Name: FIM 이미징 및 FIMtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 배우세요 FIM 이미징과 FIMtrack을 활용하여 Drosophila 유충의 운동을 고처리량으로 정량화하는 방법을. 이 비용 효율적인 기술은 신경과학 및 행동 분석 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 FIM 설치의 건설에 도움이 프로젝트를 시작했습니다 S. 토마스 J. 헤르만과 미국 Burgbacher에 감사드립니다. 이 작품은 DFG (SFB 629 B6)에 의해 투자되었다.

주 : 여기에서, FIM의 사용이 자유 이동 가능 조건 및 열 자극의 영향하에 스크리닝 유생 보행의 편리 높은 처리량 분석을 위해 제공된다. 이러한 후각 자극에 따라 운동 또는 요청에 따라 제공되는 프로토콜에 미묘한 변화가 필요할 수 있습니다 압연 또는 기타 행동의 고해상도 영상의 분석과 같은 다른 응용 프로그램. 실험 1. 셋업 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 통계적으로 의미있는 값을 얻기 위해 총 (필수 1 시간 시간)에서 유전자형 당 약 100 애벌레를 사용합니다. 참고 : 여러 가지 유전자형을 비교하고 다른 일에 기록해야 할 경우는 하루 유전자형 당 애벌레의 동일한 수를 기록한다. </li><li> 대부분의 응용 프로그램의 경우, 매개 변수 분석을위한 10 Hz에서 기록. 필요한 경우 고해상도 이미징 응용 프로그램의 경우, 이미징 속도를 다양하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 셋째 령 애벌레, 달걀 누워 후 120 시간에 대한 행동 실험의 추적하십시오. 쉬르 확인문화가 실험 기간 (4.3 참조)에 충분히 애벌레를 얻을 전자. </li><li> 비 자극 응용 프로그램의 경우, 반투명 한천을 포함하는 크롤링 표면을 준비 (섹션 2 참조). 열 구배 애플리케이션 자극 유충 범위를 포함하도록, 혐오 염 한천 배리어 (섹션 3 참조)으로 시야를 둘러싸. 참고 : 다른 응용 프로그램은 서로 다른 표면을 필요로 할 수있다. </li><li> 일정한 환경 조건 (온도, 빛, 공기 흐름, 공기 습도 등)와 함께 방을 사용하십시오. </li></ol> 2. 크롤링 표면 처리 (반투명 한천) 참고 : FIM 설정에서 한천 표면이 촉촉한 크롤링 표면을 제공하기 위해 추가됩니다. 게다가, 그것은 또한 조명 특성을 향상시킨다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 탈 초순수에서 0.8 % 식품 등급 한천을 끓인다. 심사 응용 프로그램의 경우 400 ml의 준비를합니다. </li><li> 별도의 33cm X 33cm 교류에 50 ° C (손 핫)에서 한천을 부어카 프릴 유리 접시입니다. 한천의 표면 장력 때문에 온도를 한천의 슬래브 두께를 정의한다. 50 ° C에서, 두께 2mm 한천 슬래브를 얻을 수있다. 끓는 후 교반과 거품을 방지하기 위해 지속적으로 붓지 마십시오. 약 4 시간의 모든 영상 기간 동안 신선한 한천 석판을 준비합니다. </li><li> 깨끗하고 정렬하고 실험 전 (유전자형 당 1 접시)에 유충을 길들 나머지 0.8 % 한천 용액을 표준 6cm 페트리 접시를 입력합니다. </li><li> 혐오 한천 장벽이 응용 프로그램에 필요한 경우, 섹션 3으로 진행합니다. </li><li> 레코딩 평면 정사각형 표면을 얻기 위해 한천 슬래브의 둘레의 약 2cm 잘라내. 초과 한천을 제거합니다. 참고 : 크기는 응용 프로그램에 따라 다릅니다. </li><li> 직접 부드럽게 아크릴 유리판의 가장자리 글라이딩 한천을 눌러 냉각 후 FIM 설치에 한천 슬래브를 전송합니다. </li></ol> 3. 선택 사항 : 밥통에 혐오 한천 배리어 추가링 표면 (소금 한천) <ol style="margin-left: 40px;"><li> 탈 초순수에 3 M NaCl로 2.5 % 식품 등급 한천을 끓인다. 열 구배에 심사를 들어 200 ml의 준비를합니다. 참고 : 볼륨은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. </li><li> 이전에 2cm 넓은 홈을 잘라보기 (22 X 22cm)의 분야를 둘러싼 크롤링 표면을 쏟아 냈다. 주의 : 다른 형태의 배리어 및 뷰 필드가 애플리케이션에 따라 요구 될 수있다. </li><li> 추적 표면보다 0.1 ~ 0.3 cm 높은 소금 한천과 노치를 입력합니다. </li></ol> 4. 플라이 처리 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 후면 65 %의 습도에서 표준 플라이 음식에 실험의 시간으로 조정 12 시간 빛 / 어둠주기와 25 ° C 배양기에 날아간 다. </li><li> 십자가를 들어, CO 2 (30) 처녀 여성 파리와 8 명의 남성을 마취하고 35 ml의 음식을 130 ml의 배양 병에서 그들을 교차. 