Name: 회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 지속적 공급 기반 영양 조절 기술을 이용한 포유류 세포 대량 배양 방법을. 교반형 생물반응기에서 간헐적 배치 공급보다 성장률이 향상되어 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 도움이 되는 의견을 제시해 준 Michael Garwood와 Sam Stein, 그리고 원고 준비를 도와준 Kristen M. Maynard에게 감사를 표합니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

(58) - 생물학적 제제와 세포 치료에 대한 생산을위한 포유 동물 세포의 제품을 생성하는 대규모 (55)의 문화와 포유 동물 세포의 모니터링이 필요합니다. 또한,이 응용 프로그램은 정의되고 검증 된 배양 조건을 요구. 단순히 이러한 요건을 모두 만족하지 조사 기술을 사용하여 세포의 양을 증가시킨다. 영양분과 노폐물의 축적에 변동을 일으키는 설명서 매체의 변화는 세포의 품질, 생존 능력과 생산량을 줄일 수 있습니다. 생물 반응기의 사용은 잘 바이오 약학 애플리케이션 미생물 배양에 상용 확립 및 유사한 전략은 포유 동물 세포 배양에 적용 하였다. 환경과 포유 동물 세포의 복잡한 상호 작용은 세포의 확장 가능성을 최적화하기 위해 영양소 수준을 조절하는 특정 변경을 필요로한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 straightfo 개발rward 방법은 가변 레이트 관류 공급기구와 교반 된 현탁액 생물 반응기에서 생리적 ...

이식 가능한 기능적 인간 세포의 다수를 생성하기 위해, 배양 조건의 조절이 필수적이다. 3 - 신진 대사 폐기물의 축적과 함께 영양분의 고갈은 셀 제품 1의 품질이 저하 노화 및 대사 변화에 중요한 기여한다. 이 절차는 배양 기간에 걸쳐 생리 학적 범위 4 글루코스를 조절하는 조절 된 속도로 관류 공급 시스템과 결합 교반 생물 반응기를 사용 타원체의 포유 동물 세포 배양하는 방법을 보여준다. 이 연구의 목적은 생리적 인 범위는 100 내지 200 밀리그램 / DL로 정의 하였다. 동일한 방법이 다른 영양소 및 락 테이트 대사 폐기물을 조절하기 위해 사용될 수있다. 작은 볼륨의 정적 문화 (1-30 ml)을 일반적으로 experime에 대한 세포 라인을 유지하고 차별화하는 실험실 환경에서 사용되는ntal 목적. 세포 계대는 정기적으로 필요한 완전 배지 변경과 함께 수행된다. 대부분의 &quot;기존의&quot;문화 매체는 영양 제한의 위험없이 덜 자주 매체 변경을 허용하는 높은 포도당 농도 (이 연구에 사용 된 DMEM 450 밀리그램 / DL)가 있습니다. 그러나,이 배치 급지에있어서 여전히 빈번한 조작을 필요로하는 세포의 환경에서 변화를 도입하고, 5 오염의 위험이 증가한다 - 9. 교반 정지 생물 반응기는 (SSB)는 더 나은 혼합을 제공하고 3,10 취급 감소 - 20 만, 정적 문화처럼, 영양 및 폐기물 제품 수준의 잠재적 인 손상 변동에 기여 설명서 매체의 변화가 필요합니다. SSB 문화의 관류 공급 연속 주입 및 매체의 제거,하지만 인해 세포 성장에 영양 수준에서 큰 변화로 이러한 문제가 문제가 남아 줄일 수 있습니다. 조정 된 공급 라의 사용예상 셀 요구 사항에 따라 영양소 사용량 계산에서 TE는 세포 생존을 최적화하는데 필요한 안정적인 셀 환경을 제공하고, 21 작용할 수 - 24. 25 구체적으로 만능 세포의 배양 및 확장을위한 포유 동물 세포의 확장 SSB 문화에 대한 방법을 설명하는 문학의 큰 몸이있다 - 다른 사람과 (32), 섬 (베타) 세포 17,33,34에 초점을 맞춘이, 또는 생물 의약품 24의 생산, 35-38. 이러한 연구 세포 종류의 많은 구형 배양에서 성장 될 수 있고, 사용되는 세포 유형에 대한 구체적인 절차는 연속 공급 시스템을 구현하기 이전에 최적화되어야한다. 43 -이 예제에서, 관류 공급 방법은 교반 생물 반응기 (39) 회전 타원체로 성장 베타 세포주를 확장 하였다. 본원에 기재된 방법을 제공한다타겟 배양 조건을 달성하기 위해 오프라인 혈당 측정에 기초하여 조정 레이트 공급의 간단한 구현. 이 방법으로 공급 속도를 조절하는 생리적 포도당 수준이 증가 세포 수율에 표시됩니다 유지합니다. 포유 동물 세포는 에너지 생산을 위해 중요한 영양소, 포도당에 의존하므로,이 세포주의 사용은 많은 포유류 배양 세포 (44)의 모델을 나타낸다. 또한,이 라인은 포도당 45 만성 높은 수준에 민감한 베타 세포의 추가의 복잡성을 예시한다. 본 연구를 위해, β-TC6 세포는 생체 내에서 랑게르한스섬의 평균 크기는 대략 배양 타원체를 형성시켰다. 관류 생물 반응기 시스템 (17) - 소비 포도당 조정 된 공급 속도와 19,21,46은, 생존의 변화없이 생리 학적 조건과 높은 셀 수율을 유지하는 결과.

