마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 마우스와 인간의 식도에서 원발성 근섬유아세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 기증자 신생아 마우스에서 인간 조직으로 전체 식도를 적출하여 수행됩니다. 점막은 근엽(muscularis propria)과 분리되어 있습니다.

두 번째 단계는 조직을 다지고 HBSS에서 여러 번 씻는 것입니다. 다음으로, 조직은 콜라겐 분해 효소 디스로 소화되고 더 잘게 잘게 쪼개져 부착된 상피와 함께 중간엽 세포를 방출합니다. 그런 다음 이질적인 세포 집단은 상피 세포가 생존하지 못하고 씻겨 나가는 동안 근섬유아세포가 부착되는 근섬유아세포 배지에서 배양됩니다.

궁극적으로, 면역화학과 유세포 분석은 1차 배양에 있는 세포가 근섬유아세포(myofibroblast)인지 확인하는 데 사용됩니다. 절차를 시연하는 사람은 저와 기술자인 Matthew Gargas, 그리고 제 연구실의 박사후 연구원인 Chow New인 Tori가 맡을 것입니다. 생후 8일에서 12일 된 생쥐를 안락사시킨 후, 동물의 등쪽을 고정시키고 복부 표면을 70% 에탄올로 적십니다.

다음으로, 집게를 사용하여 피부를 잡고 요도 입구 앞쪽으로 들어 올립니다. 요도 개구부에서 턱까지 복부 정중선을 따라 자릅니다. 피부만 자르십시오.

그런 다음 요도 개구부에서 무릎까지 절개하여 거꾸로 Y.무릎을 절개한 후 흉곽 양쪽을 절개합니다. 절개가 끝나면 조심스럽게 피부를 벗겨 내고 옆에 둡니다. 이제 복막을 들어 올려 횡격막과 흉곽까지 자릅니다.

흉곽 내 및 복부 내용물의 손상을 방지하기 위해 가위를 위쪽으로 향하게 하십시오. 그런 다음 흉골과 흉곽의 정중선을 따라 자른 수술용 가위를 사용하여 간의 왼쪽 엽을 부드럽게 들어 올려 식도의 복부 부분을 노출시킵니다. 다시. 이렇게하려면 가위를 밑에있는 장기에서 멀리 비스듬히 유지하십시오.

그런 다음 흉곽을 옆으로 당겨 흉강의 내용물을 노출시킵니다. 이제 심장과 폐의 양쪽 엽을 부드럽게 제거하십시오. 필요에 따라 면 어플리케이터를 사용하여 출혈을 흡수하십시오.

흉부 식도는 기관 후방과 흉추 전방에 있는 좁고 유연한 관입니다. 신생아의 경우 식도 위 접합부를 찾아 위에서 식도를 식별합니다. 직설적으로 지방과 장간막 조직을 포함하여 식도를 둘러싼 혈관 구조를 경추강의 식도 기원까지 절개합니다.

이제 식도의 전체 길이를 절제하고 원하는 경우 냉각된 HBSS로 옮깁니다. 또한 방향 전환을 위해 위의 일부를 제거하십시오. HBSS에서 마우스 또는 인체 조직에서 얻은 점막 조각을 각각 1.7ml 마이크로 퍼지 튜브 또는 5밀리리터 튜브에서 다지면서 이 프로토콜을 시작합니다.

이제 인간 식도 기질 세포를 얻을 때 날카로운 절개를 통해 기저 근육 세포에서 점막을 분리하는 것이 중요합니다. 이제 튜브에서 미세한 가위를 사용하여 조직을 2-3mm 조각으로 더 민팅합니다. 식도 점막 조각 침전물 후 HBSS를 천천히 디케이팅하고 부주의로 조직을 버리지 않도록 주의합니다.

대형 팁 피펫을 사용하여 HBSS를 추가로 제거할 수도 있습니다. 그런 다음 새로운 HBSS를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 섞고 조직이 가라앉도록 합니다.

일단 정착되면 HBSS를 다시 디캔팅하고 이 세척을 반복합니다. 총 8번 단계를 밟습니다. 여덟 번 세척한 후 콜라겐분해효소 11로 조직을 배양하고 느린 속도와 실온에서 설정된 흔들 셰이커에서 최대 25분 동안 쥐 조직을 디스 배양합니다.