참고 : 35 ml의 음식과 함께 한 130 ml의 문화 병은 20 ~ 30 패 얻을 것입니다4 시간의 촬상 범위 내에서 세 번째 령 애벌레를 먹었다. 모든 애벌레 령 단계에 대한 이미징 및 추적 작품. </li><li> 후반 세번째 령 애벌레의 움직임을 운전하고 작은 붓을 이용하여 유리 병 벽에서 가장 큰 애벌레를 수집하는 문화 유리 병에 물을 조금 삭제합니다. </li><li> 녹화 전에 2-5 분, 습관화하고 청소를 탈 초순수에서 0.8 % 식품 등급 한천을 포함하는 페트리 접시에 하나의 비디오 전송 애벌레. </li></ol> 5. 녹음을위한 FIM 이미징 설치 (비 자극 조건) 조정 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 필요한 경우 카메라 렌즈의 초점과 조리개를 조정합니다. 각 카메라의 노출 시간을 설정합니다. 주 : 이러한 설정은 실험 중에 변경 될 필요가 없다. </li><li> 한 유충 이미징에 의해 좋은 대조를 얻기 위해 조명 강도를 조정합니다. </li><li> 녹음하는 동안 방 상수의 환경 조건을 유지합니다. 방향 빛 유충을 방해하지 않도록 방을 어둡게. </li></ol> 6. 옵션 : 녹음을위한 FIM 이미지 설정 (점진적 온도 자극 조건) 조정 주 : 열 구배 디바이스는 최고 위치에 맷 블랙 페인트 및 격리 재료와 42 X 42 X 0.2 cm 3 알루미늄 판이다. 플레이트 양단 calorifiers / 냉각기 및 펌프에 연결된 두 개의 서로 다른 회로에서 물 관류된다 (도 1b 참조). 온도는 -5에서 50 ℃로 조절 될 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 실험에 앞서 열 구배 장치 1 시간 켜고 평형을 원하는 온도 프로파일 및 구성 요소를 구축 할 수 있도록 설정 위에 놓습니다. </li><li> 설정에 소금 장벽으로 크롤링 표면 한천을 전송합니다. </li><li> 한천 위에 방열판을 놓고 (~ 유충 위의 1mm)를 접시와 2mm로 크롤링 표면 사이의 간격을 조정합니다. </li><li> 선형 구배의 수립적어도 0.8 ° C 34 ° C (약. 시야의 배리어에서 2cm)로부터 18 ° C (약. 시야에 대향하는 부위에서 배리어에서 2cm)을 조정하여 행 / cm 1 ° C와 45 ° C의 물 회로의 온도. 참고 : 금속판의 다른 그라데이션 특성을 경험적으로 확인해야 할 다른 온도를 필요로한다. 이러한 설정은 실험 중에 변경 될 필요가 없다. </li><li> 5 절에 설명 된대로 설정을 조정합니다. </li><li> 크롤링 표면이 20 분 동안 실험 전에 그래디언트에서 평형을 허용합니다. 파이로 미터와 온도 구배를 테스트합니다. </li><li> 섹션 8을 진행합니다. </li></ol> 7. FIM 이미징 (비 자극 조건) <ol style="margin-left: 40px;"><li> 부드럽게 요법 이니 배양 접시에서 15 애벌레를 수집하고 추적 표면의 센터로 전송하는 작은 젖은 붓을 사용합니다. 음식이 남아 또는 너무 많이 전송하지 마십시오물 (7.8 참조). </li><li> 기록 1 - 22cm X 22cm 추적 영역에 50 애벌레. (통계 이유는 유전자형 당 최소 100 개인 사용을 위해) 가장 심사 응용 프로그램에 비디오 당 15 동물을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 유충을 분리하고 모든 애벌레 기록하기 전에 바로 움직이기 시작 때까지 약 10 ~ 20 초 동안 기다립니다. </li><li> 비 자극 조건에 대한 초당 10 프레임의 속도로 2 분 동안 애벌레 운동을 기록합니다. 출력 형식으로 압축되지 않은 TIF 이미지를 사용합니다. </li><li> 촬영하는 동안, 그들을 길들 유리 병에서 다음 비디오 애벌레를 수집 긴급 :. 빛 기록 유충을 방해하지 마십시오. </li><li> 녹화 후, 큰 붓으로 유충을 제거하고 지역의 안전과 법률 규정에 따라이를 폐기합니다. </li><li> 애벌레를 제거한 후, 청소 및 초순수 탈 이온수로 크롤링 표면에 수분을하기 위해 붓을 사용합니다. </li><li> 긴급 : 항상 촉촉한 표면을 유지하지만 과도한 개월을 피하기후광 또는 녹음에 유충을 둘러싼 방울과 방해 추적으로 볼 수있다 isture. </li></ol> 8. 옵션 : FIM 이미징 (점진적 온도 자극 조건) <ol style="margin-left: 40px;"><li> 온도 구배 (섹션 6 참조)을 설정 한 후에, (8.2 참조) 예 크롤링 표면에 유충을 배치 한 후 20 초 이내에 기록 인스턴트위한 기록 소프트웨어를 준비 비디오 당 프레임의 수를 설정하고, 저장 경로를 정의한다. </li><li> 약간 방열판을 들어 올리고 소금 장벽에서 33 ° C 2cm에서 애벌레를 놓습니다. 