<table><tbody><tr><td>&#946; TC-6 세포</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>마우스 인슐린종 세포주(부착 세포 유형)</td></tr><tr><td>DPBS No Ca, No Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>제품 번호는 아래를 참조하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose (500 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM 저혈당 (100 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (이 매체는 이미 피루브산을 포함하고 있음)</a></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Porcine Serum</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 조직 배양 처리 플라스크</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825</td><td>(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>NuAire 세포 배양 인큐베이터</td><td>프린스턴, 미네소타</td><td></td><td>미국 자동 흐름. 모든 워터 재킷 CO2 조절 세포 배양 인큐베이터를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td>Sorvall RT 7 (유사한 탁상용 원심분리기를 사용할 수 있음)</td></tr><tr><td>냉장고</td><td></td><td></td><td>모든 실험실 냉장고를 사용할 수 있습니다(이 연구에는 작은 탁상용 버전이 사용됨)</td></tr><tr><td>1 L Glass Bottle</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-1L</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>2 L 유리병</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-2L</td><td>어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>250 ml 교반 생물반응기를 사용할 수 있습니다&nbsp;</td><td>코닝, 코닝, NY</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(생명과학) & categoryname=</td></tr><tr><td>젓는 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-496-104A</td><td>어떤 인큐베이터든지 안전한 젓는 접시를 사용할 수 있으며, 어떤 공급업체든지</td></tr><tr><td>조직 배양 접시 100 mm 지름</td><td>Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다 (Fisher Sci를 통해 주문).</td></tr><tr><td>FALCON 50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon, San Jose, CA</td><td>1256598</td><td>모든 공급 업체가 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Delran 플라스틱 사용자 정의 부품에 사용</td><td>McMaster Carr</td><td>Various</td><td>원하는 모든 재료를 사용할 수 있지만 Deran은 오토 클레이브 안전하고 반응성이 없으며 기계 가공이 쉽기 때문에 선택됩니다.</td></tr><tr><td>http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac 맞춤형 뚜껑 용 스테인레스 스틸 파이프</td><td>McMaster Carr</td><td>Various</td><td>모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>연속 공급을 위한 맞춤형 수정 Delran Bioreactor 뚜껑</td><td>맞춤형 유사한 제품을 생산하는 공급업체를 인식하지 못</td><td>함</td><td></td></tr><tr><td>연속 공급을 위한 맞춤형 수정 유리병 뚜껑</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>일부 공급업체(<예: , Fischer Sci, Corning)> 아래 링크에서 유사한 제품을 만듭니다.</td></tr><tr><td>Masterflex 디지털 연동 펌프</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>모든 정밀 연동 펌프를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>PVDF 튜빙 커넥터 (다양한)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>링크 참조</td><td>모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>Pharmed BPT 튜빙 L/S 16</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>Pharmed BPT 튜빙 L/S 14</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-14</td><td>어떤 공급업체든 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 13</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-13</td><td>어떤 공급업체든 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Millipore Millex GP PES 멤브레인 0.22 &#181; l 멸균 주사기 필터 (환기 및 매체 여과에 사용)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td>모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>25 ml 눈금이 매겨진 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td>모든 공급 업체를 사용할 수 있으며 다양한 크기를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>모든 공급 업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>혈구 측정기</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td>모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>One Touch Ultra Blood Glucose</td><td>Meter Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>어떤 공급업체나 유사한 제품도 사용할 수 있습니다 (예: , Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다(예: 예: , Bayer).</td></tr></tbody></table>

