2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

이 절차의 전반적인 목표는 겔 전기영동에서 2D 차등에 의해 인간 전염증성 M1 및 항염증성 M 두 대식세포 하위 집합의 표현형을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 1차 M1 및 M 두 개의 대식세포 배양에서 추출한 단백질을 사인 염료로 라벨링하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 단백질을 함께 혼합하고 재수화에 의한 ISO 전기 집중을 샘플에 대해 수행합니다.

다음 두 번째 차원, 전기 영동은 어둠 속에서 동원된 pH 구배 또는 IPG 스트립으로 수행된 다음 겔 전기 영동 스캐너의 차이로 겔을 스캔합니다. 궁극적으로, M1과 M 두 개의 대식세포 subset 사이의 폴립 소화 반점의 차이를 감지하기 위해 수치화된 이미지의 분석이 수행됩니다. 고전적인 토디 젤 전기 이동법과 같은 기존 방법 중 이 기술의 주요 이점은 이 기술이 더 민감하여 인간 환자로부터 얻은 샘플에 매우 중요한 단백질의 5마이크로그램만 필요하다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생인 Mario Bove, Olivia Beza 및 제 실험실의 Magac 기술자입니다.단핵구 유래 대식세포의 1차 배양을 준비하기 위해 먼저 25ml의 Buffy coat를 25ml의 PBS에 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 희석된 혈액을 분리 구배에 조심스럽게 로드하고 세포가 회전을 마치면 1600Gs 및 실온에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다. 계면층에서 단핵구를 수집한 후, 3차 세척 후 0.1% EDTA를 함유한 10ml의 PBS에서 수확된 세포를 3회 연속 세척합니다.

PBS에서만 세포를 한 번 더 스핀다운한 다음 혈청 시드가 없는 5ml의 RPMI 1640 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 35mm 접시에 있는 세포는 접시당 6개의 세포에 1 곱하기 10의 밀도로 접시에 담은 다음 인큐베이터에서 90분 동안 침전한 후 상층액을 버리고 부착 단핵구를 1ml의 PBS로 3회 세척합니다. 다음 배양, 섭씨 37도에서 6일 동안 인간 혈청 부피당 10%부피를 함유하는 10밀리리터의 신선한 배지와 5%의 이산화탄소를 함유

그런 다음 항염증제 M 2 대식세포를 산출하기 위해, 배양 6일째에 IL 4 밀리리터당 15나노그램을 일부 배양물에 보충하여 12일째에 전염증성 대식세포를 산출합니다. 분화된 대식세포의 다른 배양물을 LPS 밀리리터당 100나노그램으로 4시간 동안 처리하여 2D 전기영동을 위해 대식세포 하위 집합을 분리합니다. 다음으로, 25 millimolar tris로 관심 배양액을 3회 세척한 다음 chaps 추출 버퍼로 플레이트 바닥에서 세포를 분리합니다.

다음으로, 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 끈으로 묶습니다. 5분 후, 100마이크로리터 분취량의 세포를 섭씨 영하 20도로 옮겨 대식세포 부분집합의 ISO 전기 집중을 위한 단백질 농도 분석이 수행될 때까지 보관합니다. 먼저 샘플을 9마이크로리터 분취량으로 조정한 다음 섭씨 37도에서 2밀리몰의 TCEP가 보충된 용해 완충액으로 세포 용액을 줄입니다.

1시간 후 섭씨 37도에서 추출물을 S SI 3 및 S SI 5로 배양하고 동일한 부피의 샘플 버퍼를 추가하여 30분 후에 반응을 중단합니다. 그런 다음 동일한 부피의 S, SI 3개, 표지된 M1 단백질, SCI 5개, 표지된 M, 단백질 2개의 단백질로 구성된 두 개의 별도 혼합물을 만듭니다. 다음으로, 전류를 가하지 않고 24시간 동안 등전 집속 셀 시스템의 챕스 추출 버퍼에 있는 라벨링된 혼합 샘플 450마이크로리터와 함께 IPG 스트립을 재수화합니다.

다음날, 3 시간 동안 300 볼트에 집중시키는 것을 시작하고, 그 후에 6 시간 동안 1000 볼트에 기온변화도를 설치하고, 2개의 8, 3 시간 동안 000 볼트 기온변화도를 각각 실행하기 위하여 2차원 전기 이동법을 수행하기 위하여 평형 완충기에 있는 IPG 지구를 배양하십시오. 10분 후, 스트립을 12.5% 페이지 젤에 옮기고 저융점 아로스로 밀봉합니다. 그런 다음 70볼트의 정전압에서 edin dsic 시스템을 사용하여 밤새 섭씨 20도에서 전기영동을 수행한 다음 브로모 페놀 블루 프론트가 젤 바닥에 도달하여 젤 이미지를 획득할 때까지 300볼트를 실행합니다.

차동 및 겔 전기영동 이미저 스캐너의 두 개의 저형광 유리판 사이에 놓고 5, 32, 5, 80나노미터, 5분의 여기 방출 파장과 6, 33, 6, 70분의 5나노미터에서 겔을 스캔하여 100마이크로미터의 픽셀 크기의 이미지를 생성합니다. 적절한 소프트웨어로 분석한 다음 각 이미지의 스폿 부피를 계산 및 정규화하여 정규화된 스폿 볼륨을 겔에서 검출된 각 스폿의 총 값에 대한 비율로 할당합니다. 변화가 1.5배인 경우 스팟 부피 간의 차이가 유의미한 것으로 간주하여 두 대식세포 그룹 간의 정규화된 스팟 부피 값을 비교하여 각 유형의 대식세포에 대한 단백질 스폿 부피의 차이를 분석합니다.

이 실험에서. 대식세포의 두 가지 아형인 M1 전염증성 및 M형 M2 항염증제의 2D 단백질 패턴은 2D 감별에 의해 결정되었습니다. 젤 전기 이동법에서는, 단백질의 동일한 본은 이용된 cyan 염료의 M1 또는 M 2를 위해 독립적으로 관찰되었다.

흥미롭게도, 겔의 생물정보학적 분석은 반점을 포함하는 20개의 영역을 밝혔으며, 반점 부피 사이의 증가 및 감소는 노란색, 파란색 및 녹색 착색 반점으로 시각화된 바와 같이 정량화되었으며, 정규화된 반점 부피의 접힘 변화가 1.5 이상이고 P 값이 0.05 미만인 경우 상당한 차이 발현을 갖는 것으로 간주되었습니다. 이 CHE에 이어 정량적, 질량 분석법 또는 추가 단백질체학 분석과 같은 제안 방법을 수행하여 다양한 자극에 대한 반응으로 두 대식세포 하위 집합 간에 어떤 유형의 단백질이 다르게 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.