더 일반적인 지침은 6과 7을 참조하십시오. 다시 방열판을 내리고 유충 똑바로 움직이기 시작 직후 3 ~ 4 분 동안 녹음을 시작합니다. </li><li> 녹화 후, 직접 청소를 유충을 제거하고 표면에 수분을. 염화나트륨의 확산을 방지하기 위해 소금 한천을 만지지 마십시오. </li><li> 긴급 : 항상 촉촉한 표면을 유지하지만 피후광 또는 녹음에 유충을 둘러싼 방울과 방해 추적으로 볼 수있다 과도한 습기. </li><li> 이미지를 저장하고 다음 동영상을 준비하기 전에 새로운 동물을 수집하는 동안, 한천 표면이 1-2 분 동안 보습 후 다시 평형을 허용합니다. 고온계마다 5 동영상을 이용하여 온도 구배를 제어하고, 필요한 경우 (추적면에 대하여 물 온도, 높이 및 XY 방향)의 온도 조절 장치. </li></ol> 애벌레 로코 9. 추적 참고 : 자세한 내용은 FIMTrack (보충)에 대해 첨부 된 설명서를 참조하십시오. 프로그램 흐름도는 그림 2 참조하십시오. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 미리보기 옵션을 사용하여 각각의 실험에 대한 추적 매개 변수를 조정합니다. <ol><li> 카메라와 시야에 따라 cm 당 픽셀을 조정합니다. </li><li> 카메라 설정에 따라 초당 프레임을 조정합니다. </li><li> 일 때문에 밝기 임계 값을 조정모든 동물에서 (피드백이 미리보기에 나와있다) 제대로 감지됩니다. </li><li> 애벌레 영역 크기 임계 값을 조정합니다. 미리보기에서 피드백 옵션을 참고 : 하나의 동물은 빨간색으로 강조 표시됩니다 각 동물의 영역이 파란색으로 주어진다 유충 충돌, 노란색으로 강조 표시됩니다. </li></ol></li><li> 오른쪽 하단에있는 버튼을 사용하여 추적을 시작합니다. 참고 : 성공적으로 추적 한 후, 애벌레 트랙과 계산 된 운동 및 자세 기능을 포함하는 CSV 파일을 갖춘 이미지가 이미지 디렉토리에 저장됩니다. </li><li> 추적 결과를 검토하고 수동으로 조정 FIM 결과 뷰어 모듈 (편집&gt; 결과보기를 ...)를 사용합니다. 필요한 경우, 취제 소스에 열 구배 또는 거리에 대하여 방향을 크롤링, 자극 정권 예에 대한 데이터를 평가하는 자극 영역을 정의합니다. 더 자세한 설명은 매뉴얼 (보충)을 사용하십시오. </li></ol> 상기 데이터의 평가 (10) <ol style="margin-left: 40px;"><li> 엑셀, matlab에로 csv 파일 또는 추가 통계 분석을위한 다른 프로그램을 가져옵니다. </li></ol>

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행동 신경 과학에서는 정량적으로 복잡한 행동 특성을 해독 필수입니다. 따라서, 많은 개인은 고해상도로 관찰 자동화되어야 절차는 통계 분석을 위해 필요하다. 여기서, FIM 이미지는, 동물의 넓은 범위의 운동을 모니터링하는 수단을 제공하는 신규 한 간단하고 강력한 촬상 설정을 설명한다. FIM 영상 설정의 효능은 초파리 애벌레, 플라나리아 편형 동물와 C를 사용하여 테스트 하였다 엘레 웜. FIM 기술은 뇌, 기관, 창자 또는 proventriculus 같은 동물의 경우에도 내부 구조를 감지하는 본질적으로 높은 콘트라스트를 제공합니다. 그들은 자동적 동물 (19)의 방향을 식별하는 역할을 할 수 있도록 중요한 것은,이 내부 구조는 견고하게 식별된다. 영화의 품질은 크롤링 표면에 물 과잉에 의해 영향을받을 수있다. 따라서,에 중요한천의 수분을 제어 할 수 있습니다. 표면에 너무 오래 한천 또는 물을 너무 많이 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 기포가 크롤링 표면에 포함되지 않도록. 일반적으로, 잘 준비된 한천 표면은 4 시간 동안 동영상을 녹화 할 수 있습니다. 때문에 실제 기본 원칙을 FIM 이미징은 최상의 이미지 품질의 결과, 거의 소음 무료 이미지 기록을 생성합니다. 이것은 차례로 후속 컴퓨터 기반 이미지 분석을 용이하게하고 높은 처리량을 가능하게한다. 그러나, 방법론은 직접 한천 표면에 접촉 동물을 분석 제한됩니다. 추적 소프트웨어는 도넛 모양을 형성하는 동물에 의해 도전한다. 이진 표시가 도넛 모양을 인식하고 있지만, 잘못된 척추가 계산 될 수 있습니다. 때문에 추적 테이블 듀얼 및 트리플 컬러 이미지의 모듈 구성에 도달입니다. 또한, 추가 자극 (빛, ​​냄새 물질, 전기 또는 기계적 자극)을 쉽게 할 수 있습니다 델위에서 ivered. FIM 이미지의 힘과 일치하도록 설계 FIMTrack 프로그램 용이 초파리 애벌레 C.을 추적 채용 할 수있다 엘레 또는 플라나리아. 따라서 인해 그것의 간단하고 저렴한 구성에 (http://FIM.uni-muenster.de 참조), FIM 이미징은 생물 의학 응용 프로그램의 광범위한 가능하다 특히 긴급 높은 처리량 연구를 필요로 허용한다.

