Name: 2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 2D 차등 겔 전기영동을 이용하여 인간 M1 및 M2 대식세포의 단백질 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 소량의 샘플로도 민감하게 단백질 차이를 검출하여 질병 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Inserm의 지원을 받았습니다. Marion Bouvet는 프랑스 연구 기술부의 연구원입니다. Annie Turkieh는 유럽 연합 FP7 HOMAGE(305507)가 수여하는 펠로우입니다.

이 프로토콜은 우리의 기관 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 건강한 사람의 기증자 버피 코트는 지역 수혈 센터 (릴, 프랑스)에서 얻었다. 버피 코트에서 얻은 샘플은 INSERM 컬렉션 (N ° DC2010-1209)로 선언됩니다. 1. 재료 및 문화 미디어 준비 <ol><li> 1X PBS을 얻었다 멸균 증류수에 10 배의 인산 완충액 식염수 (PBS)에 희석. </li><li> 와 10 % 풀링 된 인간 혈청이없는 겐타 마이신 (40 ㎍ / ㎖) 및 L- 글루타민 (2 mM)을 보충 RPMI 1640 배지를 확인합니다. </li></ol> 단핵구 유래 대 식세포의 2 차 문화 (MDM) <ol><li> 1X PBS와 buffycoat (25 ml)로 희석. 조심스럽게 실온에서 20 분 동안 1,600 XG에 피콜 / leucosep 튜브와 원심 분리기에로드. </li><li> 새로운 튜브로 계면에서 단핵 세포를 수집합니다. 10 ml의 씻을 배는 PBS는 0.1 %의 에틸렌 디아민을 포함 1X1000 XG, 370 XG에 10 분간 각각 160 XG 다음 번 1X PBS 단독 160 XG에 10 분 동안의 연속적인 회 원심 의해 아세트산 (EDTA). </li><li> 혈청 않고 5 ml의 RPMI-1640 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 접시 당 1 × 106 세포의 밀도로 35mm 접시에서 세포를 시드. </li><li> 배양기에서 90 분 동안 침전 후 비 부착 세포를 함유하는 상층 액을 제거한다. 1 ml의 PBS로, 단핵구의 3 배를 구성, 부착 세포를 씻으십시오; 그 이전에 혈청 무료 세포에 10 %를 포함하는 새로운 배지 (v / v)의 인간 혈청 1ml를 추가합니다. </li><li> 배양 6 일 후에, 분화 된 대 식세포 대체 (M2)을 수득 재조합 인간 IL-4 (15 ng의 / ㎖)을 첨가 6 일 동안 유지한다. 그리고, M1 식세포를 수득 4 시간 동안 12 일째에 리포 폴리 사카 라이드 (100 NG / ml)로 분화 된 대 식세포를 치료. </li></ol> 2D 전기 영동을위한 M1과 M2 대식 세포 단백질의 3 추출 <ol><li> 세척 macroph나이 25 mM 트리스, 30 mM 트리스 pH를 8, 4 % 3 포함하는 버퍼의 pH 7.4, 스크랩으로 3 회 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 (CHAPS), 2 M 티오 7 M 요소를. </li><li> -20 ° C에서 얼음과 상점에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 적합한 혼합기를 사용하여 세포를 Lyse. </li><li> 상업 브래드 포드 시약을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 단백질 100 ㎕ 분주을 저장합니다. </li></ol> 4. Isoelectrofocusing 참고 : 어둠 속에서 모든 라벨링 작업을 수행합니다. <ol><li> 37 ° C에서 1 시간 동안 2 mM 