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

이 시연에서는 β-TC6 인슐리종 세포주에서 형성된 스페로이드를 포유류 섬 세포 제품 제조 모델로 배양하여 영양소 수준을 조절하면 세포 수율을 향상시킬 수 있는 방법을 보여주었습니다. 이전 연구에서 생물반응기는 정적 배양에 비해 배양량 증가를 촉진했지만 세포 수율의 증가는 관찰되지 않았습니다. 배치 수유 사이에 소비된 포도당과 같은 주요 영양소의 제한은 세포 증식의 제한으로 이어질 수 있습니다. 포도당 수치의 큰 변동은 매체에서 포도당 농도의 증가에도 불구하고 관찰되었습니다. 연속 공급 시스템을 사용하면 포도당 수치의 변동이 제거되고 배치 공급 정적 및 SSB 배양 방법과 비교할 때 세포 성장률이 향상되었습니다. 계산된 영양소 소비량에 따라 사료 비율을 조정함으로써 성장률의 추가 증가가 관찰되었으며, 이를 통해 배양에서 3주 동안 생리적 포도당을 유지할 수 있었습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

중간 포도당 수준 및 변동 표준 SSB 문화의 세포 확장을 제한 포도당 수준은 배양 기간 3를 통해 정적 문화와 SSB 문화에 변동. 이러한 변동은 21 일의 배양 기간 동안 세포 수의 증가와 함께 강화하고 정적 배양 SSB 모두에서 거의 동일 하였다. 이러한 관찰은 이전 발행 3에 제시되어있다. 포도당 수준은 두 가지 방법의 배양 기간의 기간 동안 슈퍼 생리가 될 수 있습니다. 이 만성 노출은 세포 성장 억제 (54)가 있기 때문에, 연속 공급 시스템은 혈당 변동을 제거하고 구형의 배양 동안 영양소 제어를 개선하기 위해 개발되었다. 회전 타원체 문화에 대한 지속적인 먹이 시스템 지속적으로 새로운 배지를 추가하고 배양 기간 동안 오래된 매체를 제거단순 배지...

지속적인 성장 조절 공급을 사용한 영양소 조절은 교반 현탁 생물 반응기에서 배양에 대한 간헐적 배치 공급에 비해 포유류 세포 스페로이드의 성장 속도를 향상시킵니다. 이 연구는 간단한 조정된 비율 공급 배양을 설정하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