대부분의 동물은 매우 정교하고 제어 된 방식으로 이동할 수있는 능력을 가지고있다. 유전 적 기초 기본 운동 제어를 해독하기 위해서는 정량적으로 다른 행동 패턴을 평가하는 것이 필수입니다. 이러한 관점에서, 초파리는 이상적인 모델이 될 수있다. 자유롭게 비행 초파리의 추적 감질 1-4 발생하지만 상대적으로 낮은 속도로 두 가지 차원에서 초파리 애벌레의 크롤링 때문에 쉽게 모니터링 할 수있다. 적절한 조명과 함께 카메라 기반의 설정은 이미지 5를 획득하는 데 사용됩니다. 사건이나 투과광 모두 행동 실험 6,7에 사용된다. 그러나, 애벌레와 애벌레 운동의 크롤링 표면 충실한 기록 가능한 빛의 반사의 반투명 몸에 도전 할 수있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 어떤 복잡한 방법이 고안되었다. 최근, 암시 야 조명은 전경 / 배경 계속을 향상시키기 위해 도입되었다RAST 8. 카메라로 기록, 렌즈가없는 광학 이미징에 대한 대안으로 이미지 센서리스 온칩 (on-chip) 획득 기술은 9 ~ 11 도입되었습니다. 여러 추적 프로그램은 상용 소프트웨어 (12) 및 사용자 정의 솔루션을 포함하여, 최근에 도입되고있다. 높은 처리량 추적 프로그램에 대한 예는 멀티 웜 추적기 (MWT) 아르 (13)과 Multianimal 보행 그리고 트랙 (MAGAT) 8. 충돌 동물 여러 새로운 동물 정체성으로 이어질 수 있도록 모두 공통으로, 여러 개의 동물은 하나의 오픈 필드 경기장에서 추적 할 수있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 멀티 웰 설정 개별 웰 (14) (12)으로 분리하는 동물을 도입 하였다. 단일 개인의 운동을 정밀하게 정량화 현미경 (15)과 결합하여 가동 추적 스테이지를 사용함으로써 달성 될 수있다. 그러나, 이러한 모든 접근 방식 중 하나를 비용 효율적이지, 부족 충분한 재솔루션 또는 높은 처리량 표현형에 대한 소요 시간이 너무. 좌절 전체 내부 반사 (FTIR) (16) (도 1)에 기초하여 상기 언급 된 한계를 극복하기 위해, 우리가 개발 한 FIM (FTIR 기반 이미징 방법). 이 새로운 이미징 방식은 전례없는 높은 콘트라스트를 제공하고, 심지어 동물 (16)를 크롤링의 멀티 컬러 녹음을 할 수 있습니다. 이 편리하고 효과적인 방법의 기본 원리는 쉽다. 아크릴 유리판을 빛으로 범람 (예를 들어, 875 적외선 ㎚). 아크릴 인해 유리 및 공기의 굴절률이 다른으로, 광은 완전히 유리 / 공기 경계에서 반사된다. 아크릴 유리의 어떠한 가열 (16)을 언급하지 않습니다. 높은 굴절률을 가진 물체가 빛을 홍수 테이블을 터치하는 경우에만 이러한 개체를 입력 빛을 수 있습니다. 동물이 표면을 터치하면 빛이 반사되어 (그림 1) 아래에서 캡처 할 수 있습니다. 이에 의해, 접촉 만동물의 영역은 전반적으로 검은 배경으로 상세한 영상을 수있는 밝은 반점으로 나타납니다. 따라서, FIM-영상은 컴퓨터 비전 알고리즘에 대한 완벽한 동영상을 녹화 할 수 있습니다. FIM의 간단하고 강력한 사용 해주기로 이동할 복잡한 동물 행동의 상세한 분석 높은 처리량을 제공 및 처리 내용을 연구에 사용될 수있다 : 예를 들어, 후각 (8), (16); 비전 17 thermosensation (18). <img alt="그림 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650"> 열 자극 통합 및 기본 물리적 원리 1. FIM 설치 그림. (A) FIM 설치. 조명 강도는 전면 패널에서 조절 될 수있다. (B) 열 자극을 제공하기 위해, 블랙, 알루미늄 판을 그린 양쪽에 온수와 냉수 관류, 한천 표면 위에 2mm를 배치되는자체는 두께 2mm이다. 구배는 온도차에 의해 방열기 판과 한천에 확립된다 (C) 좌절 전반사의 물리적 원리는 :. 아크릴 유리판 외광에 의해 조명된다. θ 1, θ 2, θ 3은 빛의 반사 각도를 나타냅니다. N 1, N 2, N 3 n은 각각 공기, 아크릴 유리, 한천과 유충의 굴절률을 표시하고 불평등 N &lt;n은 1 &lt;n은 2 &lt;없음 3을 충족해야합니다. 굴절로 인해, 반사각 전환하는 동안 변경한다. 각도가 임계각 이하인 경우, 빛이 더 이상 반영되지 않습니다, 층을 통과 할 수 아래에서 캡처 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> SPFIM 분석 할 수있는 프로세스의 ectrum은 광범위합니다. 더 이상의 조정없이, FIM 이미지는 초파리 (도 5b)의 모든 유생을 모니터링하는 데 사용할 수있는 성인 초파리 19 피트의 인쇄를 수행하기 위해 사용될 수있다. C.의 마찬가지로, 궤적 엘레 또는 플라나리아 편형 동물의 이동이 용이 (그림 5C)를 기록 할 수있다. 곰팡이 균사 또는 루트 모발 성장에도 분석이 가능한 19 나타납니다. 