트리스 (2- 카복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)에 용해 버퍼와 9 μL로 조정 각각의 샘플 (M1 및 M2 대 식세포)의 5 μg의를 줄입니다. </li><li> 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 M1 및 M2 추출물의 설프 하이 드릴 - 반응성 염료 추출물 시아닌 3 (Cy3가)을 추가한다. M1로 시아닌 5 (Cy5에)를 첨가하고, M2는 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 추출하여 부화37 ° C에서 30 분. </li><li> 7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % CHAPS, 130 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 2 % pharmalytes 함유 시료 완충액의 동일한 부피의 첨가로 반응을 중지. </li><li> 믹스 한 손으로 Cy5에 표지 M2 샘플과 M1 샘플을 Cy3에이 표지와 다른 손에 Cy5에 표지 M1 샘플과 M2 샘플을 Cy3에이 표지. </li><li> 고정화의 pH 구배를 재수 (IPG) 스트립 (240mm, pH를 3-10 선형 구배) 7 M 우레아, 등전점에 2 M 티오 4 % CHAPS 초점을 포함하는 버퍼에 표시된 혼합 된 시료 450 μL와 (IEF) 전지 시스템 어떤 전류를 적용하지 않고 24 시간 동안. </li><li> 3 시간, 3 시간 동안 마지막으로 8,000 V 8000 V에 그라데이션에서 6 시간 동안 1,000 V에 그라데이션에서 다음 3 시간 동안 300 볼트 (V)에서 초점을 수행합니다. </li></ol> 5. 두 번째 차원 참고 : 어둠 속에서 모든 전기 작업을 수행합니다. <ol><li> 평형 완충액에서 IPG 스트립 포함 부화10 분 동안 0.1 mM 트리스 - 염산 (pH를 8), 6 M 우레아, 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (/ V w) (SDS), 30 % (v / v) 글리세롤을 보내고. </li><li> 12.5 %의 PAGE 젤에 두 번째 차원 (SDS 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE))에 대한 평형 IPG 스트립을 전송하고 아가 로스 로우 - 녹는 밀봉. </li><li> 브로 모 페놀 블루 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 밤새 300 V이어서 70 V의 정전압 Ettan-Daltsix 시스템을 사용하여 20 ° C에서 전기 영동을 수행. </li></ol> 6. 이미지 인식 및 바이오 인포 매틱스 분석 <ol><li> Cy5에 100 ㎛의 화소 크기로 이미지를 산출하기 위해 Cy3에 대한 580분의 532 nm 내지 670분의 633 나노 미터의 여기 / 방출 파장에서 DIGE 이미 저 스캐너 두 낮은​​ 형광 유리판 사이에 캐스팅 스캔 젤. </li><li> 이전에 (12)을 설명하는대로 상용 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다. </li><li> 계산하고 각 이미지에 자리 볼륨을 정상화. 소품으로 정규화 된 자리 볼륨을 할당각 지점의 총 가치의 ortion 젤에서 검출. </li><li> 두 그룹 (M1 및 M2) 간의 정규화 스폿 볼륨 값을 비교하여 대 식세포의 각 유형에 대한 단백질 스폿 볼륨의 차이를 분석한다. 변화가 1.5 배 (p &lt;0.05, 일방향 ANOVA 분석) 인 경우 상당한 것으로 스폿 볼륨 사이의 차이를 고려한다. </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

