Name: 신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 학습하세요 공초점 형광 현미경을 사용하여 신경근육 접합부의 시냅스 크기, 단백질 농도 및 구조적 변화를 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경근육 질환 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 National Health and Medical Research Council [570930]의 지원을 받았습니다. 이미징은 Bosch Institute Advanced Microscopy Facility에서 수행되었습니다. 연구가 인용된 실험실의 전 구성원들은 이러한 방법을 개발하는 데 기여한 것에 대해 감사를 표합니다.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
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<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰성있게 측정하고 정상 노화와 질병 상태를 포함한 조건의 범위에 걸쳐 NMJ의 특성의 변화를 정량화 할 수있게했다. EN에 대해 기재된 방법 NMJ 이미지 연구자 사전 및 시냅스 전문 분야의 오버랩 영역과 연접 / 배향의 면적과 비교 할 수 직면한다. 사전 및 시냅스 단백질 횡단 섹션을 사용하여 광 제 2 프로토콜의 상대 강도를 비교하기 위해 바람직하다. 세 번째 프로토콜은 특히 시냅스 막에 AChRs의 포장의 근접의 변화를 테스트합니다. 특이성 컨트롤은 면역 형광 현미경에 매우 중요합니다. 간접 면역 형광중인 모든 일차 항체를 사용하는 경우는 먼저 그것이 근육 섹션에서 그 표적 단백질에 특이 적으로 결합하는 것을 보장하는 것이 필요하다. 조직 처리 및 고정 다른 종류의 차등의 특이성을 변경할 수 있습니다항체. 정말 모터 엔드 플레이트에 ACHR에 집중되어 (말의 rapsyn에 대한) 그 면역 형광 염색법을 확인하는 것이 중요합니다. 부정적인 제어...