현재 FIM 설정에서, 4 × 16 적외선 발광 다이오드 (IR-LED)는 (그림 1) 추적 테이블이라고, 32 X 32cm 2 아크릴 유리판에 통합되어 있습니다. IR-LED의 강도를 용이 펄스 폭 변조 (PWM)를 통해 회로에 접속 된 마이크로 제어기에 의해 수행 될 수있는 추적 테이블 물체의 무게에 따라 조정된다. FIM은 조명 강도의 넓은 범위에 걸쳐 매우 높은 콘트라스트 이미지를 산출한다. 중요한 것은 세대이미 전반적으로 낮은 적외선 irridation에서 우수한 결과를 로지로. 적외선 필터와 카메라가 설치에 추가 자극에 통합 할 수 있습니다 추​​적 테이블 아래에 배치됩니다. 열 자극에 쉽게 방열기 판에 의해 도포 될 수 있고, 광 자극은 LCD 프로젝터에 의해 적용된다. 또한 방향제 간단한 뚜껑 (8)에 의해 기울기에 함유 될 수있다. 열 구배 실험을 위해, 방열기 판은 각각 양측에 냉온수 관류 및 유충 (도 1b) 위에 2mm 배치. 고 대비, 고품질의 영화의 생성을 정교한 컴퓨터 기반 이미지 분석을위한 가능성을 열어, 따라서 우리는 이미지에서 기능의 큰 세트를 추출 할 수있다 (그림 2) FIMTrack 소프트웨어를 구현했습니다. 상반기 주요 기능은 동물 (그림 3A)의 윤곽에서 정의되었다. 이러한 기능은베이스 라인을 제공주어진 시점 (그림 3B)에서 동물 모양과 특정 자극에 자신의 위치를 설명 여섯 보조 기능의 추가로 계산. 현재, 아홉 급 기능 시간적 측면을 통합함으로써 기본 및 보조 기능 (도 3c)와 함께 동물의 운동을 특성화되는 계산된다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650"> 그림 2. FIMTrack 개요, 알고리즘 워크 플로우와 애벌레 표현입니다. (A) 어떻게 FIMTrack를 사용합니다. 이미지가로드됩니다. 회색 값을 임계 값과 하나의 유충을 정의 애벌레 크기 임계 값을 설정해야합니다. 애벌레 지역은 [최소 크기, 최대 크기]에 있어야합니다. 추적 강조 표시된 버튼으로 시작됩니다. (B) 추적 워크 플로우를. 시작 버튼이 클릭되면, 배경 이미지는 CAlculated (시간에 최소한의 강도). 만큼 왼쪽 프레임이 있기 때문에, 유충은 회색 임계 값과 min- 및 최대 크기 임계 값을 기준으로 분할된다. 애벌레 표현이 계산되는 모든 세분화를 들어 ((C)에 비교). 각각의 새로운 모델이 올바른 트랙을 사용할 수있는 경우 주어진 궤도에 연결되어 있습니다. 최종 프레임에 도달하면, 마무리 처리 후 출력 생성 뒤에 행해진 다. (C) 유생 표현. 동물은 머리와 꼬리 포인트 (시간 및 t)로 구성되어 있습니다. 이들 점 사이의 척추 포인트 S의 임의의 홀수 번호가 나는 반경 R I로 설정 될 수있다. 또한, 질량 m과 각도 γ 굽힘 본체의 중심이 계산된다. 여러 운동 관련 매개 변수가 보라색 선으로 스케치한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> FIMTrack에 의해 계산 3. 특징을 그림. 동물의 윤곽에 따라 (A) 1 차 기능을 제공합니다. (B) 보조 기능, 주요 기능을 기반으로. (C) 고등 기능, 연속적인 프레임 및 추가 입력의 기본 기능에 따라 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.</a>

<table><tbody><tr><td>FIM 설정</td><td>사용자 지정&nbsp;</td><td></td><td>구성 또는 설치 구매에 대한 세부 사항은 요청 시 제공됩니다</td></tr><tr><td>. 아크릴 유리 플레이트</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td></td><td>추가 한천 주입</td></tr><tr><td>열 라디에이터 플레이트</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td></td><td>조절 가능한 장착으로 반대편 위치에 침투 가능한 알루미늄 플레이트(매트 블랙)</td></tr><tr><td>물 열량화기/냉각 펌프 및 호스</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td></td><td>GE 헬스케어 MultiTempIII (No.: 18-1102-78) 및 Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td></tr><tr><td>표준 카메라 (4 MP)</td><td>Basler</td><td>acA2040-25gm</td><td>카메라는 FIM 설정에 기본적으로 사용됨</td></tr><tr><td>테스트 카메라 (1.4 MP)</td><td>QImaging</td><td>&nbsp; 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td><td>카메라 비교에 사용</td></tr><tr><td>테스트 카메라 (0.8 MP)</td><td>Point Grey</td><td>Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td><td>비교에 사용 된 