신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

이 절차의 전반적인 목표는 시냅스 크기, 단편화 및 시냅스후 막에 있는 단백질의 상대적 밀도를 포함한 시냅스 매개변수를 객관적으로 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 실험 동물에서 관심 있는 근육을 해부함으로써 달성됩니다. 다음으로, 절개된 근육은 동결 절편화되고 절편은 형광 현미경 검사를 위한 면역 염색입니다.

그런 다음 phos에서 서로 다른 치료 그룹의 신경근 접합부 이미지를 객관적으로 샘플링하고 시냅스 전문화에 대한 염색의 상대적 강도를 정량화합니다. 궁극적으로, 신경근 접합부의 구조적 조직에 대한 치료 또는 유전자 변형의 효과에 대한 재현 가능한 정량적 측정은 컨포칼 현미경으로 얻어집니다. 이 방법은 중증 근무력증 및 운동 뉴런 질환과 같은 장애의 마우스 모델에서 신경근 접합부 구조의 변화를 평가하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 표준화된 객관적 프로토콜을 제공합니다.

일반적으로 이 방법을 시도하는 사람들은 편향되지 않고 객관적인 방식으로 컨포칼 현미경에서 NPLS를 샘플링하려면 NPLS의 샘플링 분석이 일관되고 재현 가능한 방식으로 수행되어야 하며, nplate 매개변수 간의 동물 간 변동으로 인해 이를 어렵게 만들 수 있는 계획이 필요하기 때문에 어려울 수 있습니다. 동결절편 및 면역 형광 염색을 분리한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스 신경근 접합부 또는 njs는 NMJ 매개변수의 정량화가 완료될 때까지 두 번째 연구자만 알고 있는 난수로 각 슬라이드에 레이블을 지정하여 슬라이드를 블라인드합니다. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 trit C 필터 세트를 사용하여 광시야 조명에서 볼 수 있습니다.

컨포칼 핀홀이 1.0 airy unit으로 설정된 필드에 엔드플레이트가 나타날 때까지 필드를 왼쪽에서 오른쪽으로, 뒤로 점진적으로 이동하고 낮은 레이저 출력을 사용하여 이미징할 엔드 플레이트의 trit C red BGT에 대한 게인 및 오프셋 수준을 최적화합니다. 다음으로, 488 나노미터 레이저를 사용하여 시냅토피신을 나타내는 핏 C 형광을 최적화한 다음 각 광학 슬라이스 사이에 0.7미크론 간격으로 엔드 플레이트의 Z 스택을 수집합니다. 이미징 세션의 날짜, 슬라이드의 코드 이름 및 엔드 플레이트의 번호를 포함하는 파일 이름으로 이미지를 저장합니다.

슬라이드 또는 샘플에서 20개의 엔드 플레이트가 수집될 때까지 방금 설명한 샘플링 및 이미징 절차를 반복합니다. 그런 다음 동일한 컨포칼 설정에서 나머지 코딩된 슬라이드에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 제어 슬라이드에서 몇 가지 이미지를 가져옵니다.

이미지 J 프리웨어를 사용하여 Zack을 열고 하나의 형광 채널에서 최대 프로젝션 이미지를 준비합니다. 투영을 이미지 세션 날짜, 샘플 코드, 종판 번호 및 형광 채널을 포함한 파일 이름과 함께 TIF 파일로 저장합니다. 이제 이미지 J를 사용하여 Z 투영을 엽니다.

아세틸콜린 수용체 또는 CHR 이미지 채널을 선택하고 이미지 유형 8비트를 선택하여 다각형 도구를 사용하여 화면에서 24비트 RGB 컬러 이미지를 하나의 8비트 그레이 스케일 이미지로 변환합니다. 빨간색 BGT 염색 채널에서 관심 종판에서 발생하지 않은 염색을 제외하고 관심 종판 주위에 대략적인 윤곽을 그립니다. 이미지 조정 임계값을 선택하여 이미지에 최소 강도 임계값을 적용합니다.

임계값 수준을 조정하여 A CHR 염색된 부분을 분리하고 주변 배경 신호를 하위 임계값으로 제외합니다. 그런 다음 비교를 위해 원본 풀톤 이미지가 있는 두 번째 창을 엽니다. 폴리곤 윤곽선이 여전히 존재하는 임계값 설정을 확인하려면 팝업 메뉴에서 analyze, analyze particles를 선택합니다.

픽셀 수의 크기 범위를 50에서 무한대로 지정하면 전기 노이즈로 인해 발생하는 작은 아티팩트가 선택되지 않습니다. photo multiplier에서 analyze particles(입자 분석)를 클릭하여 discreet supra threshold areas 목록과 해당 형광 강도 값이 이진 이미지에 나타나는 대로 번호가 매겨진 창을 생성합니다. 이 데이터를 레이블이 지정된 스프레드시트에 복사하여 전체 종판 면적을 측정합니다.

폴리곤 내에서 Analyze measure(측정 분석)를 선택하고 A CHR 영역 및 강도에 대한 데이터를 복사하여 레이블이 지정된 열이 있는 스프레드시트에 붙여넣습니다. synaptophysin 채널로 전환합니다. 최대 프로젝션 이미지를 준비합니다.

