Name: 마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미징 방법을. 고정, 염색, 투명화 과정을 통해 유전자 변형 마우스의 말초 통각 수용체 축삭 성장 표현형을 신속하게 평가할 수 있습니다.

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저자는 통찰력 토론과 제안의 TrkA taulacZ 마우스 박사 아네트 마르쿠스 박사 루이스 레이 차트에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 버크 재단뿐만 아니라 화이트 홀 재단 연구비 2010-08-61, 생명 재단 (WFL-US-028 / 14) 날개에서 연구 지원 사업 시작 기금에 의해 지원되었다,에서 ZB1-1102-1을 부여 크리스토퍼 &amp; 데이나 리브 재단​​과 JZ에 국립 안과 연구소의 보조금 1R01EY022409과 3R01EY022409-01S1. KJO는 골드 스미스의 동료입니다.

참고 : 모든 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 준수합니다. 동물 프로토콜은 웨일 코넬 의과 대학에서 IACUC 승인을 받았다. 1. 조직 준비 <ol><li> 자궁 경부 전위 15 시간 초과 - 임신 여성을 안락사. 개별적으로 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 채워진 6 잘 접시의 우물에서 시간 초과 - 임신 여성과 장소 배아에서 E18 배아 - 배아 E16를 해부하다. </li><li> 차가운 PBS에서 배아를 씻어. </li><li> 후속 유전자형을위한 사전 준비의 proteinase K 용액 배아과 장소 양막의 작은 부분을 제거한다. 양막이 끊어지면 대안, 배아의 꼬리 끝의 일부를 제거하고 K 테 용액에 넣 </li><li> 모든 곤충 핀 (측면 당 적어도 100)를 이용하여 배아 주위 피부에 구멍을 찔러. </li><li> (PFA)을 신선한 2 % 파라 포름 알데히드를 추가 천천히 PBS를 제거하고우물에 pH가 7.4. </li><li> 조심스럽게 4 ° C에서 2 시간 동안 흔들어. </li><li> PBS에 두 번 배아를 씻어 염색까지 4 ° C에서 PBS에 저장합니다. </li></ol> 2. 유전자형 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 단백질 분해 효소 K 혼합물에 양막 또는 배아 꼬리를 담근다. </li><li> 10 분 동안 56 ° C에서 품어. </li><li> 시중에서 판매하는 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. </li><li> 유전자 특이 센스 및 안티센스 프라이머 (10 μM)의 각각 0.5 μL, 2 μL의 dNTP 믹스와 결합, 게놈 DNA 용액 정제 총 200 μL의 0.5 μl를 타고 (dATP 존재의 2.5 mM의,의 dCTP, dGTP의 및 dTTP) 0.2 μL의 Taq 중합 효소 (5 U / μL) 및 2 ㎕의 PCR 완충액 (10 배)은 20 ㎕의 총 부피로 H 2 O를 추가한다. 참고 : 프라이머 서열은 다음과 같습니다 (표 1) 의 TrkA : TrkA_F : GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R : GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR의 파편, 표준 길이 : 400 염기쌍 (BP). 백스 : In5R : GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F : TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR : CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR 단편 길이 : 야생형, BP (304); Bax의 널 (null), 507 bp의. TauLacZ : lacZup : ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown : ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR 단편 길이 : 360 bp의. </li><li> 의 TrkA에 대해 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C, 2 단계에서 30 초 72 ° C : 68 ° C, 4 단계에서 20 초 : 95 ° C, 3 단계에서 10 초. 40주기 4 - 반복 2 단계를 반복합니다. <ol><li> LacZ를하고 백스를 들어, 다음 프로그램으로 PCR을 실행 1 단계 : 1 분 95 ° C에서, 2 단계 : 10 초 95 ° C, 단계에서 3 : 1 분 54 ° C, 단계 4 : 72에서 1 분 35 사이클 - 4 ° C를 반복 2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> DNA 래더의 차선을 20 분 동안 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 완충액에서 100 V에서 2 % 아가 로스 겔에서 실행 PCR 샘플 길이 단편을 평가. </li><li> 야생형의 TrkA, T의 존재에 대해 분석 배아RKA - tauLacZ 및 Bax의 널 (null) 대립 유전자. 