선언된 이해 상충은 없습니다.

본원에 기재된 프로토콜은 식세포, M1 (염증 유발)와 M2 (소염)의 두 아형의 다양한 자극의 영향을 분석하는 방법을 자세히. 이전에 7을 발표 한 M1과 M2 대 식세포의 차 문화는 단핵구의 분화에서 얻었다. 2D DIGE 겔 전기 영동 과정은를 Cy3 및 Cy5의 형광 용 스캐너 여기 / 발광 파장 두배 겔을 검사하기 위하여 SDS-PAGE 용 isoelectrofocusing 낮은 형광 플레이트 IEF 셀 같은 특수 재료 및 장비를 필요 및 2D 소프트웨어. 이 방법은 약간의 연습과 손재주를 필요로한다. 1) 단백질의 추출은 알부민이나 케라틴 등의 불순물이없는 환경에서 중요하며, 2) 어둠 라벨 및 전기 영동을 수행, 성공적 2D 겔 전기 영동에 대한 몇 가지 중요한 단계가있다. 피기술로서 용해 완충 용액에서 단백질 감소 DTT의 사용은 반응성 시아닌 염료 라벨링 전에 단백질의 펩티드 설파이드 결합...

대 식세포는 별개의 기능 표현형을 획득 할 수있는 이기종 및 플라스틱 세포이다. 생체 내,이 세포가 미생물 제품, 사이토 카인 등. 1과 마이크로 환경 signalssuch의 큰 다양성에 응답합니다. 시험관, 염증성 표현형 (M1) 대 식세포의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 인터루킨 -4 (IL-4)와 같은 일부 사이토킨에 의해 항 염증 표현형 (M2)에 의해 유도 될 수있다. 또한, 대 식세포는 특정 신호 2에 따라, 반대로 M2 표현형에 활성화 된 M1에서 전환 할 수 있습니다. 표현형에 따라, 대 식세포는 다른 기능을해야합니다. M1 마크로파지는 미생물 또는 종양 세포 (3)를 죽이고, 종양 괴사 인자 α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인을 생산하는 세포이다. 반면, M2 식세포 안티 inflammator를 생성함으로써 상처 치유 및 섬유증과 같은 이러한 염증 반응을 방지3,4-을 TGF-β가 같은 Y 요인. 이전 Boyum 6에서 적응 기술을 사용하여 5 바와 같이 건강한 기증자로부터 인간의 말초 혈 단핵 세포를 피콜 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리 하였다. 문화의 대 식세포는 차 문화 (7) 6 일 이후 M1 또는 M2 표현형로 분화 할 수있다. 단백질 발현 또는 숙주 병원성 미생물 또는 독소와 같은 다양한 제어되는 자극 하에서 식세포 두 아형 사이 단백질 변화 분석, 프로 및 소염 식세포의 기능을 해독하는데 도움이 될 것이다. 단백질 체학은 특히 업 또는 다양한 자극에 따라 인간 배양 된 대 식세포에서 아래로 조절되어 단백질의 직접 모니터링을위한 독특한 도구입니다. 형광 염료는 낮은 감도 및 이미지 분석 (8) 등의 2 차원 겔 전기 영동의 한계점을 해결 한 &lt;<html> / SUP&gt;. 시스테인 잔기와 반응 염료는 리신 잔기 (9)와 반응에 비해 검출 감도가 증가하고있다. 이전의 연구에서는 고전 실버 염색 2 차원 전기 영동 (11)에 비해 부족한 시료 (10)의 분석을 위해 DIGE 포화 라벨링의 유용성을 입증 하였다. 이 기술은 빠른 속도로 대 식세포의 두 하위 유형 간 또는 동일한 하위 유형에서 치료 및 치료 대식 세포 사이의 단백질 변형을 분석하는 데 도움이됩니다. 이 단백질체 기술의 장점은 2D 겔 (12)을 분석하여 단백질의 크기 및 번역 후 변형의 정보에 대한 액세스를 가지고있다. 이 분석 될 수있는 샘플의 수를 제한하는, 이것이 높은 처리량 기법 아니다 고려되어야한다. 질량 분석을 기반으로 높은 처리량 분석의 개발 검토로는 최근에 13이을 향상시킬 수 있습니다. _content &quot;&gt; 여기에서는 전기 영동 isoelectrofocusing의 과정을 통해 배양 된 대 식세포의 단백질 추출에서 2D DIGE 분석을 수행하는 방법을 제시하고, 적절한 2D 소프트웨어의 유용성에 대한 SDS-PAGE 정보뿐만 아니라.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 6웰 플레이트 PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>지질다당류</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>필터 0.22 & 마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100ml 실린더</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-반응성 염료</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG 스트립 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean IEF cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Ettan-Daltsix 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE 이미저 스캐너</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Non linear dynamics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>어떤 공급 업체</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>당신의&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 40%</td><td>바이오-라드</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D 클린 업</td><td>GE 헬스케어</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>희미&아큐트; 틸포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>전극 심지</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

2d 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

여기에 설명된 2차원(2D) 전기영동 프로토콜의 목표는 인간 배양 대식세포의 표현형을 분석하는 방법을 보여주는 것입니다. 대식세포의 주요 역할은 염증성, 면역성 질환, 감염성 질환과 같은 다양한 병리학적 질환에서 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에서는 M1(전염증성) 또는 M2(항염증성) 표현형으로 구별할 수 있는 인간 단핵구 유래 대식세포의 1차 배양을 사용합니다. 이 시험관 내 모델은 M1 및 M2 대식세포의 생물학적 활성을 연구하고 단백질체학적 접근 방식에도 신뢰할 수 있습니다. 단백질체학 기법은 숙주 병원성 동안 M1 및 M2 대식세포의 표현형과 행동을 비교하는 데 유용합니다. 2D 겔 전기영동은 많은 수의 단백질 또는 폴리펩티드를 동시에 매핑하기 위한 강력한 단백질체학 기술입니다. 우리는 2D Differential Gel Electrophoresis(DIGE)라는 형광 염료를 사용하여 2D 전기영동 프로토콜을 설명합니다. M1와 M2 대식 세포 단백질은 첫번째 차원에 있는 그들의 등전 점, 및 두번째 차원에서 그들의 분자 질량에 따라, 등전 집중시키기에 의해 별거 전에 시아닌 염료로 레테르를 붙입니다. 그런 다음 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 반점을 사용하여 단백질 또는 폴리펩티드 발현 수준의 차이를 감지합니다. 여기에 설명된 단백질체학 접근법을 통해 숙주 병원성 또는 미생물 독소와 같은 다양한 장애와 관련된 대식세포 단백질 변화를 조사할 수 있습니다.

