨 LAD의 결합에 변화를 피하기 위해, 모든 부분에서 경색 고려 총 좌심실 체적 백분율로서 표현된다. 만성적 ​​경색증 모델에서 10-15 %로 허혈 / 재관류 모델 후 15-20%의 경색 부피가 달성 될 수있다. 또한, 만성적 경색증 모델 지기도 팽창을 유도 할 것이다, 허혈 / 재관류 모델에서 관찰되지 않는다 (도 3B 및 C 적합한 올바른T 패널). 등으로 사용할 수 종래 염색 절차 : CD31 혈관을 계시하는데 사용 착색 (빨강,도 4a) 또는 평활근 액틴 염색 근육 섬유 모세포 (녹색,도 4b)을 결정한다. 이중 형광 염색도 심장 근세포의 부재가 더 자동 면역 (도 4C)를 제공하지 않기 때문에, 경색 영역 내에 상이한 타겟 분자를 식별하기 위해 적용 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg"> 그림 1 : 내측 절개 삽관의 캐 뉼러 (A)의 삽입. 조직 (B)의 투명성을 통해 금속 캐 뉼러의 stereomicroscopic 시각화. 기관 반지 (파란색 화살표)과 정맥 (검은 색 화살표)가 지적된다. 만성 경색 개월의 늑간 절개델과 LAD의 합자 (C). 합자는 참조로 (파란색 설계도, 낮은 패널) 정맥의 끝을 복용 (귓바퀴와 정점, 낮은 패널에서 검은 사이의) 마음의 중간에 위치하고 있습니다. 동맥의 두 가지 (하단 패널에 빨간색) 결합되어야한다. 그레이 컬러 경색 영역을 나타내며 이는 심장 (오른쪽 하부 패널)의 하부 절반 부에 나타난다. 허혈 / 재관류 모델의 합자은 실리콘 튜브 (오른쪽) (D)을 통해 LAD의 본체 (하단 패널에 빨간색)을 결합, 귓바퀴에서 이루어집니다. 회색 색상은 전체 심장 (오른쪽 아래 패널)에 존재하는 infracted 영역을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg"> 그림 2 : (A)에 90 °의 각도에 위치하는 경우 절개 및 허혈 / 재관류 모델 (B, 왼쪽 패널) 리브 봉합사. 생체 내 이미징 (C, 좌측 패널 ), 근육 봉합 (C, 가운데 패널) 및 피부 봉합 (C, 오른쪽 패널). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg"> 그림 3 : 심 초음파 이미지. 정상 (A, 상단 패널) 및 경색 영역 (낮은 패널)의 이미지는, 긴 축에서 취득 (종 방향, 왼쪽 패널) 또는 단축 (가로, 오른쪽 패널)에 .. 경색 만성 합자에 의해 유도(B) 및 재관류 (C) 뒤에 한 열연 허혈. 에반스 블루 / TTC 염색은 관류 (파란색)의 식별 / 비 관류 영역뿐만 아니라 실행 가능한 (적색) / 죽은 (흰색) 심근 (B, C, 중간 패널)를 할 수 있습니다. Gomori의 한 단계 염색 경색 지역 (파란색)의 식별을 허용하고, 일반 지역 (빨간색) (B, C, 오른쪽 패널)에서 그들을 구별합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg"> 그림 4 : 다른 염색과이 같은 설명 신 혈관에 CD31 (빨강, 간단한 화살표) 또는 근육 섬유 모세포에 대한 평활근 액틴 (B, G로, infracted 영역에서 수행 할 수 있습니다재 N, 간단한 화살표)뿐만 아니라 이중 염색 (C, CD31 - 레드 / 평활근 액틴 녹색),) 핵 (파란색에 대한 DAPI으로 대조. 근섬유 아세포는 항상 내피 층 (C, 화살표)을 동반 작은 또는 큰 혈관 평활근 세포에서 쉽게 구별 할 수있다. 더블 화살표는 적혈구의 형광도를 가리 킵니다. 규모는 50 μm의 바.

최소한의 침습적 조작으로 마우스의 심근 경색에 대한 재현성이 높은 모델을 설명합니다. 모델을 쉽게 수행할 수 있어 재현성과 생존율이 높습니다. 따라서 설명된 모델은 3R 원칙(Replacement, Refinement and Reduction)에 의해 요청되는 대로 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