백스 - / -, 실험 질문에 따라 : - - /와의 TrkA taulacZ / taulacZ 백스 : 실험 배아의 유전형의 TrkA taulacZ / WT 있습니다. tauLacZ 기자가없는 배아 축삭 염색 부정적으로 사용되므로 염색 과정을 교정하는 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 배아 염색 <ol><li> 3.8 - 섹션 3.2에서 아래와 같이 일부 수정과의 lacZ 염색 상용 키트를 사용합니다. 여기에, 밀리 포아 키트를 사용합니다. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 1 시간 동안 버퍼의 배아를 담근다. </li><li> 직접 실온에서 부드럽게 흔들어, 적어도 15 분 동안 버퍼 B의 배아를 체험. </li><li> 배아는 버퍼 A / B, 37 ° C에서 미리 따뜻한 조직 염기 용액에있는 동안. 배아 당 조직 염기 용액 5 mL를 사용합니다. </li><li> 배아 버퍼 A / B에있는 동안, 신선한 5-BR 준비omo- 100 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 40 ㎎ / ㎖의 농도로 -3- 인돌 α-D-갈 락토 (X-GAL) -4- 클로로. </li><li> 1 mg / ml의 농도로 예열 된 티슈베이스 용액에 X-gal을 희석시키고 유리 섬광 바이알로 X-GAL / 티슈베이스 혼합물을 5 mL를 추가한다. </li><li> X-GAL / 티슈베이스를 함유하는 혼합물을 유리 섬광 바이알로 배아를 전송합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 파란색 얼룩의 존재를 확인, 37 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 신선한 4 % PFA, pH가 7.4 후위 배아. 조심스럽게 4 ° C에서 4 시간 동안 흔들. </li><li> 차가운 PBS에 두 번 배아를 씻어. </li></ol> 4. 조직 탈수 및 지우기 <ol><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 50 % 메탄올 / 50 % PBS 액에 넣어 배아. </li><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 75 % 메탄올 / 25 % PBS 탈수 계속. </li><li> 90 % 탈수 계속 메탄올 / 10 % P유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 동안 BS. </li><li> 유리 바이알에서 흔들면서 실온에서 30 분 (2 배), 100 % 메탄올 탈수 계속. </li><li> 1 (V : V) 벤조일 알코올 벤조일 벤조 에이트의 혼합물 배아 탈수하는 동안, 1을 제조. 참고 : 벤조일 알코올과 벤조일 벤조 에이트는 독성이다. </li><li> 1 : 1 배아를 담가 (V : V) 100 % 메탄올의 혼합물 : 15 분 동안 100 % BABB. BABB 플라스틱을 용해하기 때문에 만 유리를 사용합니다. </li><li> 완전히 투명 조직 100 % BABB에서 배아를 담그고 삭제 배아에서 X-여자 염색을 시각화 할 수 있습니다. 참고 : 가능한 한 빨리 X-여자의 얼룩은 시간이 지남에 따라 퇴색하기 때문에 이미지. </li></ol> 5. 전체 마운트 이미지 <ol><li> 사진 사용하여 금속 집게에 대한 적절한 각도로, 100 % BABB에 몰입 배아를 안정화. 점등 미만 광용 광원의 조합을 사용 밝히는. </li><li> 해부 현미경으로 이미지를 수집디지털 카메라로 복. 0.5 mm 떨어져 Z 축을 따라 다섯 연속 초점면에 여러 시야 노출을 가져 가라. 노출 시간과 F-정거장 조명 및 카메라 사양에 따라 다를 수 있으며 각 설정에 최적화 될 필요가있다. </li><li> 오버레이 된 영상을 가공 및 포토 몽타주를 생성하는 기준 화상 처리 소프트웨어를 사용한다. </li></ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
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<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