적절한 차동 프로테옴 분석을 수행하기 위해, 분석 할 시료의 처리를 확인해야합니다. 이전 5 공표 제시된 예에서, 대 식세포의 세포 배양 품질은 형태학 및 분자 양태 요구된다. 대 식세포에 단핵구의 분화와 문화의 동질성이 위상 현미경으로 하였다. 그림 1은 M1과 M2 대 식세포의 차 문화의 예를 보여 주었다. 도시 된 바와 같이, 우리는 M1 (그림 1A, B)과 M2 (그림 1C, D) 낮은에서 위상 현미경으로 문화의 날 (12)의 대 식세포의 아형 (그림 1A, C)와 높은 (그림 1B, D의 동질성을 확인 ) 확대. 분명히, 우리는 차 문화의 12 일 후 대 식세포 M1과 M2의 독특한 형태를 관찰했다. 이전에 출판 된, 우리는 RT-PCR에 의해 TNF와 IL1 코딩의 mRNA의 존재를 확인M2에 ...

대식세포는 숙주 병원성에 관여하는 핵심 세포입니다. 대식세포는 단백질체 분석으로 분석하고 검출할 수 있는 표현형 및 기능적 다양성을 나타냅니다. 이 문서에서는 M1 또는 M2 표현형으로 분화된 인간 대식세포의 1차 배양에 대해 2D 전기영동을 수행하는 방법을 설명합니다.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 겔 전기영동에서 2D 차등에 의해 인간 전염증성 M1 및 항염증성 M 두 대식세포 하위 집합의 표현형을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 1차 M1 및 M 두 개의 대식세포 배양에서 추출한 단백질을 사인 염료로 라벨링하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 단백질을 함께 혼합하고 재수화에 의한 ISO 전기 집중을 샘플에 대해 수행합니다.다음 두 번째 차원, 전기 영동은 어둠 속에서 동원된 pH 구배 또는 IPG 스트립으로 수행된 다음 겔 전기 영동 스캐너의 차이로 겔을 스캔합니다. 궁극적으로, M1과 M 두 개의 대식세포 subset 사이의 폴립 소화 반점의 차이를 감지하기 위해 수치화된 이미지의 분석이 수행됩니다. 고전적인 토디 젤 전기 이동법과 같은 기존 방법 중 이 기술의 주요 이점은 이 기술이 더 민감하여 인간 환자로부터 얻은 샘플에 매우 중요한 단백질의 5마이크로그램만 필요하다는 것입니다.이 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생인 Mario Bove, Olivia Beza 및 제 실험실의 Magac 기술자입니다.단핵구 유래 대식세포의 1차 배양을 준비하기 위해 먼저 25ml의 Buffy coat를 25ml의 PBS에 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 희석된 혈액을 분리 구배에 조심스럽게 로드하고 세포가 회전을 마치면 1600Gs 및 실온에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다. 계면층에서 단핵구를 수집한 후, 3차 세척 후 0.1% EDTA를 함유한 10ml의 PBS에서 수확된 세포를 3회 연속 세척합니다.PBS에서만 세포를 한 번 더 스핀다운한 다음 혈청 시드가 없는 5ml의 RPMI 1640 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 35mm 접시에 있는 세포는 접시당 6개의 세포에 1 곱하기 10의 밀도로 접시에 담은 다음 인큐베이터에서 90분 동안 침전한 후 상층액을 버리고 부착 단핵구를 1ml의 PBS로 3회 세척합니다. 다음 배양, 섭씨 37도에서 6일 동안 인간 혈청 부피당 10%부피를 함유하는 10밀리리터의 신선한 배지와 5%의 이산화탄소를 함유하는 세포.그런 다음 항염증제 M 2 대식세포를 산출하기 위해, 배양 6일째에 IL 4 밀리리터당 15나노그램을 일부 배양물에 보충하여 12일째에 전염증성 대식세포를 산출합니다. 분화된 대식세포의 다른 배양물을 LPS 밀리리터당 100나노그램으로 4시간 동안 처리하여 2D 전기영동을 위해 대식세포 하위 집합을 분리합니다. 다음으로, 25 millimolar tris로 관심 배양액을 3회 세척한 다음 chaps 추출 버퍼로 플레이트 바닥에서 세포를 분리합니다.다음으로, 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 끈으로 묶습니다. 5분 후, 100마이크로리터 분취량의 세포를 섭씨 영하 20도로 옮겨 대식세포 부분집합의 ISO 전기 집중을 위한 단백질 농도 분석이 수행될 때까지 보관합니다. 