이 절차의 전반적인 목표는 최소 침습적 조작으로 마우스에서 재현성이 높은 심근 경색을 유도하는 것입니다. 이는 시술 중 삽관 캐뉼라 위치를 제어하기 위해 실체 현미경으로 삽관을 통해 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 흉강을 열고 빠른 치유를 용이하게 하기 위해 갈비뼈 사이를 조심스럽게 측면 절개합니다.그런 다음 왼쪽 하행 관상 동맥의 결찰을 적절한 하류 조작에 따라 배치합니다. 궁극적으로 경색의 크기와 모양은 표준 면역조직형태 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 기존 방법의 가장 큰 장점은 최소 침습적이고, 재현성이 높으며, 수행하기 쉽기 때문에 방법에 대한 경험이 최소한인 연구자도 소동물 모델에 적용할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 마우스 심장의 크기가 높은 정밀도의 조작을 요구하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 미세 수술 중. 마취된 8주에서 10주 된 수컷 C 57 BL 6 야생형 마우스를 가열된 수술대 위에 누운 자세로 눕히는 것으로 시작합니다.발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인한 후 동물에게 안연고를 바르고 작은 면도기를 사용하여 복부 목 부위와 흉부의 왼쪽 절반의 털을 제거하고 70 % 에탄올과 무리 피부로 피부를 소독합니다. 그런 다음 목 중앙을 0.5cm 정도 절개합니다. 일단 피부 아래로 들어가면 두 개의 지방체를 통해 한 쌍의 멸균 곡선 겸자를 통과시켜 덮고 있는 근육을 통해 기관을 쉽게 시각화할 수 있습니다.실체 현미경을 사용하여 삽관 캐뉼러를 기관에 구강으로 삽입합니다. 캐뉼라는 투명한 조직을 통해 관찰되어야 합니다. 기구의 적절한 배치를 확인한 후 캐뉼라를 소형 동물 인공호흡기에 연결하고 인공호흡 설정을 100-150마이크로리터 사이의 호흡량과 분당 100-150회 흡인으로 조정하여 심근경색을 유발합니다.다음으로, xiphoid process와 왼쪽 Xiphoid 사이의 피부를 0.5cm 미만으로 절개한 다음 집게를 사용하여 근육층을 아래 갈비뼈와 분리하여 만성 경색을 만듭니다. 허혈 재관류 모델을 위해 다섯 번째 늑간 공간을 절개합니다. 네 번째 늑간 공간을 절개합니다.다음으로 절개 부위에 견인기를 삽입하여 흉강을 열고 심장을 시각화합니다. 그런 다음 과도한 섬유화 과정을 방지하기 위해 심낭을 조심스럽게 제거하고 왼쪽 하행 관상 동맥을 깊숙이 위치한 연한 적색 혈관으로 시각화합니다. 만성 경색 모델의 경우, 왼쪽 하행 관상동맥을 참조하여 오라클과 정점 사이의 심장 복부 쪽 중앙에 합자를 배치합니다.그런 다음 경벽의 전방 및 후방 경색을 얻으려면 제로 세븐 실크 봉합사를 사용하여 동맥의 두 가지를 묶습니다. 허혈 재관류 모델의 경우, 신탁 아래와 실리콘 튜브와 왼쪽 하행 관상 동맥의 본체 위에 합자를 배치합니다. 허혈 기간 동안에는 갈비뼈에 측두부 봉합사를 놓고 조직이 건조하지 않도록 봉합사를 압박으로 적십니다.그런 다음 허혈 후 실리콘 튜브를 제거하고 작은 가위로 봉합사를 잘라 재관류를 시각화합니다. 경색을 유발한 후 흉부에 따뜻한 등장성 염 용액을 채워 잔류 공기를 제거합니다. 그런 다음 3 0 6 봉합사로 흉부를 닫고 내측 봉합사를 90도 각도로 배치하여 갈비뼈가 밀봉되도록 합니다.두 개의 봉합사로 근육층을 봉합한 다음 필요에 따라 3-4개의 봉합사로 피부를 봉합합니다. 그런 다음 인공호흡기에서 삽관 캐뉼라를 분리하여 나중에 식별할 수 있도록 쥐를 자발적으로 호흡할 수 있도록 하고 동물이 깨어날 때까지 빨간색 램프 아래에 놓습니다. 심근경색 데이터를 분석하려면 심초음파로 박출률 분획 단축 심박출량 및 심장 치수를 정기적으로 모니터링하십시오.실험이 끝나면 흉강을 열고 심장을 절제합니다. 광범위한 세척을 위해 조직을 멸균 PBS에 넣습니다. 그런 다음 모든 혈액이 제거되면 포화 염화칼륨 용액으로 심장을 확장기에 멈추고 하룻밤 동안 10% 포르말린으로 조직을 고정합니다.심장 조직의 얇은 부분을 파라핀에 삽입하고 심장 끝을 장착 블록의 아래쪽에 위치시켜 조직을 가로 절편화할 수 있도록 합니다. 그런 다음 5미크론의 연속 절편 20개를 수집하고 다음 300미크론을 버립니다. 승모판 수치에 도달할 때까지 300미크론마다 25미크론 절편을 계속 수집합니다.그런 다음 mori의 1단계 염색을 사용하여 조직의 경색 크기를 측정하여 TTC 염색을 수행합니다. 결찰을 재건하고 대동맥 캐뉼라를 사용하여 200마이크로리터의 1%Evans 블루 용액으로 심장을 관류하고 세척하지 않고 섭씨 영하 20도의 작은 비닐 봉지에 심장을 얼립니다. 2시간 후, 날카로운 메스를 사용하여 조직에서 5개의 가로 절편을 채취하고 10-15분 동안 절편을 배양합니다.제조업체의 지침에 따라 섭씨 37도의 TTC 용액에서. 10% 포르말린에 10분 더 고정한 후 절편을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 조직학적 분석용.사용하는 모델에 따라 경색 크기가 다릅니다. 만성 경색 모델은 정점의 원형 벽면 경색을 유도하는 반면, 허혈 재관류 모델은 심장 전체에 걸쳐 얇은 중간 벽을 유도합니다. 경색이 심장 생존력에 미치는 직접적인 영향을 분석하기 위해 Evans blue TTC 염색을 사용하여 허혈의 영향을 받지 않는 건강한 심근은 파란색, 허혈 부위 내부의 생존 가능한 심근은 빨간색, 죽은 조직은 흰색으로 나타낼 수 있습니다.일반적으로 경색 크기는 마오리 지역의 위험 지역에 대한 백분율로 표시됩니다. 1단계 염색을 통해 승모판 전에 획득한 심장 조직의 각 수준에서 첫 번째 섹션에서 분석된 파란색 염색, 경색 및 빨간색 염색된 건강한 심실 영역을 사용하여 리모델링 과정에서 발생하는 성숙한 흉터를 측정할 수 있습니다. 그런 다음 모든 절편의 경색은 총 좌심실 용적의 백분율로 표시됩니다.종래의 염색 절차도 또한, 예를 들어, 이들 이미지에서 수행될 수 있다. CD 31 및 평활근 액틴에 대한 염색을 사용하여 경색 조직에서 각각 혈관 신생 및 근섬유아세포의 존재를 밝혔습니다. 이중 형광 염색을 사용하여 심근세포가 없는 경우 자가형광이 관찰되지 않으므로 경색 영역의 다른 표적 분자를 식별합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 25, 30분 안에 완료할 수 있습니다. 높은 재현성을 보장하기 위해 충분한 통증 관리가 필요합니다. 이 절차를 따릅니다. 뇌실 내, 압력 측정, 초음파 또는 고립된 폐와 같은 다른 기능 분석을 수행할 수 있습니다.관류의 끝.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