카메라</td></tr><tr><td>테스트 카메라 (0.3 MP)</td><td>Sony</td><td>PS Eye USB2.0 카메라</td><td>비교에 사용 된 카메라</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>사용자 정의&nbsp;</td><td></td><td>최소 i5 Intel 프로세서 이상, 16GB RAM 및 충분한 HDD 저장 공간 [>1TB]</td></tr><tr><td>을 갖춘 Standard Fly food</td><td>Custom&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스탠다드 플라이 바이알 135 ml</td><td>Sarstedt AG& Co, N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>78,895</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 9cm</td><td>Sarstedt AG& Co, N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>821,473</td><td></td></tr><tr><td>초순수 탈이온수</td><td>Merck Millipore, 다름슈타트, 독일</td><td>시너지&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Food grade agar</td><td>AppliChem GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td>A0917,5000</td><td></td></tr><tr><td>붓 (소형 및 대형)</td> <td>Milan</td><td>Aquarell 310 크기 0 및 2</td><td></td></tr><tr><td>고온계</td><td>Trotec</td><td>BP20</td><td></td></tr></tbody></table>

fim 이미징 및 fimtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

신경 네트워크 기능의 분석은 행동 특성의 신뢰성있는 측정이 필요합니다. 자유롭게 움직이는 동물의 행동이 어느 정도 변수이기 때문에, 많은 동물은 유의 한 데이터를 획득하기 위해 분석되어야한다. 이는 다시 운동 패턴의 컴퓨터를 이용한 자동화 된 정량화가 필요합니다. 반투명의 작은 거의 움직이는 물체의 콘트라스트가 높은 화상을 얻기 위해,라는 FIM 좌절 전반사에 기초한 새로운 자기 공명 영상 법이 개발되었다. 이 설정에서, 동물은 기본 크롤링 표면과의 접촉 매우 특정한 위치에서 적외선 빛으로 조명. 이 방법론은 매우 높은 콘트라스트 이미지를 초래한다. 이어서, 이들의 높은 콘트라스트 이미지는 설정된 윤곽 추적 알고리즘을 사용하여 처리된다. 이를 바탕으로, 우리는 정량적 운동의 큰 다양성을 설명하는 데 필요한 특징을 추출하는 역할을 FIMTrack 소프트웨어 개발특성. 이 소프트웨어 패키지의 개발 과정에서, 우리는 추가 모듈을 쉽게 추가 할 수 있도록 오픈 소스 아키텍처에 우리의 노력을 집중했다. 프로그램은 플랫폼 독립적 인 동작 및 데이터 분석을 통해 사용자를 안내 직관적 GUI 수반한다. 모든 운동 매개 변수 값은 상기 데이터 분석 있도록 CSV 파일의 형태로 주어진다. 또한, 추적 소프트웨어에 통합 결과 뷰어 대화식 검토 자극 적분 동안 필요할 수있는 바와 같이, 출력을 조정하는 기회를 제공한다. FIM과 FIMTrack의 힘은 초파리 애벌레의 운동을 연구에 의해 입증된다.

다른 해상도 속성과 여러 다른 카메라 이미징 (그림 4) 시험 하였다. 적절한 IR 필터가 장착 모든 카메라. 이 시험에서 가장 저렴한 가격 카메라 저해상도에 따르면, 시야각은 10 ㎝로 제한된다. 최상의 결과를 4 메가​​ 픽셀 (MP) 카메라를 사용하여 얻을 수 있었다. 이 세 번째 령 유충의 길이 당 100 픽셀의 해상도에 이르게 쉽게 내부 구조를 인식 할 수있었습니다. 또한, 동물의 연동 운동을 쉽게 (도 4A)를 추출 할 수있다. 그러나, 하나는 여전히 또한 FIMTrack 의해 분석 될 수 저렴 카메라를 사용하여 높은 콘트라스트 영화를 얻을 수있다. 8 비트의 깊이와 1392 X 1040 픽셀의 해상도를 가진 1.4 MP 카메라를 이용하면 약 절반 가격이며 시야 제 3 령 유충 길이 당 45 픽셀의 해상도를 허용한다. 머리하지만 다른 내부 구조를 인식 할 수 없습니다 (그림 4B). 추적 및 연동 운동의 검출이 가능하지만 정확도는 (그림 4B)을 감소한다. 1.4 MP 카메라에 필적하는 공간 해상도와 저렴 0.8 MP 카메라, 애벌레 머리 (그림 4C) 더 이상 충실하게 인식 할 수 없습니다. 추적 및 연동 분석이 가능하지만, 증가 된 잡음에 기초하여 더 많은 지터를 포함. 놀랍게도, 심지어 낮은 해상도 USB 웹캠 (20 €, 그림 4D 이하, 0.3 MP 카메라) 유생의 궤적을 계산하는 데 충분한 품질의 동영상을 제공합니다. 