Name: 파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 적색/근적외선 광치료가 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가하는 방법을 체외 배양 세포에서. 이 기술은 파장과 강도를 정밀하게 조절하여 광치료의 생물학적 효과를 연구합니다.

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이 연구는 신경외상 연구 프로그램(Neurotrauma Research Program, 서호주)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 도로 외상 신탁 계좌를 통해 자금을 지원받지만 도로 안전 위원회의 견해나 권장 사항을 반영하지 않습니다.

1. 광학 보정 : 측정 광 출력 <ol><li> 광 전달 장치를 준비하기 위해, 광대역 광원을 연결 (예를 들어, 제논 램프 또는 텅스텐)에 적합한 전원 공급 장치에 관한 것이다. 광의 시준 된 빔을 생성하는 광원 앞의 콜리 메이팅 렌즈를 배치. 광속에서 대부분의 열을 제거하기 위해 액체 열 필터를 통해 광을 통과. 애플리케이션에 따라, 빛의보다 유연한 전달 (예., 인큐베이터) 제공 액체 광 가이드의 입사 개구에 평행 빔에 초점. </li><li> 액체 광 가이드의 타단에, 시준 렌즈를 제하고 간섭 및 감광 필터의 위치 홀더. 이 배열은 원하는 파장 대역과 강도의 빛의 균일 조명 자리를 생산하고 있는지 확인합니다. 참고 : 라이트 가이드와 시편 평면의 끝 사이의 거리에 따라 달라질 필요가 있습니다조명되어야하지만 지역 도광 증가 단부로부터의 거리로, 광 강도가 감소한다는 것을 기억. 본 연구에서는,이 거리가 14cm이고 균일 96- 웰 플레이트에 3 × 3 웰 영역을 조명 빔 단면을 생성한다. </li><li> 램프와 관련 광학 부품으로부터 미광을 확인하는 것은 시편에 도달 할 수 없습니다. </li><li> 액체 열 필터 물 쿨러의 전원을 켜고 필터 재킷을 통해 물 교환이 확인합니다. 램프 전원을 켜고 안정 될 때까지 광대역 광원 적어도 5 분 동안 기다립니다. 주 : 물 냉각기의 사용은 장치의 과열을 방지 할 필요가있다. </li><li> 조명의 원하는 파장 대역을 생성하는 (보통 반 최대 (FWHM) 대역폭에서 자신의 중심 파장, 피크 투과율 및 전체 폭에 의해 기술) 협 대역 간섭 필터를 선택합니다. 참고 : 본 연구에 사용 된 협 대역 간섭 필터 (4)이었다42 나노 미터, 550 나노 미터, 671 nm에서 810 nm의. </li><li> 시편은 치료 중에 위치하도록 평면에서 램프에 의해 생성 된 광을 측정한다. 제조업체의 지시에 따라 적부 소프트웨어를 사용하여, 적절한 접속 분광 방사 조도 교정 프로브 (코사인 콜렉터)을 사용하여 광을 측정한다. </li><li> 원하는 출력이 얻어 질 때까지의 광의 강도를 조정하는 감광 필터를 사용한다. 참고 : 본 연구에서, 각각의 간섭 필터에 의해 통과 된 광의 강도는 네 개의 처리 wavebands 각각에서 동일한 계량 적 출력을 제공하도록 조정된다. 이 램프 출력이 변경 될 수 있습니다로, 정기적으로 교정을 확인하는 것이 중요합니다. 주 : 장치의 셋업이 이어, 세포를 조명 될 준비가 하나가 현재 연구에 사용 된 광 전달 장치의 그림 표현이다.. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52221/52221fig1.jpg" ftp_upload> 빛 전달 장치. 일러스트 그림 1. 이미지는 빛 전원 주택, 시준 렌즈, 물 필터, 입구 조리개, 액체 라이트 가이드, 초 콜리 메이팅 렌즈, 필터 홀더, 처리 프레임과 매트 블랙 카드 크세논 램프입니다. 협 대역의 파장과 강도 필터가 표시되지 않습니다. 2. 셀 준비 <ol><li> 기재된 R / NIR-LT 배송 방법은 어떠한 세포 유형 또는 시험 관내 모델 시스템에 적용될 수있다; 세포 배양의 다음과 같은 설명은 배양 갈색 세포종 (PC12), 뮐러 (RMC1)와 일차 혼합 망막 세포에 잘 확립 된 기술을 사용하여, 일반적으로이다. </li><li> 빛 치료 및 산화 스트레스 분석을위한 세포 파종하기 전에, 문화는 T75의 flas에서 적절한 보조제 (예., FBS, 항생제)를 포함하는 각각의 성장 배지에서 세포를 불멸화70-80% 합류 할 때까지 KS. </li><li> 예를 테스트하기 위해 세포 유형에 적합한 방법을 사용하여 T75 플라스크로부터 불사 화 세포를 분리., 트립신. 필요한 경우, 96 웰 분석 플레이트에서 세포의 파종 진행하기 전에, 코트 분석 플레이트 (PC12 세포에 대한 예.) 1 시간에 대한 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신과 우물 또는 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신 10μg와 O / N 배양 한 다음 1 시간 / ㎖ 라미닌 (예., 혼합 망막 세포). </li><li> 원심 분리 세포 (예., PC12 세포에 대한 405 XG 또는 RMC1 전지용 218 XG에 10 분에서 3 분)와 같은 적절한 수집 할 적절한 세포 배양 배지 8 ㎖에 상청에 resuspend 제거. </li><li> 혼합 망막 세포가 사용되는 경우, 확립 된 절차에 따라 19 소화 효소 (파파인)에 의해 P0-5 신생아 래트 새끼로부터 제조 </li><li> 혈구 계를 사용하여, 0.4 % (W / V) 트립 판 블루 염색 배제 생존 세포 수를 계산. </li><li> 셀 밀도 SUC를 조정세포 배양에서 24 또는 48 시간 후 약 70~80% 합류 될 것입니다 시간. (PC12 세포에 대한 시딩 밀도 RMC1 세포를 들어, 2.5 × 10 5 생세포 / ㎖이고, 혼합 망막 세포 것이 8 × 10 5 생세포 / ㎖이며, 4.0 × 10 5 생세포 / ㎖ 임). 셀을 추가 한 후 중 적절한 성장 배지 100 ㎕에, (H 2 O 2 또는 DCFH-DA 분석 각각 사용) 명확한 또는 검은 색 96 웰 플레이트, 플레이트는 37 ° C, 5 평평한 표면에 앉아 할 수 있도록 % CO 2 세포 부착을 허용하는 최소 24 시간 동안 (또는 어떤 조건은 특정 세포 유형에 적합한). </li><li> 해당 96 웰 트레이 성장 미디어 문화의 세포들은 70 ~ 80 %의 합류 (PC12 및 RMC1 세포에 대한 24 시간, 혼합 망막 세포 48)까지. </li></ol> 3. 세포에 글루타민산 스트레스 추가 <ol><li> 적절한 성장한다 전체에 0-10mM의 L 글루탐산 모노 나트륨 염 수화물 스트레스 농도 준비일 문화 미디어. </li><li> 세포에서 미디어를 제거하고 부드럽게 PBS (PC12) 또는 HBSS (RMC1과 혼합 된 망막 세포)와 세포를 3 회 세척한다. 세척 후 / 웰에 100㎕의 총 부피로 글루타메이트 - 함유 배지를 추가한다. </li></ol> 라이트 치료 4. 첫 번째 투여 량 <ol><li> 즉시 글루타메이트 또는 선택의 스트레스 요인의 추가에 따라, 제조 된 광 전달 장치 아래에 배치하여 원하는 파장과 강도 빛 치료에 세포를 노출합니다. 파장에 따라 중립적 인 밀도 필터의 설치 조합을 사용하여 광선의 계량 적 출력 관리중인 변경해야합니다. 참고 : 현재의 실험에서, 3 분 동안 빛 치료에 세포를 노출 37 O C 열 패드의 96 웰 플레이트를 놓아 온도를 유지한다. 요구되는 처리 시간은 변할 수있다. <ol><li> 96 아 인접 우물에 반영하는 빛을 방지하기 위해 세포 아래에 매트 블랙 카드를 놓습니다L 트레이는 다른 치료 매개 변수에 대한 지정. </li></ol></li><li> 처리는 시간의 긴 길이에 대해 요구되는 경우, 최적 또는 조건을 세포 배양 배지의 pH를 유지 또는 이상적으로, 5 % CO 2로 조절 CO 2 농도 인큐베이터 내에서 장치 및 처리 판을 배치하고 25mM HEPES 완충 추가 특정 세포 유형. </li><li> 광처리 종료 후, 평평한 표면에 세포를 넣고 37 ℃, 5 % CO 2에서 24 시간 배양한다 대 (또는 어떤 상황 세포 유형에 대해 최적). 