관심 영역을 선택하고 방금 설명한 대로 최소 강도 임계값을 설정합니다. 겹치는 영역을 측정하려면 다음 단계를 적용합니다. 두 채널 이미지가 포함된 원본 파일을 열고 이미지 스택을 선택합니다.

이미지에 스택하여 두 개의 개별 이미지로 분할합니다. image J colocalization 플러그인을 사용하여 플러그인 colocalization을 선택하고 A CHR 및 신경 채널에 대해 이전에 기록된 임계값을 해당 채널 쿼리 상자에 입력합니다. 그 결과 흰색 픽셀의 겹침 이미지가 생성됩니다.

새로 생성된 오버랩 이미지를 그레이 스케일 형식으로 변환하고 최대값에 임계값을 적용하면 이전 두 채널의 오버랩 영역에 해당하는 흰색 픽셀만 선택됩니다. 겹치는 영역을 픽셀 단위로 나타내는 colocalization의 결과 영역 값을 스프레드시트에 기록하고 데이터 스프레드시트를 준비합니다. 표본 평균은 표준 편차와 표준 오차를 계산하고 히스토그램 또는 산점도로 표시합니다.

플롯 및 플레이트: CHR 영역을 산점도 또는 빈도 히스토그램으로 표시하여 통계 테스트 전에 데이터가 정규 분포를 따르는지 여부를 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 횡단 근육 섬유 절편의 면역형광 염색 및 이미징을 준비한 후 원본 이미지 파일을 열고 A CHR 채널을 보면서 이미지로 스택 스택을 선택하여 채널을 분할하고 이미지 유형 8비트를 선택하여 8비트 그레이 스케일 형식을 화면으로 변환합니다. 두 형광 채널 모두에 대해 이 작업을 수행합니다.

스택 할 이미지 선택 이미지 및 이전에 분리 된 두 개의 8 비트 이미지에서 새 스택을 열면 다각형 도구를 사용하여 단일 창 내에서 두 형광 채널 사이를 전환 할 수 있습니다. A CHR 염색의 경계를 중심으로 단단히 선을 긋고 분석 측정을 선택하여 밀폐된 영역 내에서 A CHR의 평균 강도를 측정합니다. 이 값을 레이블이 지정된 스프레드시트에 복사하고 다각형 윤곽선을 유지합니다.

두 번째 형광 채널로 전환하고 측정 분석을 선택합니다. 이것은 A CHR 염색에 의해 정의된 시냅스 영역 내에서 관심 단백질에 대한 평균 염색을 산출합니다. 눈에 보이는 종판 염색에서 떨어진 영역을 선택하십시오.

그런 다음 분석 측정을 선택하여 평균 배경 형광 강도를 측정합니다. 다른 형광 채널에 대해 측정을 반복하고 배경 값을 형광 값 스프레드시트에 복사합니다. 종판 값에서 평균 배경 값을 빼서 A CHR 및 각 종판에서 관심 단백질에 대한 수정된 강도를 구합니다.

마지막으로, 관심 단백질에 대한 보정된 nplate 강도 값을 보정된 BGT 형광 강도로 나누어 여기에 표시된 대로 형광 강도 비율을 산출합니다. A CHR과 시냅토피신에 대한 형광 강도는 모터 엔드 플레이트의 PERS, 시냅스 부분과 시냅스 부분 사이의 경계에서 급격히 상승합니다. 이러한 이미지의 경우, 최소 임계값은 엔드플레이트의 A CHR rich 또는 synaptophysin rich 영역을 쉽게 분리할 것입니다.

노화된 마우스와 일부 질병 상태에서 이 그림에서 입증된 바와 같이, 시냅토피신에 대한 종판 염색은 덜 강렬할 수 있습니다. CHR 클러스터 가장자리는 흐릿하게 나타날 수 있으며, 더 높은 수준의 추가 시냅스 자가형광 산점도가 있을 수 있으며, 개별 마우스의 경골 전방 근육의 종판(end plates) 중 A CHR이 풍부한 영역에서 상당한 범위를 드러낼 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 얼굴 종판 이미지의 15 내지 20을 기반으로 한 평균 A CHR 영역은 7개의 샘플 마우스에서 유사했습니다. 횡단면에서 종판 achr은 일반적으로 초승달 모양으로 나타나지만, 이 모양은 여기에 예시된 바와 같이 종종 불규칙합니다.

Synaptophysin 채널에서 볼 수 있듯이 저강도 배경 형광은 일반적으로 A CHR 염색 패치가 인접한 근육 섬유에 위치한 단일 종판을 나타내는지 아니면 두 개의 별도 종판을 나타내는지 여부를 나타냅니다. 또한 랩슨(rapson), 머스크(musk) 및 베타 디스트로 글라이칸(beta distro glycan)과 같은 많은 시냅스 단백질은 nplate에서 CHR과 함께 공동 국소화되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험자는 nplate 이미지의 샘플링 및 분석 중에 치료 및 유전자형 그룹에 대해 맹목적인 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신경근 접합부의 컨포칼 형광 이미지를 수집, 샘플링 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 궁극적으로 연구자들은 서로 다른 치료 그룹과 유전자형 간에 nplate의 서로 다른 구조적 매개변수를 일관되고 객관적으로 비교할 수 있어야 합니다.