먼저 샘플을 9마이크로리터 분취량으로 조정한 다음 섭씨 37도에서 2밀리몰의 TCEP가 보충된 용해 완충액으로 세포 용액을 줄입니다.1시간 후 섭씨 37도에서 추출물을 S SI 3 및 S SI 5로 배양하고 동일한 부피의 샘플 버퍼를 추가하여 30분 후에 반응을 중단합니다. 그런 다음 동일한 부피의 S, SI 3개, 표지된 M1 단백질, SCI 5개, 표지된 M, 단백질 2개의 단백질로 구성된 두 개의 별도 혼합물을 만듭니다. 다음으로, 전류를 가하지 않고 24시간 동안 등전 집속 셀 시스템의 챕스 추출 버퍼에 있는 라벨링된 혼합 샘플 450마이크로리터와 함께 IPG 스트립을 재수화합니다.다음날, 3 시간 동안 300 볼트에 집중시키는 것을 시작하고, 그 후에 6 시간 동안 1000 볼트에 기온변화도를 설치하고, 2개의 8, 3 시간 동안 000 볼트 기온변화도를 각각 실행하기 위하여 2차원 전기 이동법을 수행하기 위하여 평형 완충기에 있는 IPG 지구를 배양하십시오. 10분 후, 스트립을 12.5% 페이지 젤에 옮기고 저융점 아로스로 밀봉합니다. 그런 다음 70볼트의 정전압에서 edin dsic 시스템을 사용하여 밤새 섭씨 20도에서 전기영동을 수행한 다음 브로모 페놀 블루 프론트가 젤 바닥에 도달하여 젤 이미지를 획득할 때까지 300볼트를 실행합니다.차동 및 겔 전기영동 이미저 스캐너의 두 개의 저형광 유리판 사이에 놓고 5, 32, 5, 80나노미터, 5분의 여기 방출 파장과 6, 33, 6, 70분의 5나노미터에서 겔을 스캔하여 100마이크로미터의 픽셀 크기의 이미지를 생성합니다. 적절한 소프트웨어로 분석한 다음 각 이미지의 스폿 부피를 계산 및 정규화하여 정규화된 스폿 볼륨을 겔에서 검출된 각 스폿의 총 값에 대한 비율로 할당합니다. 변화가 1.5배인 경우 스팟 부피 간의 차이가 유의미한 것으로 간주하여 두 대식세포 그룹 간의 정규화된 스팟 부피 값을 비교하여 각 유형의 대식세포에 대한 단백질 스폿 부피의 차이를 분석합니다.이 실험에서. 대식세포의 두 가지 아형인 M1 전염증성 및 M형 M2 항염증제의 2D 단백질 패턴은 2D 감별에 의해 결정되었습니다. 젤 전기 이동법에서는, 단백질의 동일한 본은 이용된 cyan 염료의 M1 또는 M 2를 위해 독립적으로 관찰되었다.흥미롭게도, 겔의 생물정보학적 분석은 반점을 포함하는 20개의 영역을 밝혔으며, 반점 부피 사이의 증가 및 감소는 노란색, 파란색 및 녹색 착색 반점으로 시각화된 바와 같이 정량화되었으며, 정규화된 반점 부피의 접힘 변화가 1.5 이상이고 P 값이 0.05 미만인 경우 상당한 차이 발현을 갖는 것으로 간주되었습니다. 이 CHE에 이어 정량적, 질량 분석법 또는 추가 단백질체학 분석과 같은 제안 방법을 수행하여 다양한 자극에 대한 반응으로 두 대식세포 하위 집합 간에 어떤 유형의 단백질이 다르게 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 - D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

이 프로토콜은 진핵 세포에서 전체 세포 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 대식세포의 미세환경에 대한 반응으로 대식세포의 다중 활성화 상태를 분석하여 이 기술의 정확성을 보여줍니다.

전체 셀 MALDI-TOF 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

여기, 우리는 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 분리 하 고 좋고 재현할 2DE 패턴 선물 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴 식별과 함께 제시. 많은 단백질은 고감도 석사의 사용과 복잡 한 암 프로테옴을 분석할 때 각 2DE 자리에 관찰 됩니다.

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

배우세요 2D 차등 겔 전기영동을 이용하여 인간 M1 및 M2 대식세포의 단백질 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 소량의 샘플로도 민감하게 단백질 차이를 검출하여 질병 연구에 활용됩니다.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

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