신경 근육 접합 (NMJ)는 신경계와 골격 근육 사이의 통신을 매개하는 중요한 릴레이 시냅스이다. 그것은 모든 자발적인 운동이 필요합니다. 형광 현미경 긴 NMJ 1-3 마우스 유전자의 효과를 연구하기 위해 또는 설치류 4-11 NMJs시 연령,식이 요법, 운동 및 질환의 효과를 비교하기 위해 사용되었다. 이러한 연구는 NMJ의 생리학 및 병리학 소개 훨씬 가르친하지만 다양한 매개 변수 (예, ACHR 영역 종판 영역, 경계 길이, 분열 인덱스)가 종종 어렵게 이들 연구의 결과를 비교할 수 있도록보고. 전임상 연구는 특히 질병 (12)의 설치류 모델 연구에서, 재현성을 입증 할 수 있으려면 증가 기대가있다. 여기에 설명 된 프로토콜은, 생리 학적 및 병태 생리 학적 발달 CH 조사 일련의 연구를 통해 정제시켰다NMJ에 ANGES. 이러한 연구는 마우스 모터 종판에서 시냅스 전문화 영역과 시냅스 전문화 13-15 시냅스 내의 단백질의 패킹의 상대 밀도의 측정을 필요로한다. 이 방법의 유용성은 중증 근무력증 안티 사향 마우스 모델에서 최근 연구에 의해 예시된다. 안티 사향 양성 중증에서의 IgG 매일 ​​주사는 성인 마우스로 환자들을 2 주 (16) 내에서 약이 될 인한 근무력증. 근육 (신경 터미널에서) synaptophysin에 대한 이중 표지 된 섹션과 시냅스 AChRs의 공 초점 최대 프로젝션 이미지가 주 변화로 ACHR 염색 분야의 진보적 인 감소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 감소의 중요한 비율은 시냅스 전위, 시냅스 전달 및 근육 약화 (17, 18)의 실패의 진폭에 비교 하락을 설명하기에 충분했다. 질적으로 비슷한 연구 결과는 다른 연구 그룹에 의해보고되었다10,19. NMJ 동일한 측정 방법은 사람이 마우스 모델 (20, 21)에 근무력증 안티 사향 중증의 치료 세 약물의 영향을 평가하기 위해 사용되어왔다. 정주의 노화는 신경 근육 연결의 손실을 초래할 수 있습니다. 마우스는 나이로 진행하면서 여기에 설명 된 프로토콜은 모터 종판에서 신경 터미널 시납의 영역에서 연령 관련 감소를 계시했다. 같은 방법은 자발적인 운동이 크게 다른 그룹 4로 이전의 연구와 일치하는 시냅스 전 신경 말단 영역 (22)의 감소를 방지 할 수있는 것으로 나타났습니다. 신경 근육 연결의 손실은 근 위축성 측삭 경화증 9,23의 SOD1G93A 마우스 모델에서 발생합니다. 상기 언급 된 연구들은 건강 상태의 다양한 NMJ에서 전후 시냅스 전문 하나의 영역에서 감소를 초래할 수 있음을 입증한다. 이것은 손상된 시냅스 재미가 발생할 수 있습니다ction의는 신경 근육 연결의 완전한 손실을 예고하거나. 세 가지 프로토콜은 지역과 시냅스 전문의 밀도의 정량을 허용하는 설명되어 있습니다. 제 1 프로토콜의 목적은 형광 현미경을 이용하여, 전후 및 포유 동물의 시냅스 전문 NMJs 그들의 배향의 영역의 실제적이고 재현 가능한 측정 값을 제공하는 것이다. 이차원 최대 투영 공 초점 이미지 및 NIH ImageJ에 함께 이미지 분석 시납 염색 (시냅스 소포), 시냅스 AChRs 시냅스 오버랩 영역의 면적의 변화를 감지하는 데 사용된다. 시냅스 전문 영역을 식별하는 데 사용되는 시각 정보를 최대화하기 위해 공 초점 촬상 파라미터 (이득 및 오프셋 레벨)이 각각 NMJ 최적화되어있다. 신경 근육 장애는 시냅스 ACHR 및 / 또는 기타 시냅스 단백질의 밀도의 변화로 발생할 수 있습니다. 제 2 프로토콜은 시냅스 단백질 등의 상대 밀도의 변화를 검출하도록 적용될 수있다사향, rapsyn, dystroglycan, 인산화의 Src 키나제 인산화 ACHR 18,21있다. 중증 근무력증에서 시냅스 막 내 ACHR의 감소 밀도는 시냅스 실패와 근육 약화의 직접적인 원인이다. 세 번째 프로토콜은 시냅스 막 (14, 15) 내에서 인접 AChRs의 근접의 변화를 평가하기 위해 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 방법을 설명합니다. 이 방법은 형광-α-bungarotoxin (BGT)으로 표시 이웃 AChRs 사이의 에너지 전달을 검출한다. 형광 기증자 및 수용체 프로브는 10nm 이하 떨어져있는 경우 FRET가 발생합니다. 이것은 직접 시냅스 전위의 진폭에 관련 될 수있다 ACHR 포장의 압박감에서 (초 현미경) 변경을 표시 할 수 있습니다. 지난 10 년 동안 정제 된이 세 가지 프로토콜은 일관되고 재현 가능한 방식으로 NMJ 무결성의 보완을 제공합니다. 표준화 된 프로토콜의 사용ND 파라미터 NMJ 포유류 유전자, 환경에 따라 중재 효과 비교를 용이하게한다.

<table><tbody><tr><td>스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>DM 2000 포함&nbsp; TCS SP2 시스템</td><td>대부분의 스캐닝 컨포칼 현미경이 적합해야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>자이스</td><td>LSM 510 메타&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td> 라벨링에 사용<td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>원적외선 형광: 접안렌즈를 통해 거의 보이지 않음&nbsp;</td></tr><tr><td>rabbit anti-synaptophysin</td><td>Life technologies</td><td>18-0130 1차</td><td>항체의 배치에 따라 효과적인 희석</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>FITC-donkey</td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG Jackson</td><td></td><td>711-095-152</td><td>다클론 2차 항체는 소스 및 배치</td></tr><tr><td>에 따라 품질이 다를 수 있습니다.최적 절삭 온도 컴파운드(O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>근육 동결을 위한 저온 유지 물질 임베딩 매트릭스</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>형광단의 광표백을 늦추는 마운팅 매질</td></tr></tbody></table>

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

신경 근육 접합 (NMJ)은 포유 동물의 운동 신경이 자발적 근육 수축을 제어되는 큰, 콜린성 릴레이 시냅스이다. NMJ에서 구조 변경 약화, 위축과 근육 섬유의 사망을 초래, 신경 전달 오류가 발생할 수 있습니다. 많은 연구는 유전자 변형 또는 질환 마우스 NMJ의 구조를 변경할 수있는 방법을 연구 하였다. 불행히도, 직접들은 종종 다른 파라미터 분석 방법을 사용하기 때문에 이들 연구에서 조사 결과를 비교하기 어려울 수있다. 세 개의 프로토콜이 설명되어 있습니다. 제는 아세틸 콜린 수용체 (ACHR)의​​ 면적을 측정하는 최대 강도 투영 공 촛점 이미지를 사용하여 단부 판과 상부 시냅스 전 신경 말단의 시냅스 소포 염색이 풍부한 영역에서 시냅스 막 도메인. 두 번째 프로토콜은 시냅스 막 시냅스 단백질에 대한 면역 염색의 상대적 강도를 비교합니다. 세 번째 홍보otocol은 엔드 플레이트에서 시냅스 AChRs의 포장의 변화를 감지하는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용합니다. 프로토콜이 개발 및 일련의 연구를 통해 정제되었다. 품질과 결과의 일관성에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고 규범 적 데이터는 건강한 젊은 성인 마우스의 NMJs 제공됩니다.

NMJ에서 시냅스 지역 측정 영역의 모든 추정치는 시냅스 전문의 범위를 정의하는 경계의 도면에 의존. 건강한 젊은 성인 근육에 NMJ 이미지 ACHR과 synaptophysin에 염색 (그림 2A와 B) 모두 잘 정의 된 경계를 표시해야합니다. ACHR 및 시납 모두 형광 강도는 모터 엔드 플레이트 (도 5a '및 B')의-주위염 시냅스와 시냅스 사이의 경계 부분에서 급격하게 상승한다. 이러한 이미지 (단지 extrasynaptic 배경 형광 이상) 최소 임계 값은 쉽게 엔드 플레이트 ((그림 5A '와 B')에서 수평 점선)의 ACHR 풍부한 또는 synaptophysin에 풍부한 지역을 격리됩니다. 세 쥐에서와 ACHR에 대한 몇 가지 질병 상태 엔드 플레이트 염색 덜 강렬한 수 있으며, ACHR 클러스터 가장자리 흐리게 ...

신경근 접합부(NMJ)는 때때로 시냅스 실패로 이어질 수 있는 다양한 조건에서 변경됩니다. 이 보고서는 이러한 구조적 변화를 정량화하기 위한 형광 현미경 기반 방법을 설명합니다.