쥐 실험 심근 경색을 유발하는 데 사용되는 외과 수술은 심장과 왼쪽 폐의 앞쪽 표면을 시각화하기 위해 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 왼쪽 thoracotomy로 시작합니다. 왼쪽 관상 동맥이 출혈도 잡았되어 가슴이 폐쇄되고 마우스가 저절로 복구 할 수 있습니다.

마우스의 관상 동맥 결합에 대한 수정 기술

이 비디오에서는 좌측 전방 하행 관상 동맥을 영구적으로 결찰하여 심근 경색의 마우스 모델을 생성하는 수술 절차에 대해 설명합니다.

심근경색의 쥐 모델 생성: 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 관상동맥의 영구 결찰을 위한 수술 절차

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

우리는 마우스 모델에서 좌측 전방 하행 동맥(LAD) 결찰에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 기관 내 삽관, 좌측 개흉술 접근법 및 흉강천자를 포함하는 다른 방법보다 상대적으로 덜 침습적입니다. 이 방법은 급성 및 만성 심근 경색(MI)에 대한 모델로 사용할 수 있습니다.

쥐 왼쪽 앞쪽에 내림차순 (LAD) 관상 동맥 결찰 : 심근 경색에 대한 개선 및 단순화 된 모델

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

이 문서는 최소 침습 적 접근을 사용하여 쥐에 있는 심근 허혈 및 후속 만성 재관전을 능력을 발휘하는 능률적인 방법을 제시합니다. 또한, 쥐의 좌심실 혈역학 적 기능은 에코카예그래피와 고립 된 작업 심장 방법에 의해 평가됩니다.

쥐의 심근 경색과 격리 된 작업 심장 시스템에 의한 심장 기능 평가를 유도하는 반 최소 침습 적 방법

적절한 마취 하에 쥐의 심장은 늑간 공간을 통해 외부화되었고, 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 좌측 전방 하행 동맥(LAD)을 결찰하여 심근경색을 성공적으로 유도했습니다.

생쥐의 심근경색 유도를 위한 수정된 간단한 방법

여기서는 미세 조작을 통해 좌측 전방 하행 관상동맥의 정밀 결찰에 의해 마우스에서 심근경색 또는 심근 허혈 재관류 손상을 유도할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다.

마우스의 심근경색 및 심근 허혈-재관류 손상 유도

여기에 제시된 것은 생쥐에서 왼쪽 관상 동맥의 영구 결찰을위한 수술 절차입니다. 이 모델은 심근 경색 후 병태생리학 및 관련 염증 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

좌측 관상동맥 결찰술: 심근경색의 외과적 쥐 모델

배우세요 쥐 심근 경색을 유도하는 최소 침습 수술 기법으로, 스테레오 현미경 하 기관 삽관과 좌하행 관상동맥 결찰을 통해 높은 생존율과 재현성을 확보합니다. 이 방법은 심혈관 질환 연구에 필수적인 동물 모델을 제공합니다.

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

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