연동이 영역으로부터 계산 될 수 있지만, 성능은 매우 잡음이다. 우리의 설정에서 우리는 일상적으로 4 MP 카메라를 사용합니다. 스크리닝,이 카메라는 분명히 높은 처리량 분석이 가능되도록 동시에 다수의 동물을 분석 할 수있는 기회를 제공 22cm X 22cm 아레나 모니터링 허용한다. 이 설정을 사용하여 유충의 길이 난스틸 녹화 연동 운동의 분석을 허용 40 픽셀로 표시 s는. 열 구배 15 유생의 궤적은 예시적인 화상도 5a에 제시되어있다. 또한, 매크로 렌즈의 사용은 많은 내부 장기가 표시되고 헤드 인식이 더 (그림 5B)를 향상 매우 높은 해상도와 이미지 유충에 있습니다. 또한 이들은 넓은 범위 (20)의 동작의 더 상세한 분석을 위해 사용될 수있다. 같은 설정은 쉽게 이미지 C.를 크롤링하는 데 사용할 수 있습니다 엘레 웜 (그림 5C). <img alt="그림 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650"> 그림 다른 카메라 4. FIM 이미징 및 추적 결과. 왼쪽 (A) : 초당 10 프레임으로 4 MP 카메라를 사용하여 촬영 10cm X 10cm 추적 단계에 크롤 링 세 애벌레의 FIM 영상. 중간 :클리핑 및 단일 유충의 대량 궤도의 중심. 동물의 영역이 표시된다. 오른쪽 : 유충의 면적은 100 프레임 이상 꾸몄다. (A)와 동일하지만, 0.8 MP 카메라를 사용하여 촬영 빨간색 화살표가 잘린 이미지의 시점을 나타냅니다. (A)와 동일하지만, 1.4 MP 카메라를 사용하여 촬영 (B). (C). (D) 동급 ( A)하지만 0.3 MP 카메라를 사용하여 촬영. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650"> 그림 5. 열 자극, 높은 해상도 응용 프로그램. (A) 열 자극 응용 프로그램 (그림 1 비교). 궤적은 FI를 통해 계산MTrack. (B) 매크로 렌즈를 사용하여, 세 번째 두 번째와 첫 번째 령 유충의 높은 해상도 응용 프로그램 이미지. 셋째 령 유충의 길이는 2.5 × 2.5 cm의 시각 필드 (400)의 픽셀에 의해 표현된다. (C) C. 엘레 웜은 FIM 이미지를 사용하여 캡처. 스케일 막대가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

FIM은 C. 작은 이동 물체를 추적하도록 설계된 신규 한 비용 효율적인 이미징 시스템 엘레, planaria 초파리 애벌레. 첨부 FIMTrack 프로그램은 빠르고 효율적인 데이터 분석을 제공하도록 설계되었습니다. 이 도구들을 함께 행동 특성의 높은 처리량 분석을 할 수 있습니다.

FIM 이미징 및 FIMtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

다음 방법론의 전반적인 목표는 Drosophila Melan Gaster 유충의 이동을 시각화하고 정량화하여 자유로운 이동 조건에서 높은 처리량의 스크리닝을 가능하게 하는 것입니다. 이는 FIM 설정에서 추적 표면을 만들고 간접 조명에 대해 좌절된 내부 전반사를 사용하여 달성됩니다. 그런 다음 다른 유전자형의 유충을 표면에 배치하고 열 구배에 반응하여 기어 다니는 행동을 기록합니다.그런 다음 FIM 트랙에서 비디오를 분석합니다. 얻은 소프트웨어와 데이터는 유충의 차이, 운동 패턴을 설명하는 플롯을 생성하는 데 사용됩니다. 결과는 유충의 정확하고 높은 처리량, 유연하고 사용하기 쉬운 정량화를 보여줍니다.이동은 FIM 이미징 기술 및 관련 FIM 트랙 프로그램을 기반으로 수행할 수 있습니다. 입사광 또는 투과광을 사용하는 것과 같은 기존 방법의 이 이미징 기술의 주요 장점은 표면에 닿는 동물만 볼 수 있어 방해가 되는 아티팩트가 없는 뛰어난 전경 배경 대비를 얻을 수 있다는 것입니다. 또한 바다의 우아함, 전체적 또는 식물의 뿌리 성장과 같은 다른 단일 유기체의 보행 행동, 파리 및 이동을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 복잡한 기술을 사용하기 쉽다는 것을 다른 사람들에게 확신시키는 데 중요합니다. 첫 번째 단계는 FITR 기반 이미징 방법 또는 FIM을 위한 촉촉한 크롤링 표면을 만드는 것입니다. 이 종기를 일으키기 위하여는, 탈이온화된 초순수에 있는 0.8%food 급료 송곳.뜨거운 오거를 아크릴 유리판에 붓습니다. 끓인 후 오거를 휘젓지 말고 계속 붓습니다. 이 온도에서 기포를 방지하려면 2mm 두께의 슬래브를 만들어야 합니다.나머지 오거 용액을 사용하여 표준 6cm 페트리 접시를 채웁니다. 이것들은 실험 전에 유충을 분류하고 청소하고 습관화하는 데 사용됩니다. 다음으로, 오거 슬래브 둘레에서 약 2cm를 잘라 기록을 위한 평범한 정사각형 표면을 얻습니다.냉각 직후 오거 슬래브를 FIM 설정으로 옮깁니다. 아크릴 유리판의 가장자리 위로 오거를 부드럽게 밀면 오거가 제자리에서 미끄러지듯 움직여야 합니다. 이제 크롤링 표면에 혐오성 오거 장벽을 포함하기 위한 이미징 준비를 할 준비가 되었습니다.