Name: De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Leer hoe je synaptische parameters kwantificeert bij de neuromusculaire junctie met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Deze methode meet synapsgrootte, fragmentatie en proteïnedichtheid objectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council [570930]. Beeldvorming werd uitgevoerd in de Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Voormalige leden van het lab, wier werk wordt geciteerd, worden bedankt voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van deze methoden.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven protocollen hebben ons in staat om betrouwbaar te meten en te kwantificeren veranderingen in de eigenschappen van de NMJ in een heel scala van voorwaarden, met inbegrip van de normale veroudering en de ziekte van staten. De beschreven voor en methoden geconfronteerd NMJ beelden kunnen de onderzoekers het gebied van pre- en postsynaptische specialisaties en het gebied van de synaptische overlap / uitlijning te vergelijken. Het vergelijken van de relatieve intensiteit van pre- en postsynaptische eiwitte...

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de kritische relais synaps dat de communicatie tussen het zenuwstelsel en de skeletspieren bemiddelt. Het is vereist voor alle vrijwillige beweging. Fluorescentie microscopie al lang gebruikt om de effecten van transgenen bestuderen op muis NMJ 1-3 of de effecten van leeftijd, dieet, lichaamsbeweging en ziekte vergelijk bij knaagdieren NMJs 4-11. Dergelijke studies hebben ons veel geleerd over de fysiologie en pathofysiologie van de NMJ, maar de diverse parameters gerapporteerd (bv AChR gebied, eindplaat oppervlakte, omtrek lengte, fragmentatie indices) maken het vaak moeilijk om de resultaten van deze studies te vergelijken. Er is een toenemende verwachting voor preklinische onderzoekers kunnen reproduceerbaar zijn, vooral in studies met diermodellen voor ziekten 12. De hier beschreven protocollen werden verfijnd door een reeks studies die ontwikkeling, fysiologie en pathofysiologische ch onderzochtanges naar de NMJ. Dergelijke studies vereisen meting van het gebied van de synaptische specialisaties op de muis motorische eindplaat en de relatieve dichtheid van de verpakking van synaptische eiwitten binnen postsynaptische specialisaties 13-15. De bruikbaarheid van deze methode wordt geïllustreerd door recente studies in een muismodel van anti-MuSK myasthenia gravis. Dagelijkse injecties van IgG uit anti-MuSK-positieve myasthenia gravis patiënten in volwassen muizen zorgde ervoor dat ze zwak worden binnen 2 weken 16. Confocale maximale projectie beelden spier secties werden dubbel gelabeld voor synaptofysine (in zenuw-terminals) en postsynaptische AChRs toonde een geleidelijke afname van het gebied van AChR kleuring als primaire verandering. Belangrijk is het tempo van de daling was voldoende om vergelijkbare dalingen in de amplitude van synaptische potentialen, falen van synaptische transmissie en spierzwakte 17,18 verklaren. Kwalitatief vergelijkbaar bevindingen werden gerapporteerd door andere onderzoeksgroepen10,19. Dezelfde NMJ meetmethoden zijn sindsdien gebruikt om het effect van drie geneesmiddelen te beoordelen voor het behandelen van anti-MuSK myasthenia gravis in dit muismodel 20,21. Sedentaire veroudering kan leiden tot verlies van de neuromusculaire verbindingen. De hier beschreven protocollen hebben een leeftijdsgebonden achteruitgang op het gebied van zenuwuiteinde synaptofysine bij motorische eindplaten geopenbaard als muizen vooruitgang tot op hoge leeftijd. Dezelfde methoden bleek dat vrijwillige uitoefening grotendeels kon voorkomen dat de vermindering van de presynaptische zenuwuiteinde gebied 22, in overeenstemming met eerder werk van andere groepen 4. Verlies van neuromusculaire verbindingen komt ook voor in de SOD1G93A muismodel van amyotrofische lateraal sclerose 9,23. De bovengenoemde studies tonen aan dat een verscheidenheid van gezondheidsproblemen kan leiden tot vermindering van het gebied van een van beide pre- of post-synaptische specialisaties op het NMJ. Dit kan resulteren in een verminderde synaptische functie of kunnen inluiden volledig verlies van de neuromusculaire verbinding. Drie protocollen worden beschreven dat kwantificering van het gebied en de dichtheid van synaptische specialisaties mogelijk te maken. Het doel van het eerste protocol is een praktische en reproduceerbare meting van de oppervlakken van pre- en postsynaptische specialisaties en hun aanpassing aan zoogdieren NMJs indienen waarbij fluorescentiemicroscopie. Tweedimensionale maximum projectie confocale beelden en beeldanalyse met NIH ImageJ om wijzigingen in het gebied van synaptophysine kleuring (synaptische blaasjes), postsynaptische AChRs en synaptische overlappingsgebied detecteren. Confocale beeldvorming parameters (gain en offset niveau) worden geoptimaliseerd voor elke NMJ om de visuele informatie gebruikt om het gebied van synaptische specialisatie onderscheiden maximaliseren. Neuromusculaire mislukking kan ook resulteren uit veranderingen in de dichtheid van postsynaptische AChR en / of andere synaptische eiwitten. Het tweede protocol kan worden toegepast om de veranderingen in de relatieve dichtheid van postsynaptische eiwitten detecterenals muskus, rapsyne, dystroglycan, gefosforyleerd Src kinase en gefosforyleerd AChR 18,21. In gravis myasthenie, een verminderde dichtheid van AChR binnen de postsynaptische membraan is de directe oorzaak van synaptische mislukking en spierzwakte. Het derde protocol beschrijft een Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) gebruikt om veranderingen in de nabijheid van aangrenzende AChRs op postsynaptische membranen 14,15 beoordelen. Deze methode detecteert energieoverdracht tussen naburige AChRs gelabeld met fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET alleen gebeurt wanneer de fluorescerende donor en acceptor probes minder dan 10 nm uit elkaar. Dit kan (submicroscopic) veranderingen in de dichtheid van AChR verpakking die rechtstreeks betrekking kunnen hebben op de amplitude van synaptische potentialen onthullen. Deze drie protocollen, verfijnd in het afgelopen decennium, bieden aanvullende maatregelen van NMJ integriteit op een consistente en reproduceerbare wijze. Het gebruik van gestandaardiseerde protocollen eennd parameters dienen vergelijking van de effecten van genen en milieu-ingrepen op het zoogdier NMJ vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>DM 2000 met&nbsp; TCS SP2 systeem</td><td>De meeste scanning confocal microscopen zouden geschikt moeten zijn.&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxin (rood-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>Gebruikt voor het labelen van AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotoxin (ver-rood-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Ver rood fluorescentie: nauwelijks zichtbaar door het oculaire&nbsp;</td></tr><tr><td>konijn anti-synaptophysin</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td><td>Verschillende batches van primaire antilichamen verschillen in effectieve werkverdunning</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan FITC</td></tr><tr><td>FITC-donkey anti-konijn IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>Polyklonale secundaire antilichamen kunnen in kwaliteit variëren volgens bron en batch</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Cryostat-inbeddingsmatrix voor het invriezen&nbsp; spieren</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Montagemedium dat het fotobleken van fluoroforen vertraagt</td></tr></tbody></table>

de neuromusculaire junctie: meten synapse maat, fragmentatie en veranderingen in synaptic protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de grote, cholinerge relais synaps waardoor zoogdieren motorische neuronen controle vrijwillige spiersamentrekking. Structurele veranderingen op de NMJ kan resulteren in neurotransmissie falen, wat resulteert in zwakheid, atrofie en zelfs de dood van de spiervezels. Vele studies hebben onderzocht hoe genetische modificaties of aandoening de structuur van de muis NMJ kan veranderen. Helaas kan het moeilijk zijn direct vergelijken resultaten van deze studies, omdat ze vaak gebruikt verschillende parameters en analysemethoden. Drie protocollen worden hier beschreven. De eerste maakt gebruik van maximale intensiteit projectie confocale beelden op het gebied van acetylcholine receptor (AChR) te meten rijke postsynaptische membraan domeinen bij de eindplaat en het gebied van de synaptische blaasjes kleuring in de bovenliggende presynaptische zenuwuiteinde. Het tweede protocol vergelijkt de relatieve intensiteiten van immuunkleuring voor synaptische eiwitten in het postsynaptische membraan. De derde protocol gebruikt Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) veranderingen in de verpakking van postsynaptische AChRs aan de eindplaat detecteren. De protocollen zijn ontwikkeld en verfijnd over een reeks van studies. Factoren die de kwaliteit en de consistentie van de resultaten beïnvloeden worden besproken en normatieve gegevens zijn bedoeld voor NMJs bij gezonde jonge volwassen muizen.

Meting van Synaptic Area op de NMJ Elk geraamde gebied vertrouwt op de tekening van een grens aan de mate van synaptische specialisaties definiëren. Bij gezonde jonge volwassen spieren moeten NMJ beelden goed gedefinieerde grenzen voor zowel AChR en synaptofysine kleuring (Figuur 2A en B) weer te geven. Fluorescentie-intensiteit voor zowel AChR en synaptofysine stijgt scherp aan de grens tussen de peri-synaptische en synaptische gedeelte van...

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Het algemene doel van deze procedure is om synaptische parameters objectief te kwantificeren, inclusief synapsgrootte, fragmentatie en de relatieve dichtheid van eiwitten in de postsynaptische membraan. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende spier uit de experimentele dieren te dissecteren. Vervolgens wordt de gedissecteerde spier cryo-gesecteerd, en de secties worden immuno gekleurd voor fluorescentiemicroscopie.Vervolgens worden op phos beelden van neuromusculaire juncties van de verschillende behandelingsgroepen objectief bemonsterd, en wordt de relatieve intensiteit van de kleuring voor synaptische specialisaties gekwantificeerd. Uiteindelijk worden reproduceerbare kwantitatieve metingen van de effecten van een behandeling of genetische modificatie op de structurele organisatie van de neuromusculaire junctie verkregen door confocale microscopie. Welnu, deze methode biedt gestandaardiseerde objectieve protocollen met behulp van confocale microscopie om veranderingen in de structuur van de neuromusculaire junctie te beoordelen in muismodellen van aandoeningen zoals myasthenia gravis en motor neuron ziekte.Over het algemeen kunnen mensen die deze methode proberen het moeilijk vinden omdat het bemonsteren van NPLS op de confocale microscoop op een onbevooroordeelde en objectieve manier planning vereist Na het bemonsteren moet de analyse van NPLS op een consistente en reproduceerbare manier worden uitgevoerd, waarbij de variatie tussen de nplate-parameters van dier tot dier dit moeilijk kan maken. Na het isoleren van cryosecteren en immunofluorescent kleuring, worden muis neuromusculaire juncties of njs, volgens het tekstprotocol, blind gemaakt door ze te labelen met een willekeurig nummer dat alleen bekend is bij een tweede onderzoeker totdat de kwantificering van NMJ-parameters is voltooid. Plaats een schuifje op het microscoopplatform en gebruik een trit C-filterset om het onder breedveldverlichting te bekijken.Beweeg progressief door de velden van links naar rechts en terug totdat een endplaat verschijnt in het veld met de confocale pinhulp ingesteld op 1,0 airy-eenheid, en gebruik met lage laservermogen de versterkings- en offsetniveaus voor trit C rood BGT bij de endplaat die moet worden afgebeeld. Gebruik vervolgens de 488 nanometer laser om de fit C-fluorescentie te optimaliseren, die synaptofysine vertegenwoordigt, en verzamel vervolgens een Z-stack van de endplaat met een interval van 0,7 micron tussen elke optische plak. Sla de afbeeldingen op met een bestandsnaam die de datum van de beeldacquisitiesessie, de codenaam van de schuif en het nummer van de endplaat bevat.Herhaal de zojuist gedemonstreerde bemonsterings- en beeldacquisitieprocedure totdat er 20 endplaten van de schuif of het monster zijn verzameld. Herhaal vervolgens het proces voor de resterende gecodeerde schuiven onder dezelfde confocale instellingen. Neem een paar afbeeldingen van de controleschuif.Gebruik Image J freeware om een Zack te openen en in één fluorescent kanaal een maximale projectie afbeelding voor te bereiden. Sla de projecties op als TIF-bestanden met de bestandsnaam, inclusief de beeldacquisitiesessiedatum, de steekproefcode, het endplatenummer en het fluorescente kanaal. Gebruik nu Image J om de Z-projectie te openen.Selecteer de acetylcholinereceptor of A CHR-beeldkanaal en selecteer afbeeldingstype acht bit om de 24 bit RGB-gekleurde afbeelding om te zetten in een acht bit grijstintenbeeld op het scherm met het polygoonhulpmiddel. Teken in het rode BGT-kleuringskanaal een ruwe omtrek rond de endplaat van belang, met uitsluiting van elke kleuring die niet afkomstig is van de endplaat van belang. Selecteer afbeeldingsaanpassingsdrempelwaarde om een minimale intensiteitsdrempel toe te passen op de afbeelding.Stel de drempelwaarde in om de A CHR-gekleurde delen te isoleren terwijl de omringende achtergrondsignaal als subdrempel wordt uitgesloten. Open vervolgens een tweede venster met de originele volledige toon afbeelding voor vergelijking. Om de drempelinstellingen te bevestigen met de polygoon omtrek nog steeds aanwezig, selecteer analyse, analyseer deeltjes in het pop-upmenu.Specificeer het bereik van maten in aantal pixels als 50 tot oneindig, wat de selectie van kleine artefacten elimineert die voortkomen uit elektrische ruis. Klik in de fotovermenigvuldiger op analyseer deeltjes om een venster te genereren met een lijst van discrete supra-drempelgebieden en hun fluorescentie-intensiteitswaarden genummerd zoals ze verschijnen in de binaire afbeelding. Kopieer deze gegevens naar een gelabelde spreadsheet om het totale endplate-oppervlak te meten.Selecteer binnen het polygoon Analyseer meten, kopieer en plak de gegevens voor A CHR-gebieden en intensiteiten in een spreadsheet met gelabelde kolommen. Schakel over naar het synaptofysinekanaal. Bereid een maximale projectie afbeelding voor.Selecteer een gebied van belang en stel de minimale intensiteitsdrempel in zoals net is gedemonstreerd. Om het overlapgebied te meten, past u de volgende stappen toe. Open het originele bestand met de afbeeldingen van de twee kanalen en selecteer afbeeldingsstacks.Stapel de afbeeldingen om het in twee afzonderlijke afbeeldingen te splitsen. Gebruik de Image J-colocalisatie-invoegtoepassing, selecteer invoegtoepassing colocalisatie en voer de drempelwaarden in die eerder zijn geregistreerd voor de A CHR- en zenuwkanalen in het respectieve kanaalqueryvakje. Het resultaat is een overlapafbeelding in witte pixels.Converteer de nieuw gemaakte overlapafbeelding naar een grijstintenformaat en pas een drempel toe op de maximale waarde, die alleen de witte pixels selecteert die overeenkomen met het overlapgebied van de twee vorige kanalen. Noteer in de spreadsheet de resulterende waarde van de colocaliserende gebied, die het overlapgebied in pixels vertegenwoordigt, bereid een spreadsheet van gegevens voor. Steekproefberekeningen en plot standaardafwijkingen en standaardfouten als histogrammen of spreidingsdiagrammen.Plot en plateer A CHR-gebieden als spreidingsdiagrammen of frequentiehistogrammen om te bepalen of de gegevens normaal verdeeld zijn vóór statistische tests. Na het voorbereiden van immunofluorescente kleuring en beeldacquisitie van transversale spiervezelsecties zoals beschreven in het tekstprotocol, opent u een origineel afbeeldingsbestand en terwijl u de A CHR-kanaal bek

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie...

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

De Drosophila neuromusculaire verbinding (NMJ) wordt gebruikt als model om de morfologie en functie van synapsen te bestuderen. Deze video beschrijft belangrijke kenmerken die onderzoekers kwantificeren om de NMJ te karakteriseren. Het voorbeeldprotocol demonstreert een software die de kwantificering automatisch kan uitvoeren.

Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

Source: Marinello, M., et al. Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the preparation, immunostaining, and imaging of neuromuscular junctions in rat muscle tissue using confocal and super-resolution microscopy to visualize and analyze presynaptic and postsynaptic structures.

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Het protocol beschrijft de methode om een fluorescerende calciumkleurstof door de gesneden zenuw in de motorische zenuwuiteinden van de muis te laden. Daarnaast wordt een unieke methode gepresenteerd voor het registreren van snelle calciumtransiënten in de perifere zenuwuiteinden met behulp van confocale microscopie.

Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Leer hoe je synaptische parameters kwantificeert bij de neuromusculaire junctie met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Deze methode meet synapsgrootte, fragmentatie en proteïnedichtheid objectief.

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen