파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법 체외

다음 절차의 전반적인 목표는 적색 근적외선 요법의 다양한 파장과 강도가 체외에서 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 우리는 전달되는 파장과 강도를 조작할 수 있는 빛을 전달하는 새로운 방법을 개발했습니다. 금속 베이스의 하우징에 크세논 또는 광대역 광원을 장착한 다음 조명 앞에 코팅 렌즈, 정수 필터 및 입구 조리개를 배치합니다.

절차의 다음 단계는 광대역 광원에서 생성된 빛을 입구, 조리개 및 액체 광 가이드를 통해 그리고 두 번째 코팅 렌즈를 통해 안내하는 것입니다. 그런 다음 대역폭과 중성 밀도 필터를 장착하여 원하는 빛의 파장과 강도를 얻습니다. 이 필터는 파장대(waveband)라고 하는 좁은 범위의 파장을 통과시킬 수 있습니다.

LED 또는 레이저와 같은 기존 적색 근적외선 요법 전달 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 파장 및 강도 매개변수에 대해 정확하고 보정된 조작이 가능하다는 것입니다. 이를 통해 현재 연구에서 분리된 세포와 같은 최상의 생물학적 결과를 위해 광 전달을 최적화할 수 있습니다. 또한, organotypic, neurotrauma 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

Bright broadband 광원으로 작업할 때는 영구적인 시각적 손상을 초래할 수 있으므로 광원을 직접 쳐다보지 마십시오. 광 전달 장치를 준비하려면 크세논 또는 텅스텐과 같은 광대역 광원을 연결하십시오.amp 적절한 전원 공급 장치에 연결합니다. 광원 앞에 대조 렌즈를 배치하여 대조된 광선을 생성합니다.

액체 열 필터를 통해 빛을 통과시켜 광선에서 대부분의 열을 제거합니다. 광원 앞에 대조 렌즈를 배치하여 대조된 광선을 생성합니다. 액체 열 필터를 통해 빛을 통과시켜 광선에서 대부분의 열을 제거합니다.

응용 분야에 따라 대조된 빔을 liquid light guide의 입구 관절에 초점을 맞추어 빛을 보다 유연하게 전달할 수 있습니다. liquid light guide의 다른 쪽 끝에는 두 번째 코팅 렌즈를 배치한 다음 간섭 및 중성 밀도 필터용 홀더를 배치합니다. 이 배열은 원하는 파장대와 강도의 균일하게 조명된 광점을 생성해야 합니다.

Light Guide의 끝과 시편 평면 사이의 거리는 조명을 비춰야 하는 영역에 따라 달라야 할 수 있습니다. 역 제곱 법칙에 따라 라이트 가이드의 끝에서 거리가 증가함에 따라 본 연구에서 광도가 감소한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 거리는 14cm이며, 이로 인해 96웰 조직 배양 플레이트에서 3x3 웰 영역을 균일하게 비추는 빔 단면이 생성됩니다.

램프에서 나오는 미광과 관련 광학 부품이 다른 표본에 도달할 수 없도록 합니다(예: 검은색 판지 사용). 장치가 구성되면 액체 열 필터의 물 냉각기를 켜고 필터 재킷을 통해 물이 교환되는지 확인합니다. 램프를 켜십시오.amp 전원을 켜고 광대역 광원을 위해 최소 5분 동안 기다립니다.

안정화하려면 협대역 간섭 필터를 선택하여 원하는 조명 파장대를 생성합니다. 표본이 배치될 평면에서 램프에 의해 생성된 빛을 측정합니다. 치료 중.

빛은 적절한 스펙트럼에 연결된 보정된 방사 조도 프로브를 사용하여 측정됩니다. 라디오미터. 원하는 출력을 얻을 때까지 중성 밀도 필터를 사용하여 빛의 강도를 조정합니다. 본 연구에서는 각 간섭 필터에 의해 통과되는 빛의 강도를 조정하여 4개의 처리 파장 대역 각각에서 동일한 품질 출력을 제공합니다.

설명된 적색 근적외선 광 요법 전달 방법은 모든 세포 유형 또는 체외 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 갈색세포종 또는 PC 12 세포를 사용하여 세포에 빛을 전달하는 기술을 보여줍니다. 예를 들어, 성장 배지에서 세포를 배양합니다.

96 년에, 웰 트레이는 70-80 % 합류 할 때까지 폴리올 라이신으로 코팅되었습니다. 완전 성장 배양 배지에서 원하는 농도의 글루타메이트 또는 대체 스트레스 요인을 준비합니다. 여기서는 10 밀리몰 글루타메이트를 사용합니다.

세포에서 배지를 제거하고 인산염 완충액 식염수로 세 번 부드럽게 씻습니다. 세척 후, 글루타메이트 함유 매체를 웰 당 100 마이크로 리터의 총 부피에 첨가하십시오. 글루타메이트 또는 선택한 스트레스 요인을 첨가하는 즉시 준비된 광 전달 장치 아래에 배양 플레이트를 배치하여 원하는 파장과 강도로 세포를 광 처리에 노출시킵니다.

확립된 neutral density filters의 조합을 사용하여 광선의 qual output을 변경해야 합니다. 투여되는 파장에 따라 다릅니다. 광선 처리가 완료된 후 세포를 평평한 표면에 놓고 이산화탄소가 조절되는 조건에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

적색 근적외선 요법을 추가로 투여할 수도 있습니다. 마지막 광선 처리를 수행하기 전에 산화 스트레스의 지표로서 활성 산소 종을 검출하는 데 사용할 시약을 준비합니다. 여기서 우리는 dilu, fluorescein D acetate를 포함한 다양한 반응성 종과 반응할 때 형광을 발하고, 4단계에서 설명한 대로 세포에 광 처리를 제공하고, 세포가 원하는 flus 및 빛의 파장으로 처리되고 있는지 확인하는 표시된 식단을 사용합니다.

광선 치료 직후, 글루타메이트 함유 매체를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 반응성 종과 반응할 때 형광을 발하는 지표 염료를 사용하여 분석을 진행합니다. 지표 염료에 의해 생성된 형광을 적절한 excitation 및 emission 설정으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 측정합니다.

color of metric kit를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 웰의 단백질 농도를 정량화합니다. 각 개별 웰의 단백질 농도를 기준으로 형광 출력을 표현한 다음 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 이 기술의 개발은 산화 스트레스에 대한 적색 근적외선 요법의 다중 파장 및 강도를 조사하는 연구자들에게 길을 열어줍니다.

이 기술은 분리된 세포 또는 유기형 배양을 포함하는 일련의 모델 시스템에 사용될 수 있습니다.