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

이 절차의 전반적인 목표는 시냅스 크기, 단편화 및 시냅스후 막에 있는 단백질의 상대적 밀도를 포함한 시냅스 매개변수를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 실험 동물에서 관심 있는 근육을 해부함으로써 달성됩니다. 다음으로, 절개된 근육은 동결 절편화되고 절편은 형광 현미경 검사를 위한 면역 염색입니다.그런 다음 phos에서 서로 다른 치료 그룹의 신경근 접합부 이미지를 객관적으로 샘플링하고 시냅스 전문화에 대한 염색의 상대적 강도를 정량화합니다. 궁극적으로, 신경근 접합부의 구조적 조직에 대한 치료 또는 유전자 변형의 효과에 대한 재현 가능한 정량적 측정은 컨포칼 현미경으로 얻어집니다. 이 방법은 중증 근무력증 및 운동 뉴런 질환과 같은 장애의 마우스 모델에서 신경근 접합부 구조의 변화를 평가하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 표준화된 객관적 프로토콜을 제공합니다.일반적으로 이 방법을 시도하는 사람들은 편향되지 않고 객관적인 방식으로 컨포칼 현미경에서 NPLS를 샘플링하려면 NPLS의 샘플링 분석이 일관되고 재현 가능한 방식으로 수행되어야 하며, nplate 매개변수 간의 동물 간 변동으로 인해 이를 어렵게 만들 수 있는 계획이 필요하기 때문에 어려울 수 있습니다. 동결절편 및 면역 형광 염색을 분리한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 신경근 접합부 또는 njs는 NMJ 매개변수의 정량화가 완료될 때까지 두 번째 연구자만 알고 있는 난수로 각 슬라이드에 레이블을 지정하여 슬라이드를 블라인드합니다. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 trit C 필터 세트를 사용하여 광시야 조명에서 볼 수 있습니다.컨포칼 핀홀이 1.0 airy unit으로 설정된 필드에 엔드플레이트가 나타날 때까지 필드를 왼쪽에서 오른쪽으로, 뒤로 점진적으로 이동하고 낮은 레이저 출력을 사용하여 이미징할 엔드 플레이트의 trit C red BGT에 대한 게인 및 오프셋 수준을 최적화합니다. 다음으로, 488 나노미터 레이저를 사용하여 시냅토피신을 나타내는 핏 C 형광을 최적화한 다음 각 광학 슬라이스 사이에 0.7미크론 간격으로 엔드 플레이트의 Z 스택을 수집합니다. 이미징 세션의 날짜, 슬라이드의 코드 이름 및 엔드 플레이트의 번호를 포함하는 파일 이름으로 이미지를 저장합니다.슬라이드 또는 샘플에서 20개의 엔드 플레이트가 수집될 때까지 방금 설명한 샘플링 및 이미징 절차를 반복합니다. 그런 다음 동일한 컨포칼 설정에서 나머지 코딩된 슬라이드에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 제어 슬라이드에서 몇 가지 이미지를 가져옵니다.이미지 J 프리웨어를 사용하여 Zack을 열고 하나의 형광 채널에서 최대 프로젝션 이미지를 준비합니다. 투영을 이미지 세션 날짜, 샘플 코드, 종판 번호 및 형광 채널을 포함한 파일 이름과 함께 TIF 파일로 저장합니다. 이제 이미지 J를 사용하여 Z 투영을 엽니다.아세틸콜린 수용체 또는 CHR 이미지 채널을 선택하고 이미지 유형 8비트를 선택하여 다각형 도구를 사용하여 화면에서 24비트 RGB 컬러 이미지를 하나의 8비트 그레이 스케일 이미지로 변환합니다. 빨간색 BGT 염색 채널에서 관심 종판에서 발생하지 않은 염색을 제외하고 관심 종판 주위에 대략적인 윤곽을 그립니다. 이미지 조정 임계값을 선택하여 이미지에 최소 강도 임계값을 적용합니다.임계값 수준을 조정하여 A CHR 염색된 부분을 분리하고 주변 배경 신호를 하위 임계값으로 제외합니다. 그런 다음 비교를 위해 원본 풀톤 이미지가 있는 두 번째 창을 엽니다. 폴리곤 윤곽선이 여전히 존재하는 임계값 설정을 확인하려면 팝업 메뉴에서 analyze, analyze particles를 선택합니다.픽셀 수의 크기 범위를 50에서 무한대로 지정하면 전기 노이즈로 인해 발생하는 작은 아티팩트가 선택되지 않습니다. photo multiplier에서 analyze particles(입자 분석)를 클릭하여 discreet supra threshold areas 목록과 해당 형광 강도 값이 이진 이미지에 나타나는 대로 번호가 매겨진 창을 생성합니다. 이 데이터를 레이블이 지정된 스프레드시트에 복사하여 전체 종판 면적을 측정합니다.폴리곤 내에서 Analyze measure(측정 분석)를 선택하고 A CHR 영역 및 강도에 대한 데이터를 복사하여 레이블이 지정된 열이 있는 스프레드시트에 붙여넣습니다. synaptophysin 채널로 전환합니다. 최대 프로젝션 이미지를 준비합니다.관심 영역을 선택하고 방금 설명한 대로 최소 강도 임계값을 설정합니다. 겹치는 영역을 측정하려면 다음 단계를 적용합니다. 두 채널 이미지가 포함된 원본 파일을 열고 이미지 스택을 선택합니다.이미지에 스택하여 두 개의 개별 이미지로 분할합니다. image J colocalization 플러그인을 사용하여 플러그인 colocalization을 선택하고 A CHR 및 신경 채널에 대해 이전에 기록된 임계값을 해당 채널 쿼리 상자에 입력합니다. 그 결과 흰색 픽셀의 겹침 이미지가 생성됩니다.새로 생성된 오버랩 이미지를 그레이 스케일 형식으로 변환하고 최대값에 임계값을 적용하면 이전 두 채널의 오버랩 영역에 해당하는 흰색 픽셀만 선택됩니다. 