이 과정의 전반적인 목표는 통제된 영양 조건에서 많은 수의 세포를 배양하는 것입니다. 세포 배양 실험실에서 볼 수 있는 기존 장비를 사용합니다. 관련 알고리즘을 통해 실험 범위 내에서 영양소를 제어하고 조작할 수 있습니다.이 방법은 대규모 세포 배양 응용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인간 세포 치료와 같은. 이 기술의 주요 장점은 영양소와 가스의 균일 한 분포로 대규모로 세포를 배양한다는 것입니다.이를 통해 정적 또는 벌크 공급 세포 배양보다 더 높은 세포 밀도를 허용하고 수율을 높이며 세포 손실을 줄일 수 있습니다. 이는 대부분의 세포 배양 실험실에서 흔히 볼 수 있는 장비로 수행할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 무균 조건에서 특정 순서로 수행해야 하는 많은 단계로 인해 사용되는 이러한 기술을 마스터하기 어려울 수 있으므로 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있습니다.공급 시스템에 필요한 5가지 주요 구성 요소를 수집합니다. 매체 저장소, 연동 펌프, 교반 생물 반응기, 폐기물 저장소 및 맞춤형으로 설계된 튜브 샘플링 세트. 1리터 유리병을 사용하여 중간 저장소를 설정합니다.2리터 유리병을 사용한 쓰레기 저장고. 250mL 부피의 유리 반응기를 사용하여 교반된 생물반응기. 디지털 연동 펌프 또는 8채널 펌프 헤드가 있는 유사한 펌프를 사용하여 매체 교환을 제어합니다.저장소와 변형된 생물반응기 뚜껑을 단단하고 오토클레이브 가능한 플라스틱으로 조립합니다. 스테인리스 스틸 파이프 통과 포트가 있어 멸균 필터를 통해 환기를 제공하고 저장소와 생물반응기 사이의 매체 전달을 허용합니다. 다공성 유리 폭기 튜브로 제작된 유출 튜브를 변형된 교반 현탁액 생물반응기 뚜껑에 부착합니다.폴리비닐리덴 플루오라이드 튜빙 커넥터와 내구성 있는 연동 펌프 튜빙으로 오토클레이브 가능한 관류 튜빙 세트를 조립합니다. 단면의 길이는 서로 다른 구성 요소 사이의 거리에 따라 달라집니다. 두 개의 튜빙 직경을 사용하여 공급 라인을 조립합니다.생물 반응기에서 매체 저장소까지의 거리에 걸쳐 있는 기본 튜브에 L/S 14를 사용합니다. 적절한 PVDF 어댑터를 사용하여 펌프 섹션의 튜브 길이 중간에 L/S 13 튜빙의 정렬 길이를 삽입합니다. 표준 PVDF 호스 철조망 튜빙 어댑터를 사용하여 더 짧은 펌프 섹션 튜빙의 양쪽에 있는 두 개의 L/S 14 튜빙을 결합합니다.더 큰 직경의 L/S 16 튜빙을 사용하여 폐기물 제거를 위한 섹션 튜빙 섹션을 조립하고 펌핑 섹션을 위해 중간에 L/S 14 튜빙의 짧은 섹션을 삽입합니다. 이는 PVDF 호스 철조망 어댑터를 사용하는 공급 라인 어셈블리와 동일한 방식으로 수행됩니다. 3개의 짧은 L/S 14 튜빙 길이로 세트를 구성하여 튜빙 세트의 최종 구성 요소를 조립합니다.T형 HVDF 커넥터와 함께 연결되고 두 개의 튜빙 길이에 두 개의 작은 호스 클램프가 있습니다. 샘플 어셈블리를 스테인리스 스틸 샘플에 연결amp생물반응기의 뚜껑에 부착된 커넥터. 멸균 후 가스 배출을 위해 멸균 가스 필터가 클램프 길이 중 하나로 부착됩니다.다른 하나는 멸균 샘플링 주사기에 연결하는 데 사용됩니다. 샘플링 어셈블리가 생물반응기에 연결되어 있는 동안 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실험을 시작하기 전에 오토클레이브합니다. 이 어셈블리를 사용하여 연속 공급 공정을 방해하지 않고 필요에 따라 바이오리액터에서 멸균 샘플을 수집할 수 있습니다.멸균 통풍구를 스피너 플라스크 뚜껑의 적절한 위치, 매체 용기, 폐기물 용기 및 시료 포트에 부착합니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 배양하고 수확합니다. 세포를 생물 안전성 캐비닛에서 2-3분 동안 트립신의 실온에서 배양한 다음 원뿔형 튜브에 모읍니다.그런 다음 스몰 셀 샘플을 채취하여 트리판 블루로 염색합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 현미경과 트리판 블루 염색이 가능한 표준 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다. 각 조건에 대해 원하는 수의 총 세포를 멸균 교반 현탁 생물반응기에 추가합니다.피펫을 사용하여 교반된 현탁 생물반응기에 배지를 추가하여 원하는 총 배양 부피에 도달합니다. 세포가 있는 교반된 현탁액 바이오리액터를 세포 배양 인큐베이터 내부의 교반 플레이트로 이동합니다. 