회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

이 과정의 전반적인 목표는 통제된 영양 조건에서 많은 수의 세포를 배양하는 것입니다. 세포 배양 실험실에서 볼 수 있는 기존 장비를 사용합니다. 관련 알고리즘을 통해 실험 범위 내에서 영양소를 제어하고 조작할 수 있습니다.

이 방법은 대규모 세포 배양 응용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인간 세포 치료와 같은. 이 기술의 주요 장점은 영양소와 가스의 균일 한 분포로 대규모로 세포를 배양한다는 것입니다.

이를 통해 정적 또는 벌크 공급 세포 배양보다 더 높은 세포 밀도를 허용하고 수율을 높이며 세포 손실을 줄일 수 있습니다. 이는 대부분의 세포 배양 실험실에서 흔히 볼 수 있는 장비로 수행할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 무균 조건에서 특정 순서로 수행해야 하는 많은 단계로 인해 사용되는 이러한 기술을 마스터하기 어려울 수 있으므로 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있습니다.

공급 시스템에 필요한 5가지 주요 구성 요소를 수집합니다. 매체 저장소, 연동 펌프, 교반 생물 반응기, 폐기물 저장소 및 맞춤형으로 설계된 튜브 샘플링 세트. 1리터 유리병을 사용하여 중간 저장소를 설정합니다.

2리터 유리병을 사용한 쓰레기 저장고. 250mL 부피의 유리 반응기를 사용하여 교반된 생물반응기. 디지털 연동 펌프 또는 8채널 펌프 헤드가 있는 유사한 펌프를 사용하여 매체 교환을 제어합니다.

저장소와 변형된 생물반응기 뚜껑을 단단하고 오토클레이브 가능한 플라스틱으로 조립합니다. 스테인리스 스틸 파이프 통과 포트가 있어 멸균 필터를 통해 환기를 제공하고 저장소와 생물반응기 사이의 매체 전달을 허용합니다. 다공성 유리 폭기 튜브로 제작된 유출 튜브를 변형된 교반 현탁액 생물반응기 뚜껑에 부착합니다.

폴리비닐리덴 플루오라이드 튜빙 커넥터와 내구성 있는 연동 펌프 튜빙으로 오토클레이브 가능한 관류 튜빙 세트를 조립합니다. 단면의 길이는 서로 다른 구성 요소 사이의 거리에 따라 달라집니다. 두 개의 튜빙 직경을 사용하여 공급 라인을 조립합니다.

생물 반응기에서 매체 저장소까지의 거리에 걸쳐 있는 기본 튜브에 L/S 14를 사용합니다. 적절한 PVDF 어댑터를 사용하여 펌프 섹션의 튜브 길이 중간에 L/S 13 튜빙의 정렬 길이를 삽입합니다. 표준 PVDF 호스 철조망 튜빙 어댑터를 사용하여 더 짧은 펌프 섹션 튜빙의 양쪽에 있는 두 개의 L/S 14 튜빙을 결합합니다.

더 큰 직경의 L/S 16 튜빙을 사용하여 폐기물 제거를 위한 섹션 튜빙 섹션을 조립하고 펌핑 섹션을 위해 중간에 L/S 14 튜빙의 짧은 섹션을 삽입합니다. 이는 PVDF 호스 철조망 어댑터를 사용하는 공급 라인 어셈블리와 동일한 방식으로 수행됩니다. 3개의 짧은 L/S 14 튜빙 길이로 세트를 구성하여 튜빙 세트의 최종 구성 요소를 조립합니다.

T형 HVDF 커넥터와 함께 연결되고 두 개의 튜빙 길이에 두 개의 작은 호스 클램프가 있습니다. 샘플 어셈블리를 스테인리스 스틸 샘플에 연결amp생물반응기의 뚜껑에 부착된 커넥터. 멸균 후 가스 배출을 위해 멸균 가스 필터가 클램프 길이 중 하나로 부착됩니다.

다른 하나는 멸균 샘플링 주사기에 연결하는 데 사용됩니다. 샘플링 어셈블리가 생물반응기에 연결되어 있는 동안 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실험을 시작하기 전에 오토클레이브합니다. 이 어셈블리를 사용하여 연속 공급 공정을 방해하지 않고 필요에 따라 바이오리액터에서 멸균 샘플을 수집할 수 있습니다.

멸균 통풍구를 스피너 플라스크 뚜껑의 적절한 위치, 매체 용기, 폐기물 용기 및 시료 포트에 부착합니다. text protocol에 설명된 대로 세포를 배양하고 수확합니다. 세포를 생물 안전성 캐비닛에서 2-3분 동안 트립신의 실온에서 배양한 다음 원뿔형 튜브에 모읍니다.

그런 다음 스몰 셀 샘플을 채취하여 트리판 블루로 염색합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 현미경과 트리판 블루 염색이 가능한 표준 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다. 각 조건에 대해 원하는 수의 총 세포를 멸균 교반 현탁 생물반응기에 추가합니다.

피펫을 사용하여 교반된 현탁 생물반응기에 배지를 추가하여 원하는 총 배양 부피에 도달합니다. 세포가 있는 교반된 현탁액 바이오리액터를 세포 배양 인큐베이터 내부의 교반 플레이트로 이동합니다. 섭씨 37도에서 3일 동안 먹이를 주지 않고 생물반응기에서 세포를 배양하며, 이산화탄소는 5%, 상대 습도는 100%, 교반 속도 70rpm으로 하여 스페로이드가 형성될 수 있도록 합니다.

스페로이드 형성 후 인큐베이터에서 교반된 현탁액 생물반응기를 제거합니다. 연속 공급 시스템용 구성 요소를 생물 안전 캐비닛에 조립합니다. 먼저 새로운 배지 저장소에 원하는 배양 배지를 채운 다음 공급 라인의 한쪽에 연결합니다.

또한 신선한 매체 저장소가 멸균 필터로 적절하게 환기되는지 확인하십시오. 생물반응기 입구 포트에서 멸균 필터를 교체하여 배지가 생물반응기로 들어가기 전에 여과해야 합니다. 폐기물 라인을 매체 폐기물 저장통에 연결하고 폐기물 저장고가 멸균 필터로 적절하게 환기되는지 확인하십시오.

교반된 현탁액 바이오리액터를 스페로이드 형성과 동일한 배양 파라미터를 사용하여 인큐베이터 내부의 교반 플레이트에 넣습니다. 신선한 중간 통을 가까운 미니 냉장고에 넣으십시오. 공급 라인이 문이 닫히는 것을 방해하지 않고 냉장고에서 나올 수 있는지 확인하십시오.

또한 공급 라인이 냉장고나 인큐베이터의 문에 의해 조여져 닫히지 않는 것이 중요합니다. 폐기물 매체 저장소는 인큐베이터 외부의 벤치 상단에 편리한 위치에 놓을 수 있습니다. 나머지 튜브 끝을 인큐베이터에 통과시키고 공급 라인을 생물 반응기의 입구 포트에있는 필터에 연결합니다.

그런 다음 폐기물 라인을 유출 튜브 포트에 연결합니다. 그런 다음 공급 및 폐기물 라인의 펌프 섹션을 펌프 헤드에 배치하여 공급 라인이 신선한 매체 저장소에서 교반 현탁 생물반응기로 매체를 펌핑하고 폐기물 라인이 생물 반응기에서 폐기물 매체 저장소로 매체를 펌핑하도록 적절한 방향을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조정된 공급 속도 방정식을 사용하여 공급 속도를 계산합니다.

성장 속도 예측 및 중간 포도당 측정과 함께 세포 수 정보가 포함된 최신 샘플을 사용하여 배양에서 원하는 포도당 농도를 유지하는 데 필요한 공급 속도를 추정합니다. 계산된 이송 속도에 따라 펌프 속도를 설정합니다. 이송 속도 계산을 반복하고 각 샘플링 포인트에 대한 펌프 속도를 조정합니다.

중간 포도당 측정은 정적 교반 현탁 생물반응기를 사용한 Beta-TC6 insulinoma 스페로이드 배양에서 표시되며, 연속적으로 공급된 교반 현탁 생물반응기 배양 방법입니다. 표준 고포도당 배지로 공급합니다. 지속적인 공급은 포도당 변동을 제거할 수 있지만 배지의 평균 포도당 수치는 배양 기간 동안 급격히 변하고 생리학적 범위를 훨씬 초과합니다.

조정된 공급은 변동을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 배양 기간 동안 포도당 농도를 생리학적 수준에 가깝게 유지할 수 있습니다. 여기서, 21일 배양 기간 동안 세포 수의 접힘 변화로 보고된 세포 성장은 규칙적인 배지 변화, 일정한 공급 속도, 교반 현탁 생물반응기 배양 및 조정된 공급 속도, 교반 현탁 생물반응기 배양을 가진 교반 현탁 생물반응기와 비교됩니다. 이 절차에 따라 새로운 세포주에 대한 영양 요구 사항 또는 특정 실험 결과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 다양한 조건 cam과 같은 다른 방법이 준비됩니다.

개발 후, 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 암이나 다른 질환을 앓고 있는 인간의 세포에서 필요한 대사 요구 사항을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양 조건을 더 잘 제어하고 세포 수율을 극대화하기 위해 풍부한 세포 배양 시스템을 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 혈액 매개 병원체로부터 보호하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.