겹치는 영역을 픽셀 단위로 나타내는 colocalization의 결과 영역 값을 스프레드시트에 기록하고 데이터 스프레드시트를 준비합니다. 표본 평균은 표준 편차와 표준 오차를 계산하고 히스토그램 또는 산점도로 표시합니다.플롯 및 플레이트: CHR 영역을 산점도 또는 빈도 히스토그램으로 표시하여 통계 테스트 전에 데이터가 정규 분포를 따르는지 여부를 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 횡단 근육 섬유 절편의 면역형광 염색 및 이미징을 준비한 후 원본 이미지 파일을 열고 A CHR 채널을 보면서 이미지로 스택 스택을 선택하여 채널을 분할하고 이미지 유형 8비트를 선택하여 8비트 그레이 스케일 형식을 화면으로 변환합니다. 두 형광 채널 모두에 대해 이 작업을 수행합니다.스택 할 이미지 선택 이미지 및 이전에 분리 된 두 개의 8 비트 이미지에서 새 스택을 열면 다각형 도구를 사용하여 단일 창 내에서 두 형광 채널 사이를 전환 할 수 있습니다. A CHR 염색의 경계를 중심으로 단단히 선을 긋고 분석 측정을 선택하여 밀폐된 영역 내에서 A CHR의 평균 강도를 측정합니다. 이 값을 레이블이 지정된 스프레드시트에 복사하고 다각형 윤곽선을 유지합니다.두 번째 형광 채널로 전환하고 측정 분석을 선택합니다. 이것은 A CHR 염색에 의해 정의된 시냅스 영역 내에서 관심 단백질에 대한 평균 염색을 산출합니다. 눈에 보이는 종판 염색에서 떨어진 영역을 선택하십시오.그런 다음 분석 측정을 선택하여 평균 배경 형광 강도를 측정합니다. 다른 형광 채널에 대해 측정을 반복하고 배경 값을 형광 값 스프레드시트에 복사합니다. 종판 값에서 평균 배경 값을 빼서 A CHR 및 각 종판에서 관심 단백질에 대한 수정된 강도를 구합니다.마지막으로, 관심 단백질에 대한 보정된 nplate 강도 값을 보정된 BGT 형광 강도로 나누어 여기에 표시된 대로 형광 강도 비율을 산출합니다. A CHR과 시냅토피신에 대한 형광 강도는 모터 엔드 플레이트의 PERS, 시냅스 부분과 시냅스 부분 사이의 경계에서 급격히 상승합니다. 이러한 이미지의 경우, 최소 임계값은 엔드플레이트의 A CHR rich 또는 synaptophysin rich 영역을 쉽게 분리할 것입니다.노화된 마우스와 일부 질병 상태에서 이 그림에서 입증된 바와 같이, 시냅토피신에 대한 종판 염색은 덜 강렬할 수 있습니다. CHR 클러스터 가장자리는 흐릿하게 나타날 수 있으며, 더 높은 수준의 추가 시냅스 자가형광 산점도가 있을 수 있으며, 개별 마우스의 경골 전방 근육의 종판(end plates) 중 A CHR이 풍부한 영역에서 상당한 범위를 드러낼 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 얼굴 종판 이미지의 15 내지 20을 기반으로 한 평균 A CHR 영역은 7개의 샘플 마우스에서 유사했습니다. 횡단면에서 종판 achr은 일반적으로 초승달 모양으로 나타나지만, 이 모양은 여기에 예시된 바와 같이 종종 불규칙합니다.Synaptophysin 채널에서 볼 수 있듯이 저강도 배경 형광은 일반적으로 A CHR 염색 패치가 인접한 근육 섬유에 위치한 단일 종판을 나타내는지 아니면 두 개의 별도 종판을 나타내는지 여부를 나타냅니다. 또한 랩슨(rapson), 머스크(musk) 및 베타 디스트로 글라이칸(beta distro glycan)과 같은 많은 시냅스 단백질은 nplate에서 CHR과 함께 공동 국소화되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험자는 nplate 이미지의 샘플링 및 분석 중에 치료 및 유전자형 그룹에 대해 맹목적인 상태를 유지하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 신경근 접합부의 컨포칼 형광 이미지를 수집, 샘플링 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 궁극적으로 연구자들은 서로 다른 치료 그룹과 유전자형 간에 nplate의 서로 다른 구조적 매개변수를 일관되고 객관적으로 비교할 수 있어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

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에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

출처: Marinello, M., et al. 결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 시각화하고 분석하기 위해 공초점 및 초고해상도 현미경을 사용하여 쥐 근육 조직의 신경근 접합부의 준비, 면역염색 및 이미징을 보여줍니다.

결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

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이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

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DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

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