동일한 조건에서 인체 조직을 6시간 동안 배양합니다. 분해 후 미세한 가위를 사용하여 조직을 더 혼합한 다음 200G에서 10분 동안 조직을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿화된 조직을 깨끗한 1.7ml 튜브에 넣습니다.

그런 다음 조직 배양 후드 아래에서 DMEM에서 2% 소르비톨로 세포를 5회 세척하여 생존 불가능한 세포 및 기타 파편을 제거합니다. 세척할 때마다 세포가 중력에 의해 침전되도록 하고 세척 용액을 디캔팅합니다. 세척 후 세포를 6개의 우물 3개에 파종합니다.

우물 플레이트와 진공 여과 보충 DMEM에서 그들을 배양하십시오. 인체 조직은 웰이 80% confluent가 될 때까지 표본 배양액의 크기, 세포에 따라 더 많은 웰 또는 플레이트가 필요할 수 있습니다. 그런 다음 부착 세포를 먼저 T 25 플라스크에 전달하고 EDTA에 0.05% 트립신을 사용하여 세포를 제거합니다.

그런 다음 미디어를 추가하여 반응을 중화합니다. 제거된 세포를 원심분리기 튜브에 모읍니다. 그런 다음 400G에서 세포를 회전시켜 현미경으로 수집합니다.

부착 세포의 방추 모양 형태를 관찰하여 배양된 기질 세포를 Desmond를 위해 면역 염색한 근육 세포와 구별합니다. 표준 프로토콜을 사용하여 4개의 웰 챔버 슬라이드에 15, 000개의 세포를 간단히 플레이트하고 24시간 동안 근섬유아세포 배지에서 성장합니다. 다음날, 세포를 고정하고 1 차 항체를 적용하기 전에 PBS에 5 % 염소 혈청으로 고정 세포를 차단하고 1 차 및 2 차 항체를 모두 5 % 염소 혈청에도 희석해야합니다.

1차 항체와 함께 실온에서 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 세척 후 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다. 2차 항체를 추가하고 한 시간 동안 세포를 배양합니다.

실온에서 PBS를 3회 세척하여 2차 항체를 제거합니다. 그런 다음 세척 후 염색된 세포를 분석할 수 있습니다. 장착 매체와 커버 슬립으로 DPI를 적용하여 식도 세포의 순도를 확립합니다.

조혈 및 내피 세포 표면 마커를 확인하십시오. 유세포 분석을 사용합니다. 수집할 준비가 될 때까지 배양 플라스크에서 충분한 수를 키우십시오.

그런 다음 비효소 세포 해리 용액을 사용하여 배양된 마우스 식도 기질 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 분리합니다. 그들의 수집을 따라. 팩스 버퍼로 셀을 두 번 씻고 셀 수를 계산합니다.

이제 표준 염색 절차를 사용하여 CD 45로 염색하여 면역 세포를 식별하고 CD 31로 염색하여 내피 세포를 식별한 다음 유세포 분석기를 통해 세포를 실행합니다. 식도 기질 세포는 기계적 및 효소적 분해를 사용하여 분리하고 도금 후 몇 시간 내에 6개의 웰 플레이트에서 배양했습니다. 세포는 플레이트에 느슨하게 부착된 혼합 현탁액에 있었습니다.

그 후 24시간 동안 방추형 세포가 세포 현탁액에서 싹을 틔우고 플레이트 바닥에 단단히 부착되었습니다. 이 세포는 5일 이내에 전체 우물을 덮었고 여기에서 볼 수 있는 최소 15개의 통로 동안 형태를 성공적으로 유지했으며 세포는 낮은 밀도를 가지고 있습니다. 이들은 식도 기질 세포의 1차 배양에 대한 co-fluency, immuno staining에 가까운 방추체 모양의 세포입니다.

챔버 슬라이드에서 성장한 것은 근섬유아세포 골격계 마커의 풍부한 발현을 보여주었습니다. 알파, SMA 및 멘톤 배양 순도는 유세포 분석으로 평가되었습니다. 일차 murn 식도 기질 세포에 대해 전방 및 측면 산란을 확립한 후 세포 표면 단백질에 대한 살아있는 세포의 게이팅 및 분석을 수행했습니다.

원발성 식도 기질 세포는 조혈 CD 45의 발현이 부족했고 내피 CD 31 세포 표면 마커의 발현이 부족했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스와 인간 식도에서 근섬유아세포의 1차 배양을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 예.