탈이온화된 초순수에 3개의 어금니 NACL을 가진 2.5%food 급료 송곳을 종일하십시오. 다음으로, 시야를 둘러싼 2cm 너비의 노치를 이전에 부은 크롤링 표면으로 자릅니다. 준비가 되면 추적 표면보다 0.1-0.3cm 높은 소금 오거로 노치를 채웁니다.다음으로 열 구배 장치를 준비합니다. 이 장치는 절연 표면으로 덮여 있고 양쪽 끝에서 펌프의 물로 관류되는 알루미늄 판입니다. 온도 제어를 허용하려면 사용 1시간 전에 열 구배 장치를 켜고 원하는 온도에 도달할 수 있도록 설정 위에 놓으십시오.이 시간은 추가 준비에 사용할 수 있습니다. 준비가 되면 소금 장벽이 있는 크롤링 표면 오거를 설정으로 옮깁니다. 라디에이터 플레이트를 오거 위에 놓고 플레이트와 크롤링 표면 사이의 간격을 2mm로 조정합니다.물 회로의 온도를 이 장비에 적합한 섭씨 1도 및 섭씨 45도로 조정하여 섭씨 34도에서 섭씨 18도까지 선형 그라디언트를 설정합니다. 크롤링 표면이 20분 동안 기울기에서 평형을 이루도록 합니다. 진행하기 전에 TER로 온도 구배를 테스트하여 파리를 준비하고, 섭씨 25도의 인큐베이터에서 파리를 회수하고, 배양 바이알에 약간의 물을 떨어뜨려 별 유충의 이동을 늦춥니다.다음으로, 녹화하기 2-5분 전에 작은 붓을 사용하여 유리병 벽에서 가장 큰 유충을 모으고, 한 개의 비디오에 충분한 유충을 이전에 준비한 페트리 접시에 옮깁니다. 온도 구배가 설정되면 녹음 소프트웨어를 설정합니다. 비디오당 프레임 수를 지정합니다.저장 경로를 정의하고 20초 이내에 즉시 녹화할 수 있도록 설정합니다. 유충을 크롤링 표면에 배치한 후 유충 중 하나를 이미지화하고 조명 강도를 조정하여 좋은 대비를 얻습니다. 준비가 되면 라디에이터 플레이트를 약간 들어 올리고 유충을 염분 장벽에서 2cm 떨어진 섭씨 34도에 놓습니다.라디에이터 플레이트를 다시 내리고 동물을 방해하지 않도록 어둠 속에서 녹음을 시작하십시오. 녹음 후 유충을 깨끗하게 제거하고 표면에 수분을 공급하십시오. NACL이 퍼지는 것을 방지하려면 작업하는 동안 소금 오거를 만지지 말고 표면은 항상 촉촉한 상태를 유지해야 하며 유충을 둘러싼 후광이나 방울로 보일 수 있는 과도한 수분을 피하십시오.녹음 및 방해 추적에서는 진행하기 전에 오거 표면이 1-2분 동안 평형을 이루도록 합니다. 이 시간 동안 수집된 이미지를 저장하고 새로운 동물을 모으십시오. 다음 비디오를 준비하려면 5개의 비디오마다 TER을 사용하여 온도 구배를 제어하고 필요한 경우 온도 장치를 조정하십시오.이동 추적을 시작하려면 미리보기 옵션을 사용하여 추적 파라미터를 조정하십시오. 카메라와 시야에 따라 픽셀당 밀리미터를 조정합니다. 그런 다음 카메라 설정에 따라 초당 프레임을 조정하고 미리보기 창에 제공된 피드백을 사용하여 모든 동물이 올바르게 감지되도록 밝기 임계값을 조정합니다.다음으로, 유충 영역 크기 임계값을 조정하고, 단일 동물은 노란색 원으로 강조 표시되고, 충돌하는 유충은 빨간색으로 강조 표시되며, 각 동물의 영역은 파란색으로 표시됩니다. 추적 세션 후 오른쪽 하단의 버튼을 사용하여 추적을 시작하면 유충 추적이 포함된 이미지와 계산된 이동 및 자세 기능이 포함된 CSV 파일이 이미지 디렉토리에 저장됩니다. 마지막으로 FIM 결과 뷰어 모듈을 사용하여 추적 결과를 검토하고 수동으로 조정합니다.열 구배에 대한 크롤링 방향을 정의하여 이 자극을 기반으로 데이터를 평가합니다. 여기에 표시된 유충 표현에서 머리와 꼬리 지점은 이 점 사이에 표시되어 있습니다. 임의의 홀수 개의 스파인 점을 반경으로 설정할 수 있습니다.또한 질량 중심과 본체 굽힘 각도가 계산됩니다. 다음은 다양한 카메라의 FI 이미징 및 추적 결과입니다. 왼쪽의 이미지는 10cm x 10cm 크기의 추적 단계에서 기어 다니는 세 마리의 유충을 포착합니다.단일 유충의 질량 궤적과 면적이 오른쪽에 표시됩니다. 빨간색 화살표는 적용된 클리핑된 이미지의 시점을 나타냅니다. 열 자극은 F 트랙을 통해 계산된 다양한 색상의 궤적으로 여기에 표시됩니다.별 유충에서 세 번째, 두 번째, 첫 번째 유충의 이러한 고해상도 응용 이미지는 매크로 렌즈로 얻은 것입니다. 바다와 같은 다른 유기체도 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 일단 마스터하면 각 추적 설정당 시간당 약 100개의 실험실을 분석할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 항상 동일한 조건에서 기록해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 광유전학적 자극 또는 신경 활동의 생체 내 감지와 같은 다른 방법이 설정에 포함될 수 있습니다. 이 비디오를 시청하고 나면 ular locomotion을 효율적으로 분석하는 것이 얼마나 쉬운지 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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