배아의 TrkA taulacZ 마우스의 상술 한 X-GAL 염색 과정은 그대로 고정 배아에서 장거리 축삭 돌기 신속하고 상세한 시각화한다. 이 마우스가 축삭의 성장과 생존의 연결 모두에 기여할 수있는 메커니즘을 신호의 프로빙을 허용 백스 널 배경 때문에. 관심의 유전자 변형 또는 녹아웃 쥐와 교미하는 축삭 표현형의 종합적인 평가를 할 수 있으며 더 자세한 방식으로 축삭의 성장 신호를 검사 할 미래의 실험에 유용한 가이드를 제공 할 수 있습니다. 생체 축삭의 성장 연구를위한 주요 과제는 조직을 준비하는 시간이다 섹션과 어느 한 유전자 조작에 의해 다양한 방식으로 영향을받을 수 성장 축삭의 복잡한 표현형을 평가. 의 TrkA taulacZ은 / taulacZ : 백스 - /이 - 라인은 유전자의 전체 효과의 평가를 할 수 있습니다주변 침해 수용체 축삭 개발에 관심. <p class="jove_conte...

정확한 신경 네트워크의 설립은 신경계의 기능에 필수적인 복잡한 발달 과정이다. 이 과정에서 장애는 인간의 신경 질환 1-3에 연루 된 신경 세포의 기능 장애로 이어집니다. 포유 동물에서 축삭 성장과 타겟 신경 분포의 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 두 가지 유전자 변형 마우스 라인의 조합을 사용하여 감각 뉴런의 TrkA는 발현의 축삭 궤적을 시각화하는 프로토콜을 개발했다. 의 TrkA는 신경 성장 인자 수용체 NGF 용이며 통각 감각 뉴런 (4)의 기능적인 마커이다. 의 TrkA 매우 초기 개발 과정에서 통각 신경 세포에서 발현 및 NGF에 의존하는 신경 세포의 생존, 축삭 성장, arborization 및 대상 신경 분포 5-9을 매개한다. 생쥐의 TrkA taulacZ에서는 야생형의 TrkA 유전자 taulacZ 식 C로 대체추정의 TrkA - 신경 세포의 축삭 형태 (11) 염색 β-여자 (X-GAL)에 의해 가시화 될 수 있도록 assette 10. 이형의 TrkA taulacZ / WT 라인을 사용하여, 우리는 규제 또는 생체 내에서 감각 구 심성 돌기의 발달을 방해 할 수있는 요소를 검사 할 수 있습니다. 더욱이 식의 TrkA 따라서 NGF / 시그널링의 TrkA 부재 메커니즘을 촉진 축삭 성장을 평가하기 위해 사용될 수 동형의 TrkA taulacZ / taulacZ 마우스에 존재하지 않는다. 통각 신경 NGF /의 TrkA뿐만 아니라 축삭 성장에 대한 시그널링에 의존하기 때문에, 또한 생존을 위해, 우리는, 그렇지 세포 죽음에서 그들을 구출 배아 DRG 신경 세포 사멸을 억제하는 것으로, 친 아폽토시스는 Bax 유전자가없는, 다른 마우스 선을 채용 시그널링의 TrkA의 부재하에 관찰 하였다. 백스 - / - (12)는 이와 같이 배경 molecu 허용특히 축삭의 성장 7-9,13-15에 영향을 미치는 신호 전달 경로의 LAR 해부. 의 TrkA에서 - / - : 백스 - / - 마우스는 DRG 뉴런은 생존하지만, 피부에 감각 구 심성 신경 분포가 완전히 (14, 15)를 폐지한다. 우리는 선택적으로 축삭 돌기의 발달에 각각의 기여를 결정하는 신호 전달 경로 활성화 할 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티는 다른 유전 수정이의 TrkA taulacZ / taulacZ에 사육하는 경우가 축삭 성장 표현형의 변화에 대한 평가를 할 수 있다는 것입니다 백스 - / - 또는의 TrkA taulacZ / WT : 백스 - / - 배경.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>조직 헹굼 용액 A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>조직 헹굼 용액 B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>조직 얼룩 기본 솔루션</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>유리 섬광 바이알</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Labline</td><td>모델 120</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6웰 접시</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>IDT</td><td>맞춤형 DNA 프라이머</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP 혼합물</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA buffer</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA 엔진 Dyad</td><td></td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>벤질 벤조 에이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Ring light</td><td>Leica&nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>포토샵</td><td>어도비</td><td>포토샵 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

배아 전장 신경 돌기의 시각화는 신경 네트워크가 개발 포유류 방법을 이해하는 것이 필수적이다. 여기에서 우리는 현장에서 여러 유전자 ​​조작 마우스 라인을 사용하여 자신의 표현형 특성을 평가하기 후근 신경절 (DRG) 축삭 돌기의 부분 집합에 레이블을하는 방법을 설명합니다. 양성 뉴런의 TrkA 통증 신호의 송신에 전용 침해 수용체 뉴런이다. 우리는 그대로 마우스 배아의 모든의 TrkA 양성 주변 축삭의 궤도에 라벨의 TrkA taulacZ 마우스 라인을 사용한다. 우리는 더 독립적으로 신경 세포의 생존에 유전자 조작의 가능한 효과의 성장과 관련된 질문을 평가하기 위해, 기본적으로 신경 세포의 사멸을 폐지 백스 널 배경 위에의 TrkA taulacZ 라인을 번식. 이어서, 관심의 유전자 변형 마우스의 TrkA taul와 교배ACZ / Bax의 널 라인은 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 연구를위한 준비가되었다. 이 프레젠테이션은 전체 마운트 준비에 전체 길이 축삭 궤적의 시각화 수 있도록 해부, 조직 준비, 염색 및 청소시 상세한 마우스 사육 계획에 대한 자세한 내용은 유전자형이 포함되어 있습니다.