주의 : 전술 한 바와 같이 필요에 따라 R / NIR-LT의 추가의 투여 량은, 투여 할 수있다. </li></ol> ROS의 빛 치료와 탐지 5. 최종 복용량 <ol><li> 광처리의 최종 라운드를 수행하기 전에 시약 ROS 검출에 사용될 준비. 2 O 2 검출 시약 작업을 50mM의 구연산 완충액 (pH6.0), 트리톤 X100 및 H 준비용액 (1 : 2 : 10 mM이 H 2 O 2 검출 시약 원액의 비율 97 10 U / ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 50 mM의 시트르산 나트륨 (PH 6.0)). 적절한 미디어에서 100μM의 최종 농도 DCFH-DA를 준비합니다. 주 : PC12 세포에 DCFH-DA를위한 시약 RPMI 매체이며, RMC1 전지용 DCFH-DA 시약 DMEM 배지에서이다. 시판 검출 시약 특정 ROS에 차동 감도를 가지고 시약 개별 애플리케이션에 요구되는 정보를 제공하기 위해주의 깊게 선택되어야합니다. </li><li> 4.1-4.1.2 단계에 기재된 바와 같이, 세포에 광처리를 관리. 확인 세포는 빛의 원하는 플루 언스 / 파장으로 처리되고있다. </li><li> 즉시 글루타메이트 - 함유 배지를 제거하고 적절한 완충 용액으로 두 번 세척 광처리는 다음의 (PC12 세포 위해 PBS를 사용하고, 셀 RMC1 위해 HBSS가 사용된다). 다음과 같이 세포의 ROS 분석을 수행합니다 : <ol><li> H 2 O 2 2를 37 ° C에서 품어 5 %. H의 50 μL 2 O 2 탐지 작업 솔루션을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. 을 530nm의 여기 파장 및 ~ 480㎚의 발광 파장을 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. </li><li> DCF 분석은 : 각각의 웰에 DCFH-DA의 100 μM 용액 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2 배양한다. 100 μM DCFH-DA가 포함 된 용지를 제거하고 위에서 설명한대로 두 번 적절한 완충 용액으로 세척한다. 각각의 웰에 완충 용액 10 μL 트리톤 X100의 90 μl를 추가하고 부드럽게 37 ° C에서 30 초 15 분 전에 배양을위한 궤도 진탕 기에서 흔들어. ~ 480㎚의 여기 파장과 발광 wavel와 플레이트 판독기를 이용하여 유도 된 DCF 형광 측정을 530nm의 ength. </li><li> 익스프레스 ROS는 단백질 MG를 계산하는 표준 곡선을 참조하여, 제조업체의 지시에 따라 단백질 농도를 비색 정량 키트를 이용하여 웰에 남아있는 세포의 단백질 농도에 대하여 값. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 성공적이 R / NIR-LT 시험관 최적화 연구기구를 제공하기 위해 정밀한 보정 광 전송 시스템을 채택했다. R의 파장 및 강도 파라미터 / NIR-LT는이 시스템을 이용하여 정확하고 효율적으로 조작 될 수있다. ROS 테스트 세포 유형에서 제공되는 파장과 투여 량 감소되지 않았다하더라도 우리는 세포 죽음으로 이어질하지 않은 세포의 빛 치료를 설립했다. 670nm (20.11W / m 2)에서 현재 시스템에 의해 달성의 최대 농도는 1.17 W / m 2 시신경과 0.3W의 복부 표면에 도달 쥐의 뇌에 조사의 투과도의 이전에 출판 된 조치의 초과에 / m 2 뇌 케이스의 복부 표면에 도달했다. 0.31 J / cm 2 - 30 분 동안 전달되는 경우, 생체 내에서의 시신경 세포에 의해 수신 된 투여 량은 0.054, 따라서이다. 현재의 연구에서 전달 670nm의 빛의 용량 (0.38J / ㎠...