섭씨 37도에서 3일 동안 먹이를 주지 않고 생물반응기에서 세포를 배양하며, 이산화탄소는 5%, 상대 습도는 100%, 교반 속도 70rpm으로 하여 스페로이드가 형성될 수 있도록 합니다.스페로이드 형성 후 인큐베이터에서 교반된 현탁액 생물반응기를 제거합니다. 연속 공급 시스템용 구성 요소를 생물 안전 캐비닛에 조립합니다. 먼저 새로운 배지 저장소에 원하는 배양 배지를 채운 다음 공급 라인의 한쪽에 연결합니다.또한 신선한 매체 저장소가 멸균 필터로 적절하게 환기되는지 확인하십시오. 생물반응기 입구 포트에서 멸균 필터를 교체하여 배지가 생물반응기로 들어가기 전에 여과해야 합니다. 폐기물 라인을 매체 폐기물 저장통에 연결하고 폐기물 저장고가 멸균 필터로 적절하게 환기되는지 확인하십시오.교반된 현탁액 바이오리액터를 스페로이드 형성과 동일한 배양 파라미터를 사용하여 인큐베이터 내부의 교반 플레이트에 넣습니다. 신선한 중간 통을 가까운 미니 냉장고에 넣으십시오. 공급 라인이 문이 닫히는 것을 방해하지 않고 냉장고에서 나올 수 있는지 확인하십시오.또한 공급 라인이 냉장고나 인큐베이터의 문에 의해 조여져 닫히지 않는 것이 중요합니다. 폐기물 매체 저장소는 인큐베이터 외부의 벤치 상단에 편리한 위치에 놓을 수 있습니다. 나머지 튜브 끝을 인큐베이터에 통과시키고 공급 라인을 생물 반응기의 입구 포트에있는 필터에 연결합니다.그런 다음 폐기물 라인을 유출 튜브 포트에 연결합니다. 그런 다음 공급 및 폐기물 라인의 펌프 섹션을 펌프 헤드에 배치하여 공급 라인이 신선한 매체 저장소에서 교반 현탁 생물반응기로 매체를 펌핑하고 폐기물 라인이 생물 반응기에서 폐기물 매체 저장소로 매체를 펌핑하도록 적절한 방향을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조정된 공급 속도 방정식을 사용하여 공급 속도를 계산합니다.성장 속도 예측 및 중간 포도당 측정과 함께 세포 수 정보가 포함된 최신 샘플을 사용하여 배양에서 원하는 포도당 농도를 유지하는 데 필요한 공급 속도를 추정합니다. 계산된 이송 속도에 따라 펌프 속도를 설정합니다. 이송 속도 계산을 반복하고 각 샘플링 포인트에 대한 펌프 속도를 조정합니다.중간 포도당 측정은 정적 교반 현탁 생물반응기를 사용한 Beta-TC6 insulinoma 스페로이드 배양에서 표시되며, 연속적으로 공급된 교반 현탁 생물반응기 배양 방법입니다. 표준 고포도당 배지로 공급합니다. 지속적인 공급은 포도당 변동을 제거할 수 있지만 배지의 평균 포도당 수치는 배양 기간 동안 급격히 변하고 생리학적 범위를 훨씬 초과합니다.조정된 공급은 변동을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 배양 기간 동안 포도당 농도를 생리학적 수준에 가깝게 유지할 수 있습니다. 여기서, 21일 배양 기간 동안 세포 수의 접힘 변화로 보고된 세포 성장은 규칙적인 배지 변화, 일정한 공급 속도, 교반 현탁 생물반응기 배양 및 조정된 공급 속도, 교반 현탁 생물반응기 배양을 가진 교반 현탁 생물반응기와 비교됩니다. 이 절차에 따라 새로운 세포주에 대한 영양 요구 사항 또는 특정 실험 결과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 다양한 조건 cam과 같은 다른 방법이 준비됩니다.개발 후, 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 암이나 다른 질환을 앓고 있는 인간의 세포에서 필요한 대사 요구 사항을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양 조건을 더 잘 제어하고 세포 수율을 극대화하기 위해 풍부한 세포 배양 시스템을 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 혈액 매개 병원체로부터 보호하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

nutrient-regulation-continuous-feeding-for-large-scale-expansion

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

배우세요 지속적 공급 기반 영양 조절 기술을 이용한 포유류 세포 대량 배양 방법을. 교반형 생물반응기에서 간헐적 배치 공급보다 성장률이 향상되어 세포 치료제 개발에 활용됩니다.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

더 많은 동영상 탐색