의 TrkA WT / taulacZ의 유전자형 : 백스 - / -과의 TrkA taulacZ / taulacZ : 백스 - / - 배아가 명확하게 표준 PCR 유전형에 의해 결정될 수있다 (그림 1). X-여자 염색 디스플레이는 통상적으로 염색 배아 (그림 2, 3A)에 피하 주변 축삭 아버을 자세히 설명하고, 조직 제거한 후 배아에 걸쳐 (그림 3B, 4). - / - 라인 신경 세포 고유의 네 스틴 프로모터 (17)의 제어하에 구조적으로 키나제 활성화 된 B-RAF (V600E) 돌연변이 (LSL-kaBraf 16)를 운반하는 쥐, 구하는 LSL- 백스 : 우리의 TrkA WT / taulacZ을 사육했다 kaBraf :의 Tr...

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

다음 실험의 전반적인 목표는 발달 중인 태아 마우스에서 감각 축삭 성장 표현형을 효과적으로 평가하는 것입니다. 이는 먼저 타우 느슨한 리포터 마우스를 적절하게 육종하고 유전형 분석을 통해 달성되며, 이를 통해 다운스트림 염색 분석을 두 번째 단계로 수행할 수 있습니다. 마우스 배아는 전체 동물에서 감각 축삭돌기를 시각화할 수 있도록 고정되고 염색됩니다.다음으로, 배아는 다른 방법으로는 볼 수 없는 깊은 곳에 있는 축삭돌기를 완전히 시각화하기 위해 탈수 및 제거됩니다. 결과는 이러한 방법이 배아 통각 수용성 축삭 성장 표현형을 신속하게 평가하는 효과적인 수단임을 보여줍니다. 이 방법은 Tau Lae 리포터의 트랙을 사용하여 연구자가 관심 유전자를 트랙의 tlac Z 배경으로 교차시키고 감각 축삭 성장 표현형의 변화를 스크리닝할 수 있도록 함으로써 감각 축삭 성장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.우리 기술의 의미는 과학자들이 우리의 기술을 사용하여 알려진 선천적 돌연변이가 감각 축삭 성장 표현형을 유발할 수 있는지 여부를 테스트할 수 있다는 점에서 치료로 확장됩니다. 텍스트 프로토콜에 언급된 바와 같이 자궁경부 탈구에 의한 시간 지정 임신 암컷을 안락사시키기 시작하려면, 시간이 지정된 임신 암컷의 배아 E 16 - E 18 배아를 해부한 다음 배아를 차가운 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 채워진 6개의 웰 접시의 웰에 개별적으로 넣습니다. 배아를 차가운 PBS에서 헹군 후 배아의 양막의 작은 부분을 제거하고 DNA 정제 키트 또는 후속 유전형 분석에서 준비된 단백질 분해 효소 K 용액에 넣습니다.또는, 양막이 손실된 경우, 배아 꼬리 끝의 작은 부분을 제거하고 proteinase K 용액에 넣습니다. 다음으로, 곤충 핀을 사용하여 한 면에 약 100개의 구멍을 뚫어 배아 주위의 피부를 찔러넣습니다. PBS를 제거하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 부드럽게 흔든 후 새로운 2% 파라폼 알데히드 또는 PFA pH 7.4를 웰에 천천히 첨가합니다.배아를 PBS에서 두 번 헹구고 염색할 때까지 섭씨 4도의 PBS에서 보관합니다.유전형 분석을 위해. 제조업체의 지침에 따라 양막 또는 배아 꼬리를 proteinase K 혼합물에 담그십시오. 섭씨 56도에서 10분 동안 배양합니다.시판되는 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA를 추출한 후, 총 200마이크로리터의 정제된 게놈 DNA 용액 중 0.5마이크로리터를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR 반응을 준비한 다음 여기에 설명된 대로 PCR 프로그램을 실행합니다. PCR 후 100볼트의 2% aros gel에서 PCR 샘플을 1개의 extras acetate EDTA buffer에 20분 동안 실행합니다. DNA 사다리가 있는 레인을 포함하여 단편 길이를 평가하고 일상적인 프로토콜을 사용하여 겔을 염색합니다.야생형의 존재 여부에 대해 배아를 분석하고, a를 추적하고, tau lae를 추적하고, null 대립유전자를 역으로 반환합니다. 배아를 더럽히기 위해. 여기에 설명된 수정 사항으로 느슨한 e 염색을 위해 상업용 키트를 사용하십시오.먼저 배아를 완충액 A에 최소 1시간 동안 담그고 실온에서 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 배아를 완충액 B에 최소 15분 동안 직접 담그고 실온에서 부드럽게 흔듭니다. 다음으로, 밀리리터당 40밀리그램의 xal 스톡 용액을 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 예열 조직 기반 용액에 희석합니다.그리고 생성된 혼합물 5ml를 유리 섬광 바이알에 첨가합니다. 배아를 xal 조직 기반 혼합물이 들어 있는 유리 섬광 바이알로 옮깁니다. 퍼필로 뚜껑을 닫고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.파란색 얼룩이 있는지 확인합니다. 그런 다음 배아를 신선한 4% PFA pH 7.4로 접붙입니다. 섭씨 4도에서 4시간 동안 부드럽게 흔든 후 배아를 차가운 PBS에 두 번 헹궈 조직을 탈수시키고 배아를 50% 메탄올, 50% PBS 혼합물에 넣고 실온에서 30분 동안 유리잔을 흔든다.실온에서 계속 탈수하고 30분 동안 75% 메탄올에 유리 파일을 흔든 다음 30분 동안 90% 메탄올을 흔듭니다. 마지막으로 100% 메탄올을 30분 동안 두 번 탈수합니다. 그런 다음 100% 메탄올과 100% 벤조일 알코올 및 벤조일 벤조에이트 또는 BABB의 일대일 혼합물에 배아를 15분 동안 담급니다.BABB는 마지막 단계로 플라스틱을 용해하므로 유리를 사용하십시오. 배아를 100% BABB에 담궈 조직을 완전히 제거하고 투명화된 배아 또는 마운트 이미징에서 X cal 염색을 시각화하고, 필요한 경우 금속 집게를 사용하여 사진 촬영을 위한 적절한 각도에서 100% BABB에 담근 배아를 안정화합니다. 상향광과 언더라이트의 조합을 사용하여 조명을 비춥니다.광원. 디지털 카메라가 장착된 해부 현미경으로 이미지를 획득합니다. 5개의 연속적인 초점면에서 여러 개의 명시야 노출을 촬영합니다.Z축을 따라 0.5mm 떨어져 있습니다. 노출 시간과 F스톱은 조명 및 카메라 사양에 따라 달라질 수 있으며 각 설정에 맞게 최적화해야 합니다. 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 오버레이 이미지를 처리하고 사진 몽타주를 생성할 수 있습니다.의 유전자형은 tal Lai homozygotes를 null로 되돌리고 tal lai heterozygotes를 다시 추적합니다. Snu 배아는 표준 PCR 유전형 분석에 의해 명확하게 결정될 수 있습니다. ALS 염색은 배아의 상세한 피하 말초 축삭 아자를 표시하며, 삼차신경절과 몸통의 축삭 돌기와 머리는 투명하지 않은 배아에서 나타납니다.여기서, ex GS staining은 Track A 신호가 완전히 결여되어 있지만 구조적으로 활성화된 키나아제를 운반하는 배아에서 BABB로 청소하기 전과 후의 몸통 중간에 있는 등쪽 뿌리 신경절의 돌출부에서 상세한 주변 축삭 아자를 표시합니다. 뉴런 특이적 둥지의 통제하에 있는 BRAF 돌연변이. 프로모터에서 통각 수용기 주변 돌기의 형태는 거의 정상에 가깝게 발달했습니다.이는 말초 축삭 성장에서 BRAF 신호전달에 대한 중요한 기능을 보여주며, 트랙 A 신호의 생존 및 축삭 성장 촉진 기능을 분리할 수 있음을 보여주며, 이는 트랙 A 의존적 생존 신호의 상실을 대체하는 백널 유전자 배경으로 분리될 수 있음을 보여줍니다. 베타 글라스의 효소 활성을 손상시킬 수 있는 배아를 과도하게 고정하지 않는 것이 중요합니다. 또한 BABB는 매우 위험한 물질이므로 작업할 때는 항상 적절한 환기를 사용하고 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.이 비디오를 시청한 후에는 손상되지 않은 동물에서 느슨하게 염색된 축삭돌기를 효과적으로 처리, 염색 및 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S.  et al. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. 특급. (2018). 이 비디오는 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여 운동 뉴런 투영과 축삭 분기를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 형질전환 마우스 배아. 운동 뉴런 성장 및 연결성을 평가하기 위한...

광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

배우세요 마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미징 방법을. 고정, 염색, 투명화 과정을 통해 유전자 변형 마우스의 말초 통각 수용체 축삭 성장 표현형을 신속하게 평가할 수 있습니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

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