반응성 산소 종 (ROS)의 신호 전달 경로와 하나의 신경 세포를 포함한 정상적인 대사 반응의 범위에 대해 요구된다. 내인성 항산화 메커니즘은 ROS의 생성을 제어 할 수없는 때, 세포는 산화 스트레스에 굴복 2,3-있다. CNS에 손상 후, ROS 및 산화 스트레스의 존재가 증가 연관된 손상 4,5의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 평가 된 산화 스트레스를 감쇠하기위한 전략의 광대 한 수에도 불구하고, 신경 외상 (6) 다음의 임상 사용 ROS 생산과 관련된 산화 스트레스를 감쇠에 대한 완전히 효과, 임상 적으로 관련된 항산화 전략은 현재 존재하지 않는다. 따라서 산화 스트레스의 감쇠는 치료 적 개입 7에 대한 중요한 목표 남아있다. 개선 사항은 다음과보내고 R / NIR-LT는 부상 아마도 산화 스트레스를 줄임으로써 심근 경색 크기, 당뇨병 및 간 동안 신장 합병증, 망막 변성, CNS 손상 및 뇌졸중 (8)의 감소를 포함하여 다양한 질환에서보고되었다. CNS 부상에 특히 관련하여, 670nm의 빛의 효능 임상 연구는 망막 변성 9-11, 척수 손상 (12), 신경 세포의 죽음 (13)의 모델에 좋은 효과를 보여 주었다. 임상 시험은 그러나이 실험의 결과는 15 매개 변수 효과적인 치료를 사용하는 것이 아마도 장애로 인해 유망 나타나지 않습니다, 황반 변성 관련 마른 나이 수행과 뇌졸중 (14)에 대해 현재 진행되고있다. 따라서, R / NIR-LT 널리 비 침습적, 관리하기 쉽고 상대적으로 저렴한 치료에도 불구하고, 신경 외상 정상 임상 실습의 일환으로 채택되지 않았습니다. 임상 번역 장벽은 CL의 부족을 포함초기 표준화 효과적인 치료 프로토콜 16, 17의 행동과 부재의 메커니즘을 이해했다. 빛 치료에 대한 현재 문헌 조사 소스에 대해 (LED 또는 레이저), 파장 (예를 들어, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), 조사의 총 용량 (주울 / 치료 매개 변수의 변화의 과다를 보여 단위 영역), 지속 시간 (노광 시간), 타이밍 (예정 모독 또는 포스트), 치료의 빈도 및 전달 모드 () 펄스 또는 연속 8. 연구와 치료 매개 변수의 변동성 비교 어렵고 효능 (16)에 대한 회의론에 기여하고있다. 따라서, R / NIR-LT의 최적화는 명확 여러 변수를 비교하는 데 필요한 높은 처리량 스크리닝 기법을 제공 할 수있는 세포 배양 시스템이 필요하다. 그러나 워싱턴를 통해 충분한 유연성과 제어를 제공 할 수 몇 상업적으로 이용 가능한 조명 시스템이 있습니다velength 강도는 최적화 실험을 수행 할 수 있습니다. 시판 LED 장치는 일반적으로 강도뿐만 아니라 다를 수 있습니다 다른 제조 업체, 여러 LED 소자를 사용하는 연구자의 결과로 여러 파장이나 강도를 제공 할 수뿐만 아니라 방출되는 빛의 파장의 스펙트럼하지 않습니다. 우리는 따라서 R / NIR-LT의 파라미터의 근접, 정확한 제어를 허용하며, 파장 및 빛의 플루 언스의 범위를 생성하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 광대역 크세논 광원을 사용함으로써이 문제를 해결했다. 그것은 치료의 치료 학적 투여 량은 R / NIR-LT의 경우 사이토 크롬 C 산화 효소 (COX) (18)로 가정하고, photoacceptor (발색단)와 상호 작용하는 광자의 수에 의해 정의된다는 점에주의하는 것이 중요하다. 전달 광자 에너지는 파장에 따라 달라집니다; 서로 다른 파장의 에너지의 동일한 용량을 의미하는 것은 COM 될 것입니다광자의 상이한 수의 입상. 따라서, 소자로부터 방출 된 광이 테스트에 선택된 파장의 광자를 각각 동일한 수의 방출하도록 조정 하였다. 생체 외에서 세포의 파장과 강도의 범위에서 R / NIR-LT를 전달하는데 사용될 수있는 시스템을 개발하고 실시 세포에서 ROS 생성에 전달되는 R / NIR-LT의 효과를 측정 할 수있는 능력을 입증 글루타민산 염 스트레스.

<table><tbody><tr><td>OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)</td><td>Cell Biolabs</td><td>STA-342</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed 시약</td><td>Molecular Probes</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>300 Watt Xenon Arc Lamp</td><td>Newport Corporation</td><td>6258</td><td>매우 강렬한 광원, 램프를 직접 쳐다보지 마십시오. 램프가 켜져 있는 동안 램프에 충분한 냉각이 있는지 확인하십시오</td></tr>. <tr><td>USB4000-FL 형광 분광계</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200&mu; m 직경 석영 광섬유</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite 분광학 플랫폼</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2300 EnSpire 다중 모드 플레이트 리더</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>급성 독성, 취급 시 장갑을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>L-글루탐산 모노소듐 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>142-47-2 (무수)</td><td></td></tr><tr><td>페오크로세포종 쥐 부신 수질(PC12) 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, 미국 원산지</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>37까지 따뜻함 &deg; C 사용 전 수욕</td></tr><tr><td>말 혈청, 뉴질랜드 원산지</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>37 &deg로 따뜻한; C 사용 전 수욕</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>37도까지 따뜻하게 &deg; C 사용 전 수조에서</td></tr><tr><td>100 mM 나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>37°C로 따뜻하게; C 사용 전 수조에서</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>37°C로 따뜻하게; C 사용 전 수조에</td></tr><tr><td>100X MEM 비필수 아미노산 용액</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>37°C로 따뜻하게; C 사용 전 수조에서</td></tr><tr><td>망막 뮬러 (rMC1) 세포</td><td>캘리포니아 대학, 샌디에고</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>37 &deg로 따뜻하게; C 사용 전 수조에 75</td></tr><tr><td>cm2 플라스크</td><td>BD Biosciences</td><td>B4-BE-353136</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>부분 표본 및 -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-134</td><td>Warm to 37 &deg; C 사용 전 수조에 있는</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td>37°C로 따뜻하게; C 사용 전 수조에</td></tr><tr><td>라미닌 마우스 단백질, 천연</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>부분 표본 및 -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>1X Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>37도까지 따뜻함; C 사용 전 수조에 Trypan</td></tr><tr><td>Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>165U Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96웰 플레이트, 투명 바닥, 검은색</td><td>Corning</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 투명 폴리스티렌 96웰 플레이트 미처리; 우물 모양: 둥근; 메 마른.</td><td>Costar</td><td>07-200-103</td><td></td></tr><tr><td>시소 로커</td><td>표준 실험실 필터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>표준 실험실 필터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중성 밀도 필터 용지(0.3)</td><td>THORLABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>442nm 대역통과 필터</td><td>THORLABS</td><td>FL441.6-10</td><td></td></tr><tr><td>550nm 대역통과 필터</td><td>THORLABS</td><td>FB550-10</td><td></td></tr><tr><td>670 nm 밴드패스 필터</td><td>THORLABS</td><td>FB670-10</td><td></td></tr><tr><td>810 nm 밴드패스 필터</td><td>THORLABS</td><td>FB810-10e</td><td></td></tr><tr><td>Unmounted &Oslash; 25 mm 흡수성 중립 밀도 필터 (0.1)</td><td>THORLABS</td><td>NE01B</td><td></td></tr><tr><td>Unmounted &Oslash; 25 mm 흡수성 중립 밀도 필터 (0.2)</td><td>THORLABS</td><td>NE02B</td><td></td></tr><tr><td>미장착 &Oslash; 25 mm 흡수력 중립 밀도 필터 (0.3)</td><td>THORLABS</td><td>NE03B</td><td></td></tr><tr><td>미장착 &Oslash; 25 mm 흡수성 중립 밀도 필터 (0.5)</td><td>THORLABS</td><td>NE05B</td><td></td></tr><tr><td>미장착 &Oslash; 25 mm 흡수성 중립 밀도 필터 (0.6)</td><td>THORLABS</td><td>NE06B</td><td></td></tr><tr><td>Unmounted &Oslash; 25mm 흡수성 중성 밀도 필터 (1.0)</td><td>THORLABS</td><td>NE10B</td><td></td></tr></tbody></table>

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법 체외

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

레이저 또는 발광 다이오드 (LED)에 의해 전달 레드 / 근적외선 요법 (R / NIR-LT)은, 아마도 산화 스트레스를 감소시킴으로써 생체 내에서 중추 신경계 손상, 범위의 기능적 형태 학적 결과를 개선시킨다. 그러나, 산화 스트레스에 R / NIR-LT의 효과는 파장 또는 조사의 강도에 따라 달라질 것으로 나타났다. 치료 매개 변수를 비교하는 연구로 인해 체외 최적화 연구에 넣어 통해 높은에 적합한 여러 파장이나 강도를 제공 상업적으로 사용 가능한 장치의 부재로, 부족하다. 이 프로토콜은 주어진 손상 모델에 필요한 치료 용량을 최적화하는 파장과 강도의 범위에서 빛의 전달을위한 기술을 설명한다. 우리는 파장 및 강도 파라미터를 쉽게 변경 될 수있는 빛을 전달하는 방법은, 활성 산소 종을 감소시키기위한 R / NIR-LT의 최적 투여 량의 결정을 용이하게 할 수 있다는 가설을 세웠다시험 관내 (ROS). 비 간섭 제논 라이트는 다양한 파장 (440, 550, 670의 중심 파장 및 810) 및 플루 언스 제공하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 (8.5 × 10 -3 3.8을 × 10 -1 J / cm 2) 빛의 배양 된 세포에. 장치에서 빛 출력은 각각의 파장에서 빛의 치료 관련, 동일한 계량 적 투여 량을 방출하도록 조정했다. 글루타메이트는 DCFH-DA 및 H 2 O 2에 민감한 형광 염료를 사용하여, 광 처리 된 세포 스트레스에 반응 종을 검출 하였다. 우리는 성공적으로 CNS 손상의 모델로 글루타민산 염에 노출 배양 된 세포에 관련 파장 및 강도 생리 및 치료의 범위에서 빛을 전달했다. 배양 된 세포에 의해 생성 된 ROS에 영향을주지 않았다 현재 연구에 사용 된 R / NIR-LT의 플루 언스 반면, 빛의 전달 방법은 다른 SYST에 적용 할 수있다EMS 더 중요한 생리 학적 또는 미토콘드리아 Organotypic 슬라이스 배양 모델을 포함한 절연 및 산화 대사의 결과 측정의 범위에 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다.

670nm의 파장에서 전달되는 빛의 출력은 이전에 생체 내 (0.3 J / cm 2) (20)에 유익한 것으로 도시 670nm 광의 도즈 포괄 플루 언스의 범위로 셀을 조사하기 위해 감광 필터를 사용하여 보정 하였다. 증가 된 광원의 앞에 중성 밀도 필터의 개수, 강도 (W / m 2) 이하 광 표적 영역에 전달할 수 있도록, 감소 하였다. 표 1은 파장 필터 장착 광원으로부터 발생 670nm 광의 교정 데이터를 제시하고, 광 출사에서 설명한 거리에서 사용 ND 필터의 개수 및 결과 생성 된 광의 강도를 포함한다. 플루 언스, 또는 670nm의 빛 (J / cm 2)의 용량은, 수학 식으로부터 계산 하였다 : 투여 량 (J / ㎠) = (광 강도 () m 2 / W / 10000) × 시간 (S)], 여기서, 치료 시간은 180s했다. <table border="0" cellpadding="...

Non-coherent Xenon light는 협대역 간섭 및 중성 밀도 필터를 통과하여 다양한 파장과 강도의 빛을 배양된 세포에 전달했습니다. 이 프로토콜은 적색/근적외선 요법이 in vitro 반응성 종의 생산에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었으며, 테스트된 매개변수를 사용하여 효과가 관찰되지 않았습니다.

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

다음 절차의 전반적인 목표는 적색 근적외선 요법의 다양한 파장과 강도가 체외에서 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 우리는 전달되는 파장과 강도를 조작할 수 있는 빛을 전달하는 새로운 방법을 개발했습니다. 금속 베이스의 하우징에 크세논 또는 광대역 광원을 장착한 다음 조명 앞에 코팅 렌즈, 정수 필터 및 입구 조리개를 배치합니다.절차의 다음 단계는 광대역 광원에서 생성된 빛을 입구, 조리개 및 액체 광 가이드를 통해 그리고 두 번째 코팅 렌즈를 통해 안내하는 것입니다. 그런 다음 대역폭과 중성 밀도 필터를 장착하여 원하는 빛의 파장과 강도를 얻습니다. 이 필터는 파장대(waveband)라고 하는 좁은 범위의 파장을 통과시킬 수 있습니다.LED 또는 레이저와 같은 기존 적색 근적외선 요법 전달 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 파장 및 강도 매개변수에 대해 정확하고 보정된 조작이 가능하다는 것입니다. 이를 통해 현재 연구에서 분리된 세포와 같은 최상의 생물학적 결과를 위해 광 전달을 최적화할 수 있습니다. 또한, organotypic, neurotrauma 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.Bright broadband 광원으로 작업할 때는 영구적인 시각적 손상을 초래할 수 있으므로 광원을 직접 쳐다보지 마십시오. 광 전달 장치를 준비하려면 크세논 또는 텅스텐과 같은 광대역 광원을 연결하십시오.amp 적절한 전원 공급 장치에 연결합니다. 광원 앞에 대조 렌즈를 배치하여 대조된 광선을 생성합니다.액체 열 필터를 통해 빛을 통과시켜 광선에서 대부분의 열을 제거합니다. 광원 앞에 대조 렌즈를 배치하여 대조된 광선을 생성합니다. 액체 열 필터를 통해 빛을 통과시켜 광선에서 대부분의 열을 제거합니다.응용 분야에 따라 대조된 빔을 liquid light guide의 입구 관절에 초점을 맞추어 빛을 보다 유연하게 전달할 수 있습니다. liquid light guide의 다른 쪽 끝에는 두 번째 코팅 렌즈를 배치한 다음 간섭 및 중성 밀도 필터용 홀더를 배치합니다. 이 배열은 원하는 파장대와 강도의 균일하게 조명된 광점을 생성해야 합니다.Light Guide의 끝과 시편 평면 사이의 거리는 조명을 비춰야 하는 영역에 따라 달라야 할 수 있습니다. 역 제곱 법칙에 따라 라이트 가이드의 끝에서 거리가 증가함에 따라 본 연구에서 광도가 감소한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 거리는 14cm이며, 이로 인해 96웰 조직 배양 플레이트에서 3x3 웰 영역을 균일하게 비추는 빔 단면이 생성됩니다.램프에서 나오는 미광과 관련 광학 부품이 다른 표본에 도달할 수 없도록 합니다(예: 검은색 판지 사용). 장치가 구성되면 액체 열 필터의 물 냉각기를 켜고 필터 재킷을 통해 물이 교환되는지 확인합니다. 램프를 켜십시오.amp 전원을 켜고 광대역 광원을 위해 최소 5분 동안 기다립니다.안정화하려면 협대역 간섭 필터를 선택하여 원하는 조명 파장대를 생성합니다. 표본이 배치될 평면에서 램프에 의해 생성된 빛을 측정합니다. 치료 중.빛은 적절한 스펙트럼에 연결된 보정된 방사 조도 프로브를 사용하여 측정됩니다. 라디오미터. 원하는 출력을 얻을 때까지 중성 밀도 필터를 사용하여 빛의 강도를 조정합니다. 본 연구에서는 각 간섭 필터에 의해 통과되는 빛의 강도를 조정하여 4개의 처리 파장 대역 각각에서 동일한 품질 출력을 제공합니다.설명된 적색 근적외선 광 요법 전달 방법은 모든 세포 유형 또는 체외 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 갈색세포종 또는 PC 12 세포를 사용하여 세포에 빛을 전달하는 기술을 보여줍니다. 예를 들어, 성장 배지에서 세포를 배양합니다.96 년에, 웰 트레이는 70-80 % 합류 할 때까지 폴리올 라이신으로 코팅되었습니다. 완전 성장 배양 배지에서 원하는 농도의 글루타메이트 또는 대체 스트레스 요인을 준비합니다. 여기서는 10 밀리몰 글루타메이트를 사용합니다.세포에서 배지를 제거하고 인산염 완충액 식염수로 세 번 부드럽게 씻습니다. 세척 후, 글루타메이트 함유 매체를 웰 당 100 마이크로 리터의 총 부피에 첨가하십시오. 글루타메이트 또는 선택한 스트레스 요인을 첨가하는 즉시 준비된 광 전달 장치 아래에 배양 플레이트를 배치하여 원하는 파장과 강도로 세포를 광 처리에 노출시킵니다.확립된 neutral density filters의 조합을 사용하여 광선의 qual output을 변경해야 합니다. 투여되는 파장에 따라 다릅니다. 광선 처리가 완료된 후 세포를 평평한 표면에 놓고 이산화탄소가 조절되는 조건에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.적색 근적외선 요법을 추가로 투여할 수도 있습니다. 마지막 광선 처리를 수행하기 전에 산화 스트레스의 지표로서 활성 산소 종을 검출하는 데 사용할 시약을 준비합니다. 여기서 우리는 dilu, fluorescein D acetate를 포함한 다양한 반응성 종과 반응할 때 형광을 발하고, 4단계에서 설명한 대로 세포에 광 처리를 제공하고, 세포가 원하는 flus 및 빛의 파장으로 처리되고 있는지 확인하는 표시된 식단을 사용합니다.광선 치료 직후, 글루타메이트 함유 매체를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 반응성 종과 반응할 때 형광을 발하는 지표 염료를 사용하여 분석을 진행합니다. 지표 염료에 의해 생성된 형광을 적절한 excitation 및 emission 설정으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 측정합니다.color of metric kit를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 웰의 단백질 농도를 정량화합니다. 각 개별 웰의 단백질 농도를 기준으로 형광 출력을 표현한 다음 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 이 기술의 개발은 산화 스트레스에 대한 적색 근적외선 요법의 다중 파장 및 강도를 조사하는 연구자들에게 길을 열어줍니다.이 기술은 분리된 세포 또는 유기형 배양을 포함하는 일련의 모델 시스템에 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

이 동영상은 생물학적 샘플의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석을 보여줍니다.

인간 혈청의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질 분석

이 동영상은 박테리아 균주의 산화 스트레스 반응을 평가하기 위해 맞춤화된 스폿 플레이트 분석을 보여줍니다. 일부 균주는 항산화 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 생성합니다. 반대로, 시험제로 처리되어 피오멜라닌 생산이 감소한 균주는 산화 스트레스에 대한 민감성이 증가하여 피오멜라닌 생성 균주에 비해 세포 생존력이 감소합니다.

박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

방사선에 대한 피부 반응의 정량적 광학 바이오마커를 제공하는 확산 광학 분광법(DOS) 접근법을 제시합니다. DOS 기기 설계, 광학 매개변수 추출 알고리즘 및 방사선 유발 홍반의 전임상 마우스 모델에서 대표 데이터를 생성하는 데 필요한 동물 취급 절차에 대해 설명합니다.

마우스 모델을 사용하여 급성 이온화 방사선 유발 피부 독성의 정량적 평가를위한 광학 분광학 확산

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석체를 이용한 생물학적 시료의 산화 스트레스 평가

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

산화된 글루타치온과 환원된 형태의 글루타치온(각각 GSSG 및 GSH)의 정량화는 오르토프탈알데히드(OPA)를 사용하여 달성되었습니다. OPA는 GSH에 접합되면 고농도 형광성이 되지만 감소될 때까지 GSSG를 접합할 수 없습니다. 여기에서는 정규화를 위해 단백질 정량을 사용하여 두 가지를 모두 정량화하는 다중 파라메트릭 분석에 대해 설명합니다.

In vitro에서 배양된 포유류 세포에서 ortho -phthaldehyde를 사용한 산화 및 환원 형태의 글루타치온의 신속한 정량화

배우세요 적색/근적외선 광치료가 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가하는 방법을 체외 배양 세포에서. 이 기술은 파장과 강도를 정밀하게 조절하여 광치료의